Kromatin kesme: Enzimatik sindirim kullanarak kromatin parçaları oluşturmak için bir yöntem

- Transkripsiyon faktörleri, gen ekspresyonunu düzenlemek için DNA üzerindeki belirli bir bölgeye bağlanan proteinlerdir. Transkripsiyon faktörlerindeki hatalar bu aktiviteyi değiştirerek genlerin aşırı ekspresyonuna yol açar ve bu da kansere neden olur. Transkripsiyon faktörlerinin ve gen regülasyonunun rolünü anlamak için kromatin immünopresipitasyon testi veya CHIP gerçekleştirebiliriz ve kromatin kesme, CHIP iş akışında önemli bir adımdır.

Kromatin kesme için, formaldehit ekleyerek DNA-protein kompleksini stabilize edin. Formaldehit, kovalent bağlar oluşturarak proteinleri ilişkili DNA dizisine çapraz bağlar. Daha sonra, çapraz bağlı DNA-protein kompleksleri ve santrifüj içeren kromatini serbest bırakmak için hücreleri parçalamak için uygun bir lizis tamponu kullanın. Mikrokokal nükleaz enzimi kullanarak kromatini kesin. Bu enzim, nükleozomlar arasındaki kromatini parçalar ve gevşek DNA uçlarını sindirir. Karışımı santrifüjleyin ve süpernatanı toplayın.

DNA fragmanlarının uygun boyutunu analiz etmek için süpernatanı TBE agaroz jel üzerine yükleyin. Jel boyunca, negatif yüklü kromatin DNA'sının anoda doğru hareket etmesine neden olan bir elektrik alanı uygulayın. Daha küçük parçalar jelin aşağısına doğru hareket eder. Kesilmiş kromatin, jelde bir leke olarak görünür. Aşağıdaki protokolde, sonikasyon kullanarak kronik miyeloid lösemi hücre hattının kromatinini keseceğiz.

- Başlamak için 1,5 milimetrelik bir tüpü 1 mililitre% 37 formaldehit ile doldurun. Daha sonra, 1.5 mililitrelik başka bir tüpü 1 mililitre 1.25 molar glisin ve 5 mililitrelik bir tüpü 4 mililitre PBS ile doldurun. Daha sonra, hücrelerin uyarılmasından sonra, hücreleri metin protokolüne göre döndürün ve hücreleri 500 mikrolitre PBS'de yeniden askıya alın ve tüpü buz dolu bir kutuya yerleştirin. Hücrelere %13,5 mikrolitre %37 formaldehit ekleyin ve yukarı aşağı pipetleyerek karıştırın.

Ardından, süspansiyonu oda sıcaklığında inkübe edin. Bundan sonra, fiksasyonu durdurmak için 57 mikrolitre 1.25 molar glisin ekleyin ve bu süspansiyonun oda sıcaklığında beş dakika inkübe etmesine izin verin. Kuluçka süresinin hemen ardından, hücreleri buzun üzerine yerleştirin ve hücreleri 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüjleyin. Sonra süpernatanı aspire edin. Daha sonra, hücreleri 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 200 kez g'de 1 mililitre buz gibi soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve süpernatanı çıkarın. Hücre peletini 5 mililitre lizis tamponu-1'de yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.

Daha sonra numuneleri buzun üzerine koyun ve 10 dakika çalkalayarak inkübe edin. Bundan sonra, tüpleri 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez g'de santrifüjleyin. Ardından, süpernatanı dikkatlice çıkarmak için pipeti kullanın. Hücreleri 5 mililitre lizis tamponu-2'de homojenize edin ve karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra hücreleri çalkalayarak 10 dakika buz üzerinde inkübe edin. Kuluçka süresinden sonra, tüpleri 4 santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez g santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice çıkarın.

Daha sonra, hücre peletini 1X proteaz inhibitörü ile kesme tamponu-1'de yeniden askıya alın. Ardından, hücre süspansiyonunu 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. 140 mikrolitre hücre süspansiyonunu sonikatör tüplerine aktarın ve hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat edin. Tüpleri 7 santigrat derecede odaklanmış bir ultrasonikatöre yerleştirin ve on ila yedi buçuk dakika boyunca kesin. Hücre süspansiyonunu 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Numuneleri 4 santigrat derecede 10 dakika boyunca 15.700 kez g'de santrifüjleyin ve süpernatanı yeni bir tüpte toplayın.