Hücre Dışı Akı Deneyi: Hücrelerin Metabolik Profilini Ölçmek İçin Bir Yöntem

- Hücre dışı akı testi, glikoliz ve mitokondriyal solunum olmak üzere iki ana enerji yolunu ölçerek hücre metabolizmasının incelenmesine yardımcı olur. Glikoliz sırasında, hücreler glikozu metabolize eder ve Hücre Dışı Asitleşme Hızı veya ECAR ölçülerek belirlenen protonlarla birlikte hücre dışı boşluğa laktat salgılar. Mitokondriyal solunum sırasında hücreler, Oksijen Tüketim Oranı veya OCR belirlenerek ölçülen ATP üretimi için oksijen kullanır.

Kanser hücreleri, düzensiz hücresel proliferasyona uyum sağlamak ve sürdürmek için metabolik hızlarını değiştirdikleri için yüksek glikoz alımı sergilerler. Kanser hücrelerinde metabolizmayı analiz etmek için, önce yapışık kanser hücresi tek tabakası ve hidratlı bir sensör kartuşu içeren bir akı analizi mikroplakasını birleştirin. Plaka tertibatını bir akı analizörüne aktarın. Analizör içinde, sensör probları geçici bir mikro oda oluşturmak için alçalır. Hücre dışı akıyı ölçmek için, enjeksiyon portu, önceden ayarlanmış zaman noktalarında mikroplakaya test bileşiklerini sokar.

Hücre metabolizmasına bağlı olarak, mikro odada bulunan oksijen ve salınan proton konsantrasyonları dalgalanır. Kartuşun tabanına gömülü iki florofor, sırasıyla mitokondriyal solunum ve glikolizin göstergesi olan oksijen ve proton seviyelerini aynı anda algılar ve ölçer. Aşağıdaki protokolde, primer lösemik hücrelerin metabolik aktivitesini ölçmek için bir hücre dışı akı testi göstereceğiz.

- Bu arada, plakaları hücre dışı akı analizine hazırlamak için, iki adet 8 oyuklu hücre dışı akı analizörü plakasının her bir oyuğuna 12,5 mikrolitre hücre yapıştırıcı solüsyonu ekleyin. 20 dakika sonra, hücre yapıştırıcısını aspire edin ve her bir kuyucuğu yıkama başına 200 mikrolitre steril su ile iki kez yıkayın.

İkinci yıkamadan sonra, kuyucuklar kuruyana kadar plakaları davlumbazda bırakın ve sensör kartuşunu laboratuvar tezgahının üzerine baş aşağı yerleştirin. Akı analizörünün yardımcı plakasını ve sensör kartuşunu ayırın ve yardımcı plakanın her bir kuyusunu 200 mikrolitre kalibrant ile doldurun ve kuyuların dışındaki her bir hendeği 400 mikrolitre kalibrant ile doldurun.

Sensör kartuşunu şimdi kalibrantı içeren yardımcı plakaya geri koyun ve kartuş tertibatını gece boyunca CO2 içermeyen nemlendirilmiş, 37 santigrat derece bir inkübatöre yerleştirin. Ardından hücre dışı akı analizörünü açın ve gece boyunca 37 santigrat dereceye kadar ısınmasına izin verin.

Ertesi sabah, hücreleri şişeden santrifüjleme için 50 mililitrelik konik tüplere aktarın ve peletleri sayım için uygun deney ortamının 1 mililitresinde yeniden süspanse edin. Hücreleri 400 mikrolitre deneysel ortam konsantrasyonunda 4 kez 10 ila 6 hücrede yeniden süspanse edin ve 50 mikrolitre hücreyi akı analizörü plakasının B ila G kuyularına ve 180 mikrolitre deney ortamının 180 mikrolitresini arka plan kontrol kuyuları olarak A ve H kuyularına ekleyin.

Santrifüjlemeden sonra, yavaş ve dikkatli bir şekilde 130 mikrolitre deney ortamının B'den G'ye kadar olan kuyulara ekleyin ve hücrelerin mikroskop altında her bir oyuğun dibine stabil bir şekilde yapıştığını görsel olarak doğrulayın. Ardından akı analiz plakasını 30 dakika boyunca CO2 içermeyen nemlendirilmiş, 37 santigrat derece inkübatöre geri koyun.

İnkübasyonun bitiminden 20 dakika önce, bileşikleri tabloda belirtildiği gibi deney protokolüne göre kartuşun uygun enjektör portlarına yükleyin. Ardından uygun hücre dışı akı analiz programını kurun. Programı başlatın ve istendiğinde kalibant plakasını tahlil plakasıyla değiştirin.