JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 6:29 dk • April 30th, 2023
- Kromatin immünopresipitasyon veya ChIP, hücrelerdeki protein-DNA etkileşimlerini belirlemek için kullanılan bir tekniktir. Proteinler DNA üzerindeki belirli bölgelere bağlanır ve gen ekspresyonunu düzenler. İlk olarak, DNA-protein kompleksini formaldehit ile stabilize edin. Formaldehit, kovalent bağlar oluşturarak proteinleri ilişkili DNA dizisine çapraz bağlar.
Daha sonra, çapraz bağlı DNA-protein komplekslerini içeren kromatini serbest bırakmak için hücreleri parçalamak için uygun bir lizis tamponu kullanın. Süspansiyonu santrifüjleyin ve kromatin parçaları elde etmek için süpernatanı sonikleştirin. Daha sonra, numuneyi spesifik olarak DNA'ya bağlı proteine bağlanan uygun bir antikorla etiketleyin.
Numuneye özel manyetik boncuklar ekleyin. Boncuk antikoru tanır ve ona bağlanır. Antikor-protein-DNA kompleksi ile manyetik boncukları toplamak için bir mıknatıs kullanın. Bağlanmamış kromatin veya antikorları çıkarmak için numuneyi yıkayın. Komplekse yüksek tuz konsantrasyonlu bir tampon ekleyin ve DNA proteini çapraz bağlarını tersine çevirmek için daha yüksek sıcaklıklarda inkübe edin.
Bir mıknatıs kullanarak, DNA ve proteinleri içeren süpernatanı toplayın. Numunedeki proteinleri parçalamak için proteinaz K enzimi ekleyin. DNA'yı çökeltmek için uygun bir tampon ekleyin ve daha fazla analiz için kullanın. Aşağıdaki protokol, NFAT2 hedef genlerini tanımlamak için kronik lenfositik lösemi hücrelerinde kromatin immünopresipitasyonunu gösterecektir.
- İlk olarak, 1,5 mililitrelik bir tüpte her çökeltme için 20 mikrolitre protein A kaplı boncuk hazırlayın. Boncukların bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleşmesine izin verin ve süpernatanı çıkarın. Daha sonra boncukları her 20 mikrolitre protein A kaplı boncuk için 40 mikrolitre 1x ChIP tampon 1 ile yukarı ve aşağı pipetleyerek yıkayın.
Boncukların bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleşmesine izin verin ve süpernatanı çıkarın. Boncukları orijinal 1x ChIP tamponu 1 hacminde yeniden askıya almadan önce bu yıkama işlemini üç kez daha tekrarlayın. Boncuklara BSA, proteaz inhibitörü, 5x ChIP tamponu ve ChIP-seq dereceli su ekleyin. Ardından, kesilmiş kromatini ekleyin.
Kontrol olarak NFAT2 ve 2.5 mikrogram IgG antikorunu yakalamak için 10 mikrogram anti-NFAT2 antikoru kullanın. Karışımları gece boyunca 4 santigrat derecede altı RPM'de dönen bir tekerlek üzerinde inkübe edin. Ertesi gün, tüpleri 7.000 kez g'de beş saniye döndürün ve manyetik rafta bir dakika inkübe edin.
Ardından, süpernatanı aspire edin ve boncukları art arda 1, 2, 3 ve 4 yıkama tamponları ile bir kez yıkayın. Tüpleri manyetik rafta bir dakika inkübe etmeden önce tüpleri 7.000 kez g'de beş saniye döndürün. Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve bir sonraki yıkama tamponunu ekleyin.
Son yıkamadan sonra, tüpleri 7.000 kez g'de beş saniye döndürün. Tüpleri manyetik rafta bir dakika inkübe edin. Süpernatanı çıkarın ve boncukları 100 mikrolitre elüsyon tamponu 1 içine alın. Ardından, tüpleri dönen tekerlek üzerinde 30 dakika inkübe edin.
Ardından, tüpleri kısaca döndürün ve bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Süpernatanı yeni bir 1.5 mililitrelik tüpe aktarın ve 4 mikrolitre elüsyon tamponu 2 ekleyin. Giriş kontrolünü oluşturmak için, 1 mikrolitre kesilmiş kromatini 99 mikrolitre elüsyon tamponu bir ve 4 mikrolitre elüsyon tamponu iki ile karıştırın. Daha sonra numuneleri çalkalayarak 65 santigrat derecede dört saat inkübe edin.
Bundan sonra, tüplere 100 mikrolitre% 100 izopropanol ekleyin. Numuneleri girdaplayın ve 7.000 kez g'de beş saniye döndürün. Daha sonra her numuneye 10 mikrolitre manyetik boncuk ekleyin. Numuneleri vorteksleyin ve oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde bir saat inkübe edin.
Ardından, tüpleri kısa bir süre döndürün ve bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Süpernatanı aspire edin ve boncukları 100 mikrolitre yıkama tamponunda yeniden süspanse edin. Tüpleri karıştırmak için ters çevirin ve oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde beş dakika inkübe edin. Daha sonra tüpleri kısaca santrifüjleyin. Bunları bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin ve süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın.
Ardından, 100 mikrolitre yıkama tamponu iki ekleyin. Karıştırmak için tüpleri ters çevirin ve oda sıcaklığında dönen bir tekerlek üzerinde beş dakika inkübe edin. Bundan sonra, tüpleri kısaca santrifüjleyin ve bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Yıkama tamponunu iki aspirasyon yoluyla çıkarın ve boncukları 55 mikrolitre elüsyon tamponunda yeniden süspanse edin.
Çökelmiş DNA'yı elüte etmek için, numuneleri oda sıcaklığında dönen bir tekerlek içinde 15 dakika inkübe edin. Bundan sonra, tüpleri kısa bir süre döndürün ve bir dakika boyunca manyetik bir rafa yerleştirin. Son olarak, süpernatanı yeni 1,5 mililitrelik tüplere aktarın.