Manyetik Olarak Aktive Edilmiş Hücre Sıralama: c-Kit Pozitif Hücreleri İzole Etmek İçin Bir Yöntem

- c-Kit veya CD117, kemik iliği ve kanda bulunan hematopoietik kök veya progenitör hücreler tarafından eksprese edilen bir tirozin kinaz transmembran reseptörüdür. Aynı zamanda akut miyeloid lösemiyi tespit etmek için bir belirteçtir.

C-Kit pozitif hücreleri izole etmek için, murin bacak kemiklerini toplayın ve iliği içeriden serbest bırakmak için ezin. Herhangi bir kemik parçasını çıkarmak için kemik iliği süspansiyonunu süzün. Kemik iliği hücreleri içeren süzüntüyü bir yoğunluk gradyan ortamı üzerine yerleştirin ve mononükleer hücreleri diğer fraksiyonlardan ayırmak için santrifüjleyin.

Mononükleer hücrelerin bulanık katmanını, anti-CD117 fare antikorlarına konjuge edilmiş mikro boncuklar içeren bir tüpte toplayın. Antikor-boncuk komplekslerinin c-Kit pozitif hücreler üzerindeki CD117 reseptörlerine bağlanması için inkübe edin. İnkübe edilmiş süspansiyonu manyetik bir alana yerleştirilmiş manyetik bir sütundan geçirin. Manyetik mikro boncuklarla etiketlenmiş tüm c-Kit pozitif hücreler sütunda kalırken, etiketlenmemiş hücreler geçer.

Sütunu manyetik alandan çıkarın ve c-Kit pozitif hücreleri elüte etmek için uygun bir tampon kullanarak içindekileri yıkayın. Aşağıdaki protokolde, transgenik bir farenin kemik iliğinden c-Kit pozitif hücrelerin izolasyonunu göstereceğiz.

- Başlamak için, ötenazi uygulanmış bir fareden bacak kemiklerini toplayın. Kemiklerdeki dokuları bir neşter ile temizleyin. Daha sonra kemikleri buz üzerine soğuk PBS'ye yerleştirin ve kemikleri bir havaneli ile ezin. Bundan sonra, hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik bir hücre süzgecinden 10 mililitrelik bir pipet ile 50 mililitrelik vidalı kapaklı bir tüpe süzün. Harcı ve havaneli soğuk PBS ile defalarca yıkayın ve hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik tüpe ekleyin.

Daha sonra, kemik iliğini santrifüjleyin ve süpernatanı vakum ve cam pipetle çıkarın. Hücre peletini beş mililitre PBS'de yeniden süspanse edin. Bir pipet kullanarak, asılı kemik iliğini yavaşça oda sıcaklığındaki polisikarozun üstüne ekleyin.

Bundan sonra, polisakarozu fren kapalıyken 20 dakika boyunca 400 G'de döndürün. Setrifugasyondan sonra, bulanık toplam mononükleer hücre arayüzünü bir pipetle toplayın ve 15 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. PBS ile hacmi 10 mililitreye getirin ve saymak için 20 mikrolitreyi çıkarın.

Cetrifugation'dan sonra, süpernatanı atın ve peleti buzun üzerine yerleştirin. Sonraki, EDTA ve BSA ile PBS'deki hücre peletini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonuna CD117 mikro boncukları ekleyin ve karıştırmak için girdap yapın. Bundan sonra, süspansiyonu 4 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Ardından, EDTA ve BSA ile daha fazla PBS ile hacmi 10 mililitreye getirin ve beş dakika boyunca 4 santigrat derecede 1.200 G'de santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarmak ve hücre peletini EDTA ve BSA ile PBS'de askıya almak için vakumu kullanın. Ardından, manyetik sütunlu bir mıknatıs standına EDTA ve BSA ile üç mililitre PBS ekleyin ve bir toplama tüpüne akmasına izin verin. Tamponun kolondan akması bittikten sonra, hücre süspansiyonunu ekleyin ve kolondan toplama tüpüne akmasına izin verin.

Ardından, kolona EDTA ve BSA ile 5 mililitre daha PBS ekleyin ve hemen pistonla yıkayın. Pistonu çıkarın ve hücreleri saymadan önce yıkamayı tekrarlayın. Hücreleri santrifüjledikten sonra, süpernatanı çıkarın ve hücre peletini kültür için tam IMDM'de askıya alın. Hücreleri gece boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kültürleyin.