Kemik İliği Kaynaklı Dendritik Hücreler Üretimi: Fare Kemik İliğinden Dendritik Hücreler Üretme Yöntemi

- Dendritik hücreler veya DC'ler, T hücrelerini aktive eden anahtar antijen sunan hücrelerdir. Lösemik hastalarda, bu hücreler tümörle ilişkili antijeni zayıf bir şekilde eksprese eder ve antijene özgü bir immün yanıt ortaya çıkaramaz. Dendritik hücreler kemik iliğinde bol miktarda bulunur. Ve bu nedenle, kemik iliği, kanserdeki rollerini incelemeye yardımcı olmak için izolasyonları için tercih edilen bölgedir.

Dendritik hücreler elde etmek için, ötenazi yapılmış bir farenin uyluk kemiğinden veya tibia kemiğinden, temizlemek için medya dolu bir şırınga kullanarak kemik iliğini çıkarın. Eritrositleri parçalamak için peleti amonyum-klorür-potasyum veya ACK tamponunda santrifüjleyin ve yeniden süspanse edin. Şimdi lizis ve santrifüjü durdurmak için kültür ortamı ekleyin. Pelet, bir antibiyotik içeren kültür ortamında yeniden süspanse edilir. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör veya GM-CSF ekleyin ve hücre süspansiyonunu bir Petri plakasına aktarın.

Plakayı istenen süre boyunca inkübe edin. GM-CSF, progenitör hücrelerin dendritik hücrelere farklılaşmasına yardımcı olur. Son olarak, hücreleri, dendritik hücrelerin yüzey reseptörüne bağlanan lipopolisakkaritler veya LPS ile aktive edin, bu da tamamen olgun ve immünojenik kemik iliği dendritik hücrelerle sonuçlanır. Bu protokolde, fare kemik iliğinden dendritik hücrelerin oluşumunu göstereceğiz.

- Kemik iliğinden türetilmiş dendritik hücreler oluşturmak için, gösterildiği gibi kemik iliğini vahşi tip veya Faktör B nakavt farelerinin femurlarından izole edin ve kırmızı kan hücrelerini 5 mililitre ACK lizis tamponunda parçalayın, reaksiyonu 10 mililitre RPMI ile durdurun, beş dakika sonra% 1 FBS ile desteklenir.

Tam kan hücrelerini santrifüjleme ile topladıktan sonra, peleti 10 mililitre kültür ortamında mililitre konsantrasyonunda 2 kez 10 ila 6 hücreye yeniden süspanse edin ve hücrelere mililitre başına 20 nanogram GM-CSF ekleyin, 10 mililitre hücreyi altı gün boyunca% 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte 100 x 15 milimetre Petri kaplarına ekin. Altıncı günde, kemik iliği kaynaklı dendritik hücre kültürlerini plaka başına mililitre LPS başına 25 mikrogram ile aktive edin.