JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Kanser Araştırmaları
0 görüntülenme • 3:18 dk. • April 30th, 2023
- İlk olarak, anestezi uygulanmış bir fareyi boynundan tutun ve gözü dışarı çıkarın. Gözün medial kantusuna ince bir kılcal tüp yerleştirin. Kanın kılcal hareketle bir tüpe akmasına izin verin. Kanı EDTA kaplı bir tüpe aktarın ve buz üzerinde tutun. EDTA, kalsiyum iyonlarını bağlayarak kanın pıhtılaşmasını önler. Daha düşük sıcaklık, hücrelerin glikolitik aktivitesini ve mikrobiyal kontaminasyon olasılığını azaltır.
Daha sonra, kanı EDTA içeren bir tamponla seyreltin ve iyice karıştırın. Kanı rahatsız etmeden, tabana dikkatlice uygun bir ayırma çözeltisi tabakası ekleyin. Süspansiyonu santrifüjleyin. Ayırma çözeltisindeki polimer, alttaki kırmızı kan hücrelerini ve tortuları toplar. Polimerden daha hafif olan mononükleer hücreler ve trombositler, polimerik gradyanın üzerinde birikir.
Plazma içeren üst tabakayı çıkarın ve mononükleer hücreler içeren opak beyaz halkayı toplayın. Artık plazma ve trombositleri çıkarmak için hücreleri PBS ve santrifüj kullanarak seyreltin. Daha fazla analiz için izole edilmiş mononükleer hücreleri kullanın. Aşağıdaki protokol, bir lösemik hücre hattı C1498 enjekte edilen konjenik bir fareden mononükleer hücrelerin izolasyonunu gösterecektir.
- Anestezi uygulanmış lösemik hayvanın gözünün medial kantusuna bir kılcal tüp yerleştirin. Orbital sinüsten kılcal boruya 100 ila 200 mikrolitre kan çekilecektir. Tüpü çıkarın ve steril bir gazlı bezin göze nazikçe uygulanmasıyla kanamayı kontrol edin. Daha sonra kanı bir EDTA tüpüne aktarın ve mononükleer hücre izolasyonu gerçekleşene kadar tüpü buz üzerinde saklayın.
Kan mononükleer hücrelerini izole etmek için, önce 500 mikrolitrelik bir son hacme kadar 1 milimolar EDTA ile desteklenmiş PBS ekleyin. Ardından, numuneyi bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Daha sonra, 30 mikrolitre ayırma solüsyonunu kanın altına dikkatlice yerleştirmek için 30 gauge iğne ile donatılmış 1 mililitrelik bir şırınga kullanın ve katmanları karıştırmamaya dikkat edin.
Hücreleri santrifüjleme ile ayırın ve opak beyaz mononükleer hücre tabakasını yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Daha sonra bağışıklık hücrelerini 1 mililitre PBS'de yıkayın. Bunları santrifüjleyin ve peleti boyama ve akış sitometrisi ile analiz için 600 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin.