JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 3:57 dk • April 30th, 2023
- Bir lenfosit sınıfı olan T hücreleri, enfeksiyonla mücadelede aktif rol oynar. Diğer birçok kan hücresi tipinin yanı sıra, immünokompetan T hücreleri fare dalağında ve lenf düğümlerinde bulunur. T hücrelerini seçici olarak izole etmek için, murin dalağı ve lenf düğümlerini toplayın ve bunları bir hücre süzgeci üzerinde yumuşatın. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için dokuyu uygun bir ortamla yıkayın.
Kırmızı kan hücrelerini parçalamak için amonyum-klorür potasyum veya ACK tamponu ekleyin. Sağlam kan hücrelerini lizattan ayırmak için santrifüjleyin. Süpernatanı atın ve hücreleri uygun bir tamponda yeniden süspanse edin. Süspansiyonu, granülositler, B hücreleri, NK hücreleri ve kalan eritrositler gibi kan hücrelerini hedeflemek için biyotinile antifare antikorlarının bir karışımı ile tedavi edin. T hücreleri hedeflenmemiştir ve bu nedenle etiketlenmemiş olarak kalır.
Ardından, süspansiyona anti-biyotin manyetik mikro boncuklar ekleyin. Tüm biyotin etiketli hücreler mikro boncuklara bağlanır. Güçlü bir manyetik alanın etkisi altında tutulduğunda, manyetik olarak etiketlenmiş hücreler tüp duvarına yapışır. Etiketlenmemiş T hücreleri süspansiyon halinde kalır. Bağlanmamış zenginleştirilmiş T hücrelerini yeni bir toplama tüpüne toplayın. Aşağıdaki protokolde, manyetik bir ayırma tekniği kullanarak T hücrelerinin fare dalağı ve lenf düğümlerinden izolasyonunu gösteriyoruz.
- Lenf düğümlerini ve dalağı 40 mikrometrelik bir gözenek süzgecinde toplayın ve hücreleri serbest bırakmak için dokuları filtrelerden yumuşatmak için bir şırınga pistonu kullanın. Tüm hücreleri toplamak ve hücreleri santrifüjleme ile çökeltmek için süzgeci ve pistonu %1 FBS ile desteklenmiş RPMI ortamı ile yıkayın. Hücre peletine 5 mililitre ACK lizis tamponu ekleyin.
Oda sıcaklığında beş dakika sonra,% 1 FBS ile desteklenmiş 5 mililitre ortam ile reaksiyonu durdurun ve beyaz kan hücrelerini santrifüjleme ile peletleyin. Peletleri saymak için 5 mililitre MACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri taze MACS tamponunda mikrolitre başına 2 kez 10 ila 8 hücre konsantrasyonuna seyreltin. 4 santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyon için 6 hücreye 1 kez 10'da uygun konsantrasyonda anti-eritroid, anti-granülosit, anti-B-hücre ve anti-NK hücre tükenme antikorları ekleyin.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri 10 milimetre buz gibi soğuk MACS tamponu ile yıkayın ve peleti taze MACS tamponunda mililitre başına 1 kez 10 ila 8 hücre konsantrasyonunda yeniden süspanse edin. Daha sonra, 4 santigrat derecede 15 dakikalık bir inkübasyon için karıştırarak 6 hücreye 1 kez 10'da 0.22 mikrolitre anti-biyotin mikro boncuk ekleyin.
İnkübasyonun sonunda, hücreleri 10 mililitre buz gibi soğuk MACS tamponu ile yıkayın ve standart boncuk izolasyon protokollerine göre MACS ekspres ayırıcı kullanarak manyetik boncuk ayırma ile bağlanmamış zenginleştirilmiş T hücrelerini toplayın. Ayırma işleminin sonunda, T hücrelerini santrifüjleme ile çökeltin ve peleti sayım için 5 mililitre taze MACS tamponunda yeniden süspanse edin.