Floresan Etiketli T-ALL Hücreleri İzolasyonu: Yetişkin Zebra Balıklarından T-ALL Hücrelerini İzole Etmek İçin Bir Yöntem

JoVE Encyclopedia of Experiments

Kanser Araştırmaları

0 görüntüleme • 4:43 dk • April 30th, 2023

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

- T hücreli akut lenfoblastik lösemi veya T-ALL, lenfositler olgunlaşamadığında ve lenfoblast adı verilen olgunlaşmamış hücreler olarak kaldığında ortaya çıkan bir kanser türüdür. Bu anormal hücreler enfeksiyonla mücadelede etkisizdir. Bu olgunlaşmamış hücreler hızla bölündükçe, sağlıklı kan hücrelerinden sayıca fazladırlar ve dalak, karaciğer ve CNS gibi organlara gidebilirler.

Zebra balıklarındaki tümörler insanlarda oluşanlara benzer. Bu nedenle, zebra balığı T-ALL tümör hücreleri oluşturmak için tercih edilen modeldir.

Tümör hücrelerinin yayılımını gösteren floresan sinyalleri sergileyen dönüştürülmüş balıkları seçerek başlayın. Ötenazi yapılmış balığın kafasını çıkarın ve fazla kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için vücut boşluğunu heparin solüsyonuyla yıkayın. Şimdi, vücut boşluğuna uygun bir tampon enjekte edin. Dışarıdan hafif bir baskı uygulayın ve tümör hücrelerini içeren tamponu bir mikrofüj tüpünde toplayın.

Hücreleri tripan mavisi ile boyayın ve mikroskop altında gözlemleyin. Canlı tümör hücreleri, tripan mavisi ile boyandığında floresan ve renksiz görünür, çünkü negatif yüklü hücre zarı, negatif tripan mavisinin hücre içine girmesini engeller. Tripan mavisi, gözenekli zardan ölü hücrelere girer ve onları maviye boyar. Aşağıdaki protokolde, yetişkin zebra balıklarından GFP işaretli T-ALL tümör hücrelerini izole edeceğiz.

- 0.9X PBS'de 20 mililitre% 10 ısıyla etkisiz hale getirilmiş FBS hazırlayın. 300 ünite antikoagülan içeren bir heparin sodyum tuzu şişesine 1 mililitre FBS / PBS çözeltisi ekleyin. Daha sonra, bir epifloresan mikroskobu kullanarak, tümör hücrelerinin vücudun% 50'sini istila ettiği balıkları veya yemek yeme veya yüzmede zorluk çektiği tespit edilen balıkları seçin.

Balıkları, balık suyunda mililitre trikat başına 1 ila 2 miligramlık bir çözeltiye aktararak ötenazi yapın. Ötenaziyi doğrulamak için hayvanı solungaç hareketi ve kalp atışı açısından gözlemleyin.

Balığın kafasını çıkardıktan sonra, fazla kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için bir pipet, 100 mikrolitre heparin solüsyonu vücut boşluğuna enjekte edin. Dökülen tüm sıvıyı aspire edin ve 1,5 milimetrelik bir mikrosantrifüj tüpüne pipetleyin. Daha sonra, yeni pipet uçları kullanarak, vücut boşluğunu iki kez daha veya yıkama solüsyonu hiç kan içermeyene kadar yıkayın ve tüm yıkamalardan toplanan sıvıyı atın.

Lösemi hücrelerini toplamak için, önceden yıkanmış vücut boşluğuna 100 mikrolitre FBS-PBS çözeltisi enjekte edin. Diseksiyon mikroskobu altında, tümör hücrelerini dışarı atmak için bir pipet ucuyla balığın vücuduna hafif bir baskı uygulayın. Serbest kalan sıvıyı 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne toplayın. Tümör hücrelerinin çoğu toplanana kadar izolasyonu tekrarlayın.

Tüm hücreleri aynı 1.5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpünde toplayın ve elde edilen süspansiyonu oda sıcaklığında tutun. Daha sonra izole edilen tümör hücrelerini, hücre kümelerini ayırmak için hafifçe pipetleyerek karıştırın. Hücre süspansiyonunu 40 mikrometre gözenekli bir filtreden süzün ve filtreyi 100 mikrolitre FBS-PBS ile bir ila iki kez yıkayın.

Filtrelendikten sonra hücreleri oda sıcaklığında tutun. Son olarak, yeni bir tüpte, 2 mikrolitre hücre süspansiyonunu 18 mikrolitre% 0.04 steril tripan mavisi çözeltisi ile karıştırın. Elde edilen süspansiyonun 10 mikrolitresini bir hemositometreye yükleyin ve canlı floresan tümör hücrelerini sayın.

- T-ALL hücrelerinin temiz bir örneğini toplamak önemlidir. Burada kullanılan Hoechst 33342 konsantrasyonu, toplanan canlı tümör hücrelerinin sayısına dayanmaktadır. Ek hücresel kalıntılar veya tümör olmayan hücreler teste müdahale edebilir.

08:01

Singenik Zebra balığı Tümör propaganda Hücreler Frekans miktarının sınırlandırılması Seyreltme Hücre Transplantasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:49

Akut lösemi tedavisi için Tirosin Kinaz İnhibitörleri klinik öncesi değerlendirilmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:32

İzoleli Malignant ve sigara-Malignant B hücreleri lck:eGFP Zebra balığı

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:35

Lazer Uncagable Floresein Dextran'ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:31

Yan Popülasyon Testi: Tümör Hücrelerinin Yan Popülasyonunu Zebra Balığından İzole Etmek İçin Bir Yöntem

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:11

Zebra Balığı Larvalarından Beyin Hücresi İzolasyonu: Zebra Balığı Beyin Dokusundan Sağlam Nöronlar, Makrofajlar ve Mikroglia Elde Etme Tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:50

İmmün Boyama Birleştirilmiş Hücre Ayırma ile Mikroglia İzolasyonu: Floresan Aktif Hücre Sıralaması Kullanarak Zebra Balığı Beyin Hücrelerinden Mikroglia'yı İzole Etmek İçin Bir İmmün Boyama Yöntemi

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:25

İzolasyon ve Zebra balığı Embriyolar gelen Tek Hücre Karakterizasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:06

Myc-induced T-cell Akut Lenfoblastik Lösemide Zebra bağıda Side Popülasyonunun İzolasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:20

Yalıtım ve RNA çıkarma larva Zebra balığı beyin sinir hücreleri, makrofajlar ve Microglia

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 15 Ağustos 2026