JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 4:25 dk • April 30th, 2023
- Lösemik hücrelerde, çekirdek ve sitoplazma arasındaki birkaç tümör baskılayıcı protein gibi makromoleküllerin geçişi deregüle edilir. Bu proteinlerin yanlış lokalizasyonu onları inaktif hale getirir ve lösemik hücrelerin kontrolsüz büyümesine neden olur. Lösemik hücrelerden sitoplazmik ve nükleer fraksiyonu üreterek bu tür proteinlerin anormal konumunu belirleyebiliriz.
İstenilen hacimde lösemik hücreleri bir mikrofüj tüpüne alarak başlayın ve hücreyi peletlemek için santrifüjleyin. Peleti hipotonik bir lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve ardından istenen konsantrasyonda deterjan ekleyin. Hipotonik lizis tamponu, hücrelerin şişmesine ve plazma zarını kırmasına neden olur, bu da nükleer zarı sağlam bırakır, böylece sitoplazmik fraksiyonları izole eder. Deterjan, sitoplazmik organellerden proteinlerin ekstraksiyonuna yardımcı olur.
Parçalanmış hücreleri süspansiyon halinde santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. Süpernatant, hücrenin sitoplazmik fraksiyonunu içerir. Nükleer fraksiyonu hazırlamak için, kalan peleti tam lizis tamponunda tekrar süspanse edin ve deterjan ekleyin. Süpernatantta bulunan nükleer fraksiyonu santrifüjleyin ve bir mikrofüj tüpüne toplayın. Daha fazla analiz için sitoplazmik ve nükleer fraksiyonları eksi 80 santigrat derecede saklayın. Aşağıdaki protokolde, lösemik hücrelerden hücre altı fraksiyonların oluşumunu göstereceğiz.
Stimülasyon ve/veya ilaç tedavisi inkübasyonu tamamlandıktan sonra, hücrelerin ayrı ayrı etiketlenmiş 1.5 mililitrelik mikrofüj tüplerine ve peletlere aktarılması ve 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjlenerek pelet. Süpernatanı attıktan sonra, hücre peletini fosfataz inhibitörleri ile 1 mililitre buz gibi soğuk PBS'de yeniden süspanse edin. 4 santigrat derecede 5 dakika boyunca 200 kez g'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve daha fazla hazırlık için bu tüm hücre özü peletlerini buz üzerinde tutun.
Sitoplazmik fraksiyonları hazırlamak için, hücre peletlerini 50 mikrolitre 1 X hipotonik tampon içinde nazikçe yeniden süspanse edin. Hücrelerin şişmesine izin vermek için, onları 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Belirli bir hücre tipi için kullanılacak en uygun deterjan konsantrasyonunu belirlemek için bir deterjan gradyanı gerçekleştirdikten sonra, her numuneye 0,8 ila 2,5 mikrolitre deterjan ekleyin ve en yüksek ayarda 10 saniye boyunca girdap yapın.
Hücre lizizini doğrulamak için, deterjan ilavesinden önce ve sonra hücreleri bir faz kontrast mikroskobu altında gözlemleyin. Tüm hücreler, parlak bir hale olarak görünen sitoplazma ile çevrili yoğun bir karanlık çekirdeğe sahiptir. Parçalandıktan sonra, numuneleri 4 santigrat derecede 30 saniye boyunca 14.000 kez g'de santrifüjleyin. Dikkatlice, peleti bozmadan, süpernatanı önceden soğutulmuş, etiketlenmiş bir mikrofüj tüpüne aktarın ve bu sitoplazmik fraksiyonu daha fazla analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.
Nükleer fraksiyonun kirlenmesini önlemek için sitoplazmik fraksiyonun tamamen çıkarıldığından emin olun.
Nükleer fraksiyonu içeren kalan pelete 50 mikrolitre tam lizis tamponu ekleyin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Nükleer zarla ilişkili proteinleri çözündürmek için 2,5 mikrolitre deterjan ekleyin, en yüksek ayarda 10 saniye girdap yapın ve 30 dakika buz üzerinde inkübe edin. 30 saniye boyunca en yüksek ayarda girdap ve santrifüj. Daha sonra, süpernatanı önceden soğutulmuş, etiketlenmiş bir mikrofüj tüpüne aktarın ve bu nükleer fraksiyonu daha fazla analize kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.