JoVE Encyclopedia of Experiments
Kanser Araştırmaları
0 görüntüleme • 5:21 dk • April 30th, 2023
- Hematopoetik kök ve progenitör hücre veya HSPC, kendi kendini yenileyebilir ve çeşitli kan hücresi tiplerine farklılaşabilir. HSPC'ler, bir ömür boyu yavaş yavaş DNA mutasyonları biriktirir ve bu da lösemiye katkıda bulunabilir. Bu tür mutasyonları analiz etmek için, HSPC'ler genellikle kemik iliğinden üretilir.
Mononükleer hücrelere (kemik iliğinden izole edilen yetişkin kök hücreler) florofor konjuge antikorlar ekleyerek ve bunları istenen süre boyunca inkübe ederek başlayın. Antikorlar, CD34 gibi spesifik hücre yüzeyi belirteçlerine bağlanır. Şimdi, karışımı floresanla aktive edilen hücre sitometrisine veya FACS makinesine yükleyin.
Florofor konjuge antikorlar, lazer tarafından vurulduğunda floresan verir. Bireysel hücre damlacıkları, damlanın bir elektrik yüküne sahip olduğu floresan yoğunluğunu ölçen dedektörden geçer. Elektromanyetik alanların varlığında, pozitif yüklü hücreler negatif kaba hareket eder ve bunun tersi de geçerlidir.
Şimdi, FACS tarafından sıralanmış CD34 pozitif HSPC'leri, klonlar görünene kadar istenen süre boyunca uygun bir ortamda büyütün. Ardından, hücreleri peletlemek için kuvvetli pipetleme ve santrifüjleme ile klonları yerinden çıkarın. Daha fazla analiz için klonal HSPC'ler içeren peleti eksi 20 santigrat derecede saklayın. Aşağıdaki protokolde, mononükleer hücrelerden HSPC klonları üreteceğiz.
- Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı gibi numune materyalinin hazırlanması ve boyama ile başlayın. Daha sonra, 25 mililitre hematopoietik kök ve progenitör hücre veya HSPC, kültür ortamı hazırlayın. 384 oyuklu bir hücre kültürü plakasını her oyukta 75 mikrolitre HSPC kültür ortamı ile doldurun. Dış kuyucuklardaki ortamın buharlaşmasını önlemek için, dış kuyuları 75 mikrolitre steril su veya PBS ile doldurun ve bu kuyuları hücre ayıklama için kullanmayın.
Uygulanabilir sinyal HSPC'lerinin doğru sıralanması, bu protokoldeki en kritik adımdır. Leke örneğinden 10.000 hücrede lekelenmemiş bir kontrole dayalı olarak HSPC sıralaması için kapıları ayarlayın. Doğrusal ileri saçılma yüksekliğinin etrafına bir geçit çizerek ve ileri saçılma alanı fraksiyonuna karşı tek hücreleri geçitleyin.
Köken fraksiyonu için bir geçit çizmek için boyanmamış kontrol fraksiyonunu kullanın. CD34 pozitif hücreler için kapılar çizin ve CD38 negatif, CD45RA negatif hücreler için özel bir kapı ayarlayarak bu alt kümeyi daha fazla karakterize edin. 384 oyuklu plakayı FACS makinesine yükleyin ve tek hücreleri sıralayın. FACS makinesi için geçerliyse, sıralanan hücrelerin yeniden izlenmesini etkinleştirmek için dizin sıralama verilerini tutma seçeneğini açın.
Tek tek sıralanmış HSC'leri kültürlemek için, 384 oyuklu kültür plakasını kapaklı şeffaf polietilen sargıya sarın. 384 oyuklu plakayı% 5 karbondioksit içeren nemlendirilmiş 37 santigrat derece inkübatöre aktarın ve görünür klonlar görünene kadar üç ila dört hafta inkübatörde tutun. Dört haftalık kültürlemeden sonra, hangi kuyuların% 30 veya daha yüksek bir birleşmeye sahip olduğunu belirleyin.
Her klon için, PBS'de 1,5 milimetre mikrotüpleri 1 mililitre% 1 BSA ile önceden doldurun ve tüpü ilgili kuyucuğa göre etiketleyin. Pipet ucuna yapışan hücre sayısını en aza indirmek için pipet ucunu PBS'de %1 BSA ile önceden ıslatın. 75 mikrolitreye ayarlanmış 200 mikrolitrelik bir pipetle kuyunun dibini kazırken ortamı en az beş kez yukarı ve aşağı şiddetle pipetleyin.
Hücre süspansiyonunu, kuyuya karşılık gelen etiketli mikrotüpte toplayın. Maksimum hücre alımını sağlamak için 75 mikrolitreye kadar taze %1 BSA ve PBS ile kuyuda pipetlemeyi tekrarlayın. Klonal olarak kültürlenmiş hücreler bir kuyunun dibine yapışabilir. Tüm hücrelerin toplanıp toplanmadığından emin olmak için standart bir ters çevrilmiş ışık mikroskobu kullanarak kuyuları inceleyin.
% 30'dan fazla birleşme oranına sahip tüm kuyucuklar hasat edilmişse, 384 oyuklu plakayı inkübatöre geri yerleştirin. Klonal kültürler beş haftaya kadar çoğalabilir. Hücre süspansiyonunu 350 kez g'de beş dakika aşağı döndürün. Küçük bir pelet görünür olmalıdır. Süpernatantın yaklaşık beş mikrolitresi hariç hepsini dikkatlice çıkarın. Hücre peletleri eksi 20 santigrat derecede dondurulabilir ve DNA izolasyonundan önce birkaç ay saklanabilir.