Yoğunluk Gradyanlı Santrifüjleme: CLL Hücrelerini Periferik Kandan İzole Etmek İçin Bir Yöntem
JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:40 dk • April 30th, 2023
- Kronik lenfositik lösemi veya KLL hastalarında, B hücreli lenfositler kemik iliğinde ve kanda önemli ölçüde artar. Bu KLL hücrelerini bir kan örneğinden izole etmek için, önce numuneyi, negatif seçim kullanarak B hücrelerini ayıran bir insan B hücresi zenginleştirme kokteyli ile tedavi edin. Kokteyldeki antikorlar, B olmayan hücreler ve eritrositler tarafından eksprese edilen antijenleri spesifik olarak tanır ve çapraz bağlar ve yoğun kompleksler oluşturur.
Daha sonra, numuneyi lenfosit izolasyonu için en uygun yoğunluğa sahip bir yoğunluk gradyan ortamı üzerine katmanlayın. Daha sonraki santrifüjleme ile, farklı kan bileşenleri, gradyan ortamına göre yoğunluklarındaki değişikliklere bağlı olarak ayrılır. Daha yüksek yoğunluklu RBC-non-B-hücre kompleksleri, ortam boyunca çökerek bir pelet oluşturur. En az yoğun plazma fraksiyonu en üst tabakayı oluşturur. Daha az yoğun KLL hücreleri, plazma yoğunluklu ortam arayüzünde beyaz bir tabaka oluşturur.
Beyaz tabakayı dikkatlice yeni bir tüpe aktarın. Saflaştırılmış CLL hücreleri içeren bir pelet elde etmek için tekrar santrifüjleyin. Aşağıdaki protokolde, hasta kan örneklerinden kronik lenfositik lösemi hücrelerinin izolasyonunu gösteriyoruz.
- Daha önce kabul edilen kronik lenfositik lösemi hastalarından EDTA kan alma tüplerinde beyaz hücre sayımı ile birlikte periferik kan örnekleri alın.
- İnsan kan örnekleri, potansiyel olarak kan yoluyla bulaşan virüsler içerdiğinden tehlikeli olarak kabul edilmelidir. Lütfen bu numunelerin Sınıf II Biyogüvenlik Kabininde işlendiğinden ve kullanıcının her zaman laboratuvar önlüğü ve eldiven giydiğinden emin olun. Kanla kirlenmiş malzemeleri atın ve dezenfekte edin.
- Beyaz hücre sayısı mililitrede 40 milyon hücreye eşit veya daha büyükse, numuneyi RT CLL yıkama tamponu ile 1'e 1 oranında seyreltin. Ardından, RT yoğunluk gradyan ortamını numune için uygun boyutta bir konik santrifüj tüpüne alikot edin. Numuneyi dikkatlice ortamın üzerine yerleştirin ve RT'de 30 dakika boyunca 400 kez G'de santrifüjleyin.
Plastik bir pastör pipeti kullanarak, yoğunluk gradyan ortamının ve CLL yıkama tamponunun arayüzünde toplanan beyaz mononükleer hücre tabakasını nazikçe hasat edin. Bu izole edilmiş tek tabakayı 50 mililitrelik yeni bir konik santrifüj tüpüne aktarın. Hücreleri yıkamak için, bu tek tabakaya 40 mililitre CLL yıkama tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 kez G'de santrifüjleyin.
Süpernatanı atın, peleti yeniden askıya almak için tüpün altına hafifçe vurun ve bu yıkamayı tekrarlayın. Süpernatanı atın, tüpün altını tekrar hafifçe vurun ve ardından hücre peletini, peletin boyutuna bağlı olarak belirli bir hacimde CLL yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Hücreleri saydıktan ve hücre saflığını kontrol etmek için akış sitometrisinden sonra, hücreleri gerekli hücre yoğunluğunda, stimülasyona veya ilaç tedavisine hazır doku kültürü plakalarına yerleştirin.
Genel Bakış
Bu makale, hasta kan örneklerinden kronik lenfositik lösemi (KLL) hücrelerinin izole edilmesi için bir protokolü detaylandırmaktadır. Yöntem, KLL hücrelerini diğer kan bileşenlerinden ayırmak için insan B hücresi zenginleştirme kokteyli ve yoğunluk gradyanı santrifügasyonunun kullanımını içerir.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Hematoloji
- Onkoloji
- Hücre Biyolojisi
Arka Plan
- Kronik lenfositik lösemi (KLL), B hücreli lenfositlerin artışıyla karakterizedir.
- KLL hücrelerinin izolasyonu, araştırma ve tedavi geliştirme süreçleri için kritik öneme sahiptir.
- Hücre izolasyonu için standart protokoller mevcuttur, ancak KLL için spesifik adaptasyonlar gereklidir.
- İnsan kan örnekleri ile çalışırken güvenlik önlemleri temel gerekliliktir.
Çalışmanın Amacı
- Kan örneklerinden CLL hücrelerini izole etmek için ayrıntılı bir protokol sağlamak.
- İzole edilen hücrelerin sonraki araştırmalar için saflığını ve canlılığını güvence altına almak.
- İnsan kan örnekleriyle çalışırken uygulanması gereken güvenlik önlemlerini vurgulamak.
Kullanılan Yöntemler
- Kan örnekleri, negatif seleksiyon için B hücre zenginleştirme kokteyli ile işleme tabi tutulur.
- Kan bileşenlerini ayırmak için yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu uygulanır.
- Mononükleer hücreler, gradyan ortamının ara yüzeyinden toplanır.
- Hücreler, ileri analiz veya işlem için yıkanır ve yeniden süspanse edilir.
Ana Sonuçlar
- Hasta kan örneklerinden CLL hücrelerinin başarıyla izole edilmesi.
- İzole edilen hücrelerin yüksek saflığının akış sitometrisi ile doğrulanması.
- Protokolün, CLL hücrelerinin sonraki aşamalarda stimülasyonuna veya ilaç tedavisine olanak sağlaması.
- Güvenlik önlemlerinin, kan örneklerinin işlenmesiyle ilgili riskleri etkili bir şekilde azaltması.
Sonuçlar
- Tanımlanan protokol, CLL hücrelerinin izole edilmesi için etkilidir.
- Süreç sırasında güvenliğin sağlanması, laboratuvar personeli için kritik öneme sahiptir.
- Bu yöntem, CLL üzerine yapılacak ileri araştırmaları ve potansiyel tedavileri kolaylaştırabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluğu
Periferik kandan primer CLL hücrelerinin izole edilmesi, hastalıkla ilgili bir sistemde B hücresi sinyalleşmesinin ve ilaç yanıtının mekanistik çalışmalarına olanak tanır. Bu yöntem, sonraki analizler için saflaştırılmış primer hücreler sağlayarak hedef doğrulamayı ve fenotipik taramayı destekler. Karışık hücre popülasyonlarından kaynaklanan değişkenliği azaltarak, preklinik modellerdeki öngörülebilirlik güvenini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Primer CLL lenfositlerinde terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Fonksiyonel hedef doğrulama analizleri için saflaştırılmış bir hücre popülasyonu sağlar.
- Bilimsel Değer: Hasta örneklerinden hastalıkla ilişkili B hücrelerini izole ederek biyolojik risk azaltma sürecini destekler.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: Tutarlı bileşik tarama iş akışları için valide edilmiş mononükleer hücreler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Yoğunluk gradyanı arayüzünden tekrarlanabilir hücre izolasyonu ile assay standardizasyonunu sağlar.
- Bilimsel Değer: İlaç tedavisi ve stimülasyon deneyleri için güvenilir kantitatif okumalar sağlar.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Doğrudan hasta kanından izole edilen primer CLL hücrelerini kullanarak hastalıkla olan ilgiyi korur.
- Operasyonel Değer: Tutarlı hücre hazırlığı ile keşiften preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği destekler.
- Bilimsel Değer: Klinik olarak ilgili bir hücresel bağlamda hedeflerin mekanik risklerinin azaltılmasını kolaylaştırır.
İş Akışı ve Pipeline Entegrasyonu
Bu izolasyon yöntemi, primer hasta kaynaklı hücreler kullanılarak öncü bileşiklerin belirlenmesine ve preklinik değerlendirmeye olanak tanıyarak erken keşif sürecine uyum sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Primer CLL B hücrelerinde hipotez testlerini ve yolak netleştirmelerini destekler.
- Tarama: Bileşik taramaları için yüksek saflıkta ve canlılıkta, analize hazır hücreler sağlar.
- Analitik: Protein trafiği ve ilaç yanıtı gibi kantitatif bağımlı değişken ölçümlerine olanak tanır.
- Translasyonel Araştırma: İzolasyonu, hastalıkla ilgili bir sistemdeki aşağı akış stimülasyon ve tedavi çalışmalarıyla birbirine bağlar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla CLL araştırma projesinde primer lenfositleri izole etmek için yeniden kullanılabilir bir yetkinlik sağlar.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Primer hücre modellerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak öngörü güvenini artırır.
- Operasyonel Değer: Laboratuvarlar arası hücre izolasyonunda standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: Güvenilir preklinik etkinlik testlerine olanak tanıyarak devam/dur kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Saflaştırılmış primer CLL hücrelerinden elde edilen veriler aracılığıyla riskle uyumlu ilerleme kararlarını destekler.
Uygulama Hususları
- Primer insan kan örneklerinin işlenmesi ve B hücresi zenginleştirme teknikleri konusunda uzmanlık gerektirir.
- Yoğunluk gradyanlı ortamlara, santrifüjlere ve biyogüvenlik muhafaza ekipmanlarına erişim gereklidir.
- Saflık değerlendirmesi için hücre sayımı ve akış sitometrisinde ekipler arası standardizasyon gerektirir.
- Protokolün diğer lenfosit izolasyonu bağlamlarına uygulanması sırasında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Örnek değişkenliği ve toplama sonrası zamanında işlem yapma gerekliliği gibi pratik kısıtlamaları kapsar.
Biyofarma SSS
Enzimatik Digest ve Gradient Ayırma kullanma Fare Skin gelen sızan lökositlerin İzolasyonu
İlgili videolar
0 Görüntüler
Karakterizasyonu ve yoğunluk Gradient Santrifüjü tarafından fare birincil Microglia izolasyonu
İlgili videolar
0 Görüntüler
Sperm yoğunluğu degrade Santrifüjü kullanarak fark kalitesini topluluğu
İlgili videolar
0 Görüntüler
İnsan Bağışıklık Sistemi Fareleri Oluşturmak için Kordon Kanı Hematopoetik Kök Hücrelerinin İzole Edilmesi
İlgili videolar
0 Görüntüler
Nötrofil İzolasyon ve Analiz Terapötik Ajanların için Lenfoma Hücre Duyarlılık kendi Rolü belirleme
İlgili videolar
0 Görüntüler
Birincil Akut lenfoblastik lösemi hücreleri hazırlanmasında farklı hücre döngüsü aşamaları santrifüj Elutriation tarafından
İlgili videolar
0 Görüntüler
Roman NFAT2 hedef genleri kronik lenfositik lösemi olarak tanımlamak için bir kromatin Immunoprecipitation tahlil
İlgili videolar
0 Görüntüler
CD4 yalıtım+ T-hücreleri ve T foliküler Yardımcısı (cTfh) hücre alt kümeleri üzerinden periferik kan kullanarak 6-renk Akış Sitometresi Analizi, dolaşan
İlgili videolar
0 Görüntüler
Nükleer/Sitoplazmik Protein Ticaretini İzlemek Için Primer Kronik Lenfositik Lösemi Hücrelerinin Subsellüler Fraksiyonları
İlgili videolar
0 Görüntüler
İnsan Nötrofillerinin Tam Kan ve Buffy Coats'tan İzolasyonu
İlgili videolar
0 Görüntüler
Son güncelleme: 29 Ağustos 2026