Retroviral Aracılı Transdüksiyon: Hedef Geni Kanser Hücrelerine Sokmak İçin Bir Yöntem

- Retrovirüsler, RNA genomlarını çift sarmallı DNA'ya dönüştürmek ve konakçı genomuna kalıcı olarak entegre olmak için ters transkriptaz kullanarak çoğalan RNA virüsleridir. Yeni viral parçacıklar hücreden çıkar ve diğer hücreleri enfekte edebilir. Kanser gen terapisi, mutasyona uğramış geni aşağı regüle etmek veya hücreleri ortadan kaldırmak için transdüksiyon adı verilen bir teknik yoluyla terapötik genleri hedef hücrelere sokmak için retroviral vektörler kullanır.

Yüksek titreli retroviral vektörler elde etmek için, HEK 293 hücrelerini, istenen retroviral plazmid, paketleme plazmidi ve uygun bir transfekte edici ajan içeren bir transfeksiyon karışımı ile transfekte edin. Hücreleri inkübe edin. Transfekte edici ajan, her iki plazmitin hücrelere verilmesini kolaylaştırır.

Retroviral plazmit, viral genomu hedef gen ile kodlarken, ambalaj plazmidi viral zarf proteinlerini kodlar. Paketleme hücrelerinin hücresel makineleri retroviral parçacıklar oluşturur ve bunları ortama bırakır. Hücreleri çıkarmak için viral süpernatanı toplayın ve santrifüjleyin.

Viral zarf proteinlerinin hücrelere bağlanmasını kolaylaştırmak için istenen viral partikül konsantrasyonunu ve kanser hücrelerini fibronektin kaplı bir kültür plakasına aktarın. Hücreleri inkübe edin. Hücreleri toplayın ve transdüksiyon verimliliğini analiz etmek için akış sitometrisi yapın. Bu protokol, c-Kit pozitif fare kemik iliği hücrelerinin retroviral aracılı transdüksiyonunu gerçekleştirecektir.

- İlk olarak, retroviral plazmit DNA'sını 1.5 mililitrelik bir tüpte ambalaj plazmidi, kalsiyum klorür ve su ile birleştirin. Daha sonra başka bir 1.5 mililitrelik tüpe 500 mikrolitre HBS ekleyin. Transfeksiyon karışımını HBS içeren tüpe damla damla ekleyin ve aynı anda en düşük ayara ayarlanmış vortekser ile karıştırın.

Transfeksiyon karışımını oda sıcaklığında 20 ila 30 dakika inkübe edin. Kuluçka süresi boyunca, HEK hücrelerine klorokin ekleyin ve onları inkübatörde tutun. Transfeksiyon karışımını ekledikten sonra, hücreleri 37 santigrat derece,% 5 CO2 inkübatörde 8 saat inkübe edin, 14 mililitre taze DMEM 10 ortamını çok yavaş bir şekilde ekleyerek hücre ortamını değiştirin. Tabağın duvarına yavaşça pipetlemek, HEK hücrelerinin herhangi bir şekilde sıyrılmasını önlemeye yardımcı olur.

Daha sonra hücreleri gece boyunca 37 santigrat derece,% 5 CO2 inkübatörde inkübe edin. Viral süpernatanı toplamak için 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Ardından şırıngaya 0.45 mikrometrelik bir şırınga filtresi takın. Viral süpernatanı yeni bir toplama tüpüne daldırın. Viral süpernatanı yaklaşık 16 saat sonra toplayın.

Bundan sonra, işlenmemiş 6 oyuklu kültür plakalarına PBS'de 2 mililitre rekombinant insan fibronektin fragmanı ekleyin. Ertesi gün, fibronektini plakalardan çıkarmak için bir pipet kullanın. Plakaları PBS'de% 2 BSA ile bloke edin ve plakaları oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin.

BSA'yı çıkarmak için bir vakum kullanın ve plakaları vakumla çıkarmadan önce PBS ile yıkayın. Bundan sonra, filtrelenmiş viral süpernatanı hemen ekleyin ve plakayı iki saat boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarmak için bir vakum kullanın ve plakayı tekrar döndürün.

Daha sonra, süpernatanı bir vakumla çıkarın ve viral kaplı kuyucukları PBS ile yıkayın. PBS'yi vakumla çıkarın. Önceden kültürlenmiş c-Kit + fare hücrelerini viral kaplı oyuklara ekleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreleri 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin. Transdüksiyondan 48 saat sonra, hücreleri santrifüjleme yoluyla peletleyin ve 1 numaralı FACS tamponunda yeniden süspanse edin.