Name: Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-06-09T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 13 s
Description: Öğrenin tek molekül mikroskobisi ile nükleer ulaşım mekanizmalarını görselleştirmeyi. Floresan mikroskopi kullanarak HeLa hücrelerinde nükleer gözenek komplekslerinden geçiş dinamiklerini analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu proje, Araştırma Kapasite Geliştirme Hibe (Bowling Green Eyalet Üniversitesi) tarafından desteklenmiştir.

1. Hücre sistemi tek bir molekül deney için hazırlanması <ol><li> 37 ° C çözülme ve 5 ml medya ile 25 cm 2 kültür şişesi koyarak en az bir hafta önceden, bir stok taze bir HeLa hücre hattı kültürü başlatmak, 37 hücreleri inkübe ° C,% 5 CO 2 24 saat kuvöz ve hücreler için optimum bir koşulu sağlamak için en az 3 kez bölünmüş. Ancak hücreler, onların büyüme hızı, eğilimine önemli ölçüde yavaşlaması nedeniyle 20 kat daha fazla bölünmüş olmamalıdır. HeLa hücrelerinde daha önce genetik, nükleer zarf gözenek membran proteini POM 121 erimiş GFP (yeşil floresan protein) için tasarlanmış. Çekirdek zarı kesin lokalizasyonu için gereklidir. </li><li> Bir gün önce deney, tek bir molekülün deney için tasarlanmıştır hücreler steril bir Petri kabındaki yerleştirilen bir otoklavlanmış kapak astar üzerine yayılmış olmalıdır. Lamel DMEM (Dulbecco'nun modifiye Eagle orta, Grand Island, NY) 4.5 g / L glikoz, 862 mg / L GlutaMAX-I, 15 mg / ml fenol kırmızısı, 100 U / ml penisilin, 100μg/mL ile desteklenmiş askıya alınmalı streptomisin ve% 10 yeni doğan buzağı serumu. Bir kültürün tüm yüzey üzerinde eşit dağıtılmış kapak kayma başına 1 ml, hacmi olmalıdır. Bu kapak fişleri ile Petri kutularına sonra CO 2 kuvöz içine yerleştirilir ve deney öncesinde 24 saat bekletilir. Tek bir molekülün deneyi için uygun bir hücre kültürü için kapak kayma confluency hücre nükleer taşıma uygulanan faiz yıkama tamponları ve protein için iyi bir özgürlük sağlamak için% 70 geçmemelidir. </li><li> Deney günü, silikon yağ ayırıcılar olarak iki satırlık bir üst kapağı ile birlikte kayma ekleyerek, akış odaları inşa edildi. Bu hücrelerin hazırlanması sırasında kuru değil emin olmak için şarttır. Biz genellikle, bir kapak yapılmış iki odadan deney için iki farklı koşullar izin kaymayı tercih. Üst kapağı yaklaşık 6mm2 Kimwipe ters yerleştirildi elmas bıçakla kesilmiş cam kapak kayma küçük dilimler sığar. İki satır silikon gres ince sıkıca yağ boncuk boyutunu kontrol Parafilm ile bağlı bir pipet 10 ml plastik şırınga ile kapak fişleri kenarları boyunca yerleştirilir. </li><li> Sonra HeLa hücre kaplı slayt damla kurutulmuş ve yapıştırıcı olarak gres yağı ile bir ev işlenmiş alüminyum çerçeve monte - öfke, mikroskop numune tutucu slayt tutmak için hizmet. </li><li> Gres iki çizgi ile üst kapağı fişleri sonra bir akış odasının oluşturan hücre kaplı slayt üzerinde ters sivri uçlu bir cımbız ve sonra tutuklandılar. Yağlanmış kenarları lamel üzerine hafifçe bastırılarak nispeten sağlam bir eklenti yapıldı. </li><li> Bir hücre kaplı slayt üzerinde yapılan iki ayrı odaları, çapraz bulaşmayı önlemek için iyi bir sızdırmazlık sağlamak için esastır. Bu amaç için silikon gres birkaç satır dışında mühür slayt alt üst odaları arasında uygulandı. Gres birkaç satır odalarının dış tarafta da konuldu. </li><li> DMEM medya sonra hücrelerin kurumasını önlemek için akış odasına eklendi. Çözüm akış akış odaları çıkış tarafında sıvı dışarı emmek için küçük bir parça filtre kağıdı ile terfi etti. Kararlı ellerle, çözüm mikropipet tarafından tek elle akış odasının bir tarafında aynı anda eklenen olabilir ve filtre kağıdı ile diğer tarafında emilir. </li><li> İnşaattan sonra, slayt alt iki kez su ile ıslatılmış bir pamuk uçlu çubukla ile yıkanır ve sonra iki kez% 100 etanol ile. </li><li> Slayt mikroskop üzerine monte edildikten sonra, hücreleri, 2 X 25 mcL ithalat tamponu (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM EGTA pH 7.3) ile yıkanır. Bu hücreler daha sonra, ithalat tampon 2 X 25 mcL 40 mcg / mL digitonin ~ 2 dakika için permeabilize ve 2 X 25 mcL ithalat tamponu (20 mM Hepes, 110 mM KOAc, 5 mM NaOAc, 2 mM MgOAc, 1 mM ile tekrar yıkanır 360 kDa); EGTA, pH 7.3),% 1.5 Polyvinylpyrrolidone (PVP ile desteklenmiş. Parlak alanını kullanarak gerçek zamanlı permeabilization izlemek için gerekli olabilir. Çekirdeklerin osmotik şişme önlemek için digitonin sonra PVP tüm ithalat tampon çözeltiler dahil edildi. Kontrollü bir sitoplazmik ortam ile birlikte sağlam bir çekirdeği, bize karmaşık nükleer taşıma adım adım aydınlatmak için büyük ölçüde basitleştirilmiş bir taşıma sistemi sağlar. Sisteme yapılan Önceki topluluğu ve tek-molekül deneyler büyük nükleer taşıma anlayışlar sağladı. </li></ol> 2. Nükleer taşıma deney için gerekli proteinlerin hazırlanması <ol><li> Geleneksel bir bakteriyel dönüşüm sayesinde E.coli (JM109) özel suşları sorumlu genlerin eksprese amacıyla tasarlanmıştır.yukarıda belirtilen faiz proteinlerin üretimi ve -80 ° C'de stokta tutulur (NLS-2xGFP için Invitrogen pTrcHisB vektör). Ampisilin 5μL eklenmesi ile, E. Coli hücrelerin ifade floresan veya kargo protein dondurulmuş stokları loopful veya ~ 50 mcL LB medya 5ml için transfer (U 1000) ve 37 gece sallayarak ° C 225 rpm'de aerobik büyüdü . </li><li> 24 saat sonra doymuş kültürünün 500 mcL 500 ml LB medya içine transfer edilir ve 37 ° C inkübatör sarsılmış 5-6 saat için ek 250 mcL IPTG (İzopropil _-D-1-thiogalactopyranoside) ve başka bir inkübe 5-6 saat. IPTG lacZ gen ilgi ve IPTG gen ile değiştirilir lac operonunun, transkripsiyon gen ekspresyonu sonra ikna etmek için kullanılır tetikler bir laktoz metaboliti çünkü gereklidir. </li><li> Kültürü, daha sonra 12000 rpm'de 15 dakika boyunca yüksek hızda santrifüj soğutma bükülmüş ve süpernatantı atılır. Hücreler daha sonra 40 ml hacmi 1 gram başına bir pelet 10 ml dayalı olmalıdır CelLytic B (afinite saflaştırma ve analiz için uygun olan proteinlerin hızlı ve etkili ekstraksiyon CelLytic B sonuçları.) Yeniden süspanse. Merkaptoetanol, 28 ul hücre parçalama sonra ilgi proteinleri sindiren proteazlar devre dışı bırakmak için, disülfit bağları ve phenylmethanesulphonyl florür 400 ul kırmak için eklenir. Protein özleri hedefler için analizden önce aşağılamak olmadığını sağlamak için; "proteaz kokteyl" de (2 mg / ml tripsin inhibitörü 400 mcL 0.2 mg / ml, 0.2 mg / ml leupeptin pepstatin A. 400 mcL 400 mcL) eklenir çıkar. Daha sonra 400 mcL 1M imidazol ekleyin, 5 phosphodinucleotide ve oligonükleotid istenmeyen tek ve çift iplikli DNA aşağılamak için kullanılan DNaz I kromatografi sütun ve 1mm boncuk yüzeye bağlı Ni iyonları, bağlı etiketli proteinlerin Zehir için kullanılır parçaları. </li><li> Soğutma santrifüj 10000 rpm'de 60 dakika, 30 dakika boyunca buz üzerinde reaksiyon için yeterli bir süre, spin izin karanlıkta karışımı karıştırın. Süpernatant Hasat ve kromatografi için hazırlık olarak 3 dakika boyunca maksimum hızda mikrofuge'de santrifüj tüplerine iplik ve lizis tamponu ile yıkama, karışımın kadar eğirme ve yıkama tekrar Ni-NTA (Qiagen nikel nitrilotriacetic asit Superflow) infüzyon gerçekleştirmek Herhangi bir mavi tonu açık. Yavaş yavaş ortaya çıkan karışım, 60 dakika boyunca buz üzerinde karanlık bir kapta karıştırın. </li><li> Kolon kromatografisi 12 kesirler aşağıdaki gibi akan gerçekleştirin. İlk bölümü önceki adımda Ni-NTA ile karıştırılarak 10 ml süpernatant ile bir akış. Ikinci Lizis tampon 10 ml (50 mM Na-fosfat, 300 mM NaCl, 20 mM imidazol, pH 8.0), üçüncü 10 tampon mL (10 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8.0), dördüncü ve geri kalanı elüsyon tamponu 0.5 ml (250 mM imidazol, 100 mM NaCl, pH 8.0) </li><li> SDS-PAGE poliakrilamid jel hazırlayın ve bir kısmını 4 mcL ve 5X SB (300mm Tris 6.8,% 25 Bme,% 10 SDS,% 50 gliserol) 1 mcL karıştırma numunesinin. Standart Invitrogen tarafından 100 kb DNA merdiveni kullandı. Yüklemeden önce 5 dakika boyunca örnekleri kaynatılır. Yükledikten sonra, 60 dakika için 120V jel koştu. Sonra, lekeli destained ve nihayet 80C az 2 saat için özel bir jel kurutma makinesi kurutulur. </li><li> Daha sonra jel sonuçları incelendi ve en iyi sonucu vermiştir kesirler yer. Bizim ilgi protein bağlı olarak, bantların bir proteinin büyüklüğü sırasıyla yer olmalıdır. Bu bölümü MonoQ Superdex 200 (Amersham Pharmacia) ile daha fazla protein saflaştırılması için seçilmiş olmalıdır. </li><li> Konsantrasyon, her zaman, 5 dakika boyunca 14 rpm'de gözenek boyutu 10K Nanosep filtre en yoğun kesirler iplik elüsyon tamponu ile yıkama yapılır. BSA tahlil daha fazla protein etiketleme prosedürü için kullanan son protein konsantrasyonu belirlemek için gerekli. </li><li> NLS-2xGFP içsel yeşil floresan fotoğraf istikrar yoksul ve hücre otofloresans ile çakışan spektrumu nedeniyle nükleer ulaşım tek molekül görüntüleme için kullanılan olamaz. Bu nedenle, biz TCEP tris (2 düşüldükten sonra 50 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCl 2 saat boyunca oda sıcaklığında bir sistein-reaktif organik boya (Molecular Probes Alexa555 veya Alexa 647 maleimide) aşırı yük molekülleri etiket 20 dakika boyunca carboxyethyl). 2-merkaptoetanol Reaksiyonlar söndürülür ve protein çözümleri, ücretsiz boya kaldırmak için diyalize. </li></ol> 3. Tek molekül mikroskopi <ol><li> Bizim mikroskop kurmak 1.4 NA 100x yağ immersiyon objektif (UPLSAPO 100XO, Olympus) ile donatılmış bir Olympus IX81, 35 mW 633 nm GFP filtre ile cıva lambası He-Ne lazeri (Melles Griot), bir çip çarpma kazanç şarj çiftli aygıt kamera (Cascade 128 +, Roper Bilimsel) ve thveri toplama ve işleme için e Slidebook yazılım paketi (Akıllı Görüntü Yenilikler). Optik bir kıyıcı (Newport) lazer uyarma bir on-off modu oluşturmak için kullanılır oldu. GFP ve Alexa647 floresan sırasıyla cıva lambası ve 633 nm lazer heyecanlıydı. Dikroik filtre (Di01-R405/488/561/635-25x36, Semrock) ve emisyon filtresi (NF01-405/488/561/635-25X5 filtre aynı amacı, yeşil ve kırmızı floresan emisyon toplanmıştır. 0, Semrock) ve benzer bir CCD kamera tarafından görüntülendi. </li><li> Tek molekül deneylerde, taşıma süresi daha uzun olması için tek bir kargo molekülün floresan photobleaching zaman olanak tanır. Photobleaching zamanı belirlemek için, 0.1 nM kargo molekülleri, non-spesifik emilim nedeniyle 30 dakika sonra kayma ve hareketsiz hale bir cam kapak kaplanmıştır. Sonra, floresan zaman ders ölçülür. Faiz photobleach kez protein bağlı olarak, bu nedenle, aydınlatma şiddeti ve aydınlatma alanında maleimides ile reaksiyona yetenekli cysteins sayısına göre farklı olacaktır, bir ön photobleaching neden ayarlanabilir olmalı ve Alexa 647 ekran etiketli yükün molekülleri sigorta kargoların NPC'ler ile etkileşime daha uzun floresan. </li><li> Permeabilize hücreleri ithalat deneyler için, kargo ve temel taşıma kofaktör birlikte ilave edilmiştir. Tipik ithal kargo reaksiyonları 1 mM GTP, 0.5 mcM içerdiği Importin, 0.5 mcM Importin-1, 2 mcM Ran ve pasif taşıma için 10KDa Dextran'ın kolaylaştırılmış taşıma ve 0.1 nM 1 mcM NTF2 .. Floresan kargo konsantrasyonları toplu deneylerde&gt; 100 nM, ve tek bir molekül deneyleri için 100 pM ~. Bu konsantrasyonlarda, kargo% 99 Importin ve Importin komplekslerini oluşturmak için bekleniyor. Ulaştırma oranı Epifloresans (sadece nispi oranları önemli olsaydı) veya konfokal floresan mikroskobu (mutlak oranları istenilen olsaydı) tarafından takip edildi. </li><li> İlk nükleer zarfın konumunu GFP filtreler NE bir resim çekmek için bir dizi ile ilgi çekici bir HBO cıva lambası, geniş alan Epifloresans mikroskobu ile tespit edilmiştir. Bir satır veya sütun içinde piksel yoğunlukları yaklaşık dik NE Gauss ile uygun. Piksel yoğunlukları belirli bir kümesi için Gauss tepe pozisyonlarda o satır ve sütun için KD konumunu kabul edildi. Gibi Gauss bir dizi tepe pozisyonlarda daha sonra tüm görüntü içinde KD yolunda verimli bir ikinci derece polinom uygun. </li><li> KD lokalize sonra tamamen photobleached kadar, 633 nm He-Ne lazer kullanan tüm otofloresans kurtulmak için çok önemlidir, genellikle üzerinde 60 saniye yeterli olacaktır. </li><li> Örnek molekülleri sonra PVP% 1.5 çözümü tutulacak ve karışımın hacmi 25 L akış odasına eklenen ve daha sonra filtre kağıdı bir fitil uygulayarak haznesinden sürükledi. Odak herhangi bir kuvvetli hareket tarafından kolaylıkla bozulacak çünkü mutlak bir bakım, doğru çekirdek zarı localisation sonra permeabilize hücrelere ithalat kargo proteinlerin yanı sıra üzerine alınmalıdır. </li><li> En kısa sürede kargo moleküller, He-Ne lazer moleküllerin transit taşımacılık yörüngeleri aydınlatmak için kullanılan 633 nm eklenir. Optik bir kıyıcı (Newport), yüksek güç yoğunluğu, lazer gibi olmayan photobleached tek moleküllerin bir bölümü NE yaklaşmasına izin photobleaching nedeniyle önlemek için yaklaşık 5 Hz'de meşgul olmalıdır. 2500 Hz kadar gidebilir yüksek hızlı CCD kamera ile çekilen videoların tek bir molekül translokasyonlar bir dizi olmalıdır. </li></ol> 4. Temsilcisi sonuçları Doğru şekilde gerçekleştirilmemesi, protokol bize bir dizi permeabilize HeLa POM 121 hücrelerde nükleer gözenek kompleksi ile etkileşim tek kargo moleküllerin translokasyon gösteren videolar toplamak için izin verdi. (Şekil 1). Biz görüntü için yola çıkan ve stably GFP-POM121 ifade digitonin permeabilize HeLa hücreleri NPC ile dekstran moleküllerin geçici taşıma adımları izlemek. Hücreler etiketli dekstran moleküllerin düşük konsantrasyonlarda ile inkübe edildi. Çekirdeğin ekvator düzleminde bir 488-nm cıva lambası ışığı tarafından heyecan GFP floresan yeşil halka açık bir görüntü ile odak noktası haline getirilmiştir. GFP-KD uzun süre maruz kalma NE orta düzlemine yerelleştirmek mükemmel bir sinyal-gürültü (SNR) oranı elde etmemizi sağlar. Daha önce 10 kDa dekstran molekülleri, 500 ya da 1000 Hz'lik bir algılama kare hızı yaklaşık 20-40 mil mekansal çözünürlükte yaklaşık 2 ms içinde KD ile diffüz bulundu. Böyle bir uzaysal çözünürlük, pasif difüzyon için daha uzamsal bilgiyi açıklamak için yeterli değildir NPC aracılığıyla sadece dekstran moleküllerin 01:59 difüzyon adımları yakalamak sağlar. NPC içinde dekstran moleküllerin daha ince adımları yakalamak için daha iyi bir spati2500 Hz daha hızlı bir algılama kare hızı daha ince difüzyon adımları yakalamak için uyarlamak için; (i) ve (ii) daha yüksek bir aydınlatma optik yoğunluk elde etmek için tek moleküllerin daha fazla fotonlar heyecanlandırmak için istihdam için: otemporal çözünürlük, biz iki önemli iyileştirmeler yaptık yüksek uzaysal çözünürlük. Bu gelişmeler bize bir uzaysal çözünürlüğe sahip 12 nm ve 400 ms, 100 kW / cm 2 radyasyonunun az 633 nm lazer ışığı NE genelinde alexa647 etiketli dekstran molekülleri geçici difüzyon birden fazla adımları yakalamak için olanak sağlar . Şekil 1'de gösterildiği gibi, dekstran moleküllerin tipik ulaşım olayların bir dizi hareketsiz görüntü kaydedildi. Bireysel transit dekstran moleküllerin uzaysal yörüngeleri takip ederek, KD aracılığıyla difüzyon ince adımları ayırt edildi. Biz yaklaşık% 30 KD ile etkileşim olaylar kaynaklanan ve hedef bölmeleri kabul etmiş olduğu bulundu. Sitoplazmaya KD hareket dekstran moleküller, aralarında iki hedef var: NE aracılığıyla difüzyon sonra çekirdeğinde sonu veya ihracat olaylar için benzer durumlar meydana KD ile etkileşim sonra sitoplazmaya geri dönmek: çekirdeğin başlayarak dekstran molekülleri sitoplazma girmek veya KD ile etkileşim sonra çekirdeğine geri diffüz. Böyle bir görüntü serisi NPC ile ilgili olarak, NPC aracılığıyla moleküllerin bekleme süresi gibi zamansal bilgileri ile tek moleküllerin uzaysal konumu hakkında bilgi içerir. NE alanı çevresinde dekstran moleküllerin yörüngeleri analiz ederek, taşıma süresi, verimlilik ve giriş frekansı tespit edilebilir. Işimizde taşıma süresini ithalat veya ihracat süresi olarak tespit edilebilir. Bunlar ortalama ithalat veya ihracat geçiren NPC'ler içinde dekstran moleküllerin bekleme süresi olarak tanımlandı. Ithalat veya ihracat verimliliği tam bir ithalat veya ihracat olayları tam ve prematüre olayların toplamı üzerinden yüzde olarak tanımlanmıştır. Ithalat veya ihracat giriş frekansı, bir saniye boyunca KD ile etkileşen moleküllerin sayısını ifade eder. <img src="/files/ftp_upload/2040/2040fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 KD aracılığıyla dekstran moleküllerin tipik ulaşım olayların seçilen video kareleri. (A) sitoplazma-to-çekirdek olay. Tek bir dekstran molekülü (kırmızı nokta), KD (yeşil piksel hattı) ile etkileşim, sitoplazma başladı ve çekirdeğinde sona erdi. Olay (mavi çizgiler ve açık noktalar) yörüngeleri belirlenir ve KD (siyah çizgi) ile üst üste. Yeşil ve kırmızı çizgiler, sitoplazma ve nükleer yan KD 100 nm-mesafe temsil eder. C, sitoplazma. N, çekirdeği. Ölçek çubuğu: 2 mm. (B) sitoplazma-sitoplazma olay. (C) çekirdeği-to-çekirdek bir olay. (D) çekirdeği-sitoplazma olay.

<ol><li>Ma, J., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Snapshots+of+Three-Dimensional+Distribution+of+Transient+Interactions+in+Nuclear+Pore+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Snapshots of Three-Dimensional Distribution of Transient Interactions in Nuclear Pore Complex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Sarma, A., Goryaynov, A., Yang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Imaging+of+the+Calcium-Regulated+Nuclear+Pore+Permeability%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Imaging of the Calcium-Regulated Nuclear Pore Permeability.</a> , Forthcoming Forthcoming.</li>
<li>Yang, W., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+single+molecules+transiting+through+nuclear+pore+complexes+using+narrow-field+epifluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Visualizing single molecules transiting through nuclear pore complexes using narrow-field epifluorescence microscopy.</a> Methods. 39, 316-328 (2006).</li>
<li>Yang, W., Gelles, J., Musser, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+of+single-molecule+translocation+through+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Imaging of single-molecule translocation through nuclear pore complexes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 12887-12892 (2004).</li>
</ol>

Bakım Deney sırasında, KD ve tek moleküllerin uygun bir ko sigorta alınmalıdır. Sinyal düşük kötü etiketleme veya photobleaching nedeniyle, özellikle yüksek sinyal gürültü oranı sağlamak için de önemlidir. Yerelleştirme hassas arka plan gürültüsü (out-of-focus floresan, CCD okuma gürültü, karanlık ve diğer faktörlerden kaynaklanan) ile sınırlıdır.

tek molekül görüntüleme nükleer ulaştırma

Single-Molecule Imaging of Nuclear Transport

Tek bir molekülün floresan mikroskopi yaklaşımlar programı, son on yıl içinde biyolojik reaksiyonlar anlamak içinde büyük bir boşuna kanıtlanmıştır. , Hücre içinde derin yüksek zamansal ve mekansal kararları moleküler etkileşimler soruşturma nedeniyle tek tek moleküllerin kaynaklanan doğal olarak zayıf sinyaller zorlu kalmıştır. Yang ve ark tarafından yapılan son çalışmalar. dar alan Epifloresans mikroskopi tek molekül düzeyinde Nükleositoplazmik taşıma görselleştirme izin verdiğini göstermiştir. Sinyal bağımlı ve bağımsız kargo moleküller için tek bir molekülün yaklaşım, önemli kinetik, nükleer taşıma süresi ve verimlilik gibi, olarak elde edilmiştir. Burada, geliştirilmiş bir uzaysal çözünürlüğe sahip 0.4 ms ve 12 nm metodolojik yaklaşım için bir protokol. Geliştirilmiş çözünürlük, bizi yarı sağlam hücreler nükleer gözenek kompleksleri (NPC) ile geçici aktif transport ve pasif difüzyon olayları yakalamak için olanak sağladı. Bu yöntem, hücrelerin içindeki diğer bağlayıcı ve ticareti olayların nedenlerine açıklık kullanılmak üzere bekliyoruz.

Tek molekül mikroskopi, nükleer taşıma yeni bakış açıları sağlanan Yaklaşım.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Tek molekül floresan mikroskopi yaklaşımlarının faydasının, biyolojik reaksiyonların anlaşılmasında büyük bir yarar sağladığı kanıtlanmıştır...

Hücrenin çekirdek zarında, RNA, ribozomlar, belirli proteinler, karbonhidratlar ve sinyal molekülleri gibi suda çözünür moleküllerin taşınmasını sağlayan yaklaşık 2000 çekirdek gözenek kompleksi bulunur; geçirgen hücrelere işaretli kargo molekülleri ekleyerek, tekil moleküllerin çekirdek gözeneklerinden geçişi floresan mikroskobu ile görselleştirilebilir. Lokalizasyonun yanı sıra taşıma süresi, içe aktarım, dışa aktarım verimliliği ve giriş sıklığı gibi uzamsal-zamansal özelliklerin belirlenmesi için zaman ayarlı (time-lapse) görüntüler gereklidir. Merhaba, ben Alex ov, Bowling Green State Üniversitesi Biyoloji Bölümü'ndeki tek molekül mikroskopisi laboratuvarından doktora öğrencisiyim.Ben Asha P Shema, tek molekül mikroskobu laboratuvarından yüksek lisans öğrencisiyim. Ben Juma. Buradaki tek molekül mikroskobu laboratuvarında doktora sonrası araştırmacıyım.Bugün size HeLa hücrelerinde nükleer por kompleksleri aracılığıyla gerçekleşen nükleer transportun tek molekül görüntüleme prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda, çeşitli moleküllerin nükleer por kompleksi üzerinden translokasyonunu incelemek için bu prosedürü kullanıyoruz. Öyleyse başlayalım.Nükleer taşıma deneyi için proteinleri hazırlamak amacıyla, nükleer kargo proteinlerinin üretimine sorumlu genleri eksprese eden JM 1 0 9 E. coli suşları geleneksel yöntemle transforme edilir, LB besiyerinde büyütülür ve IPTG ile indüklenir. Hücreler, 0,7 ila 0,8 optik yoğunlukla log fazına ulaştığında, kültür 4 °C'de 15 dakika boyunca 6,000 ×g hızla santrifüj edilir, süpernatan atılır ve pelet tartılır. Ardından, afinite saflaştırması ve analizine uygun proteinleri ekstrakte etmek için hücreler, gram başına 10 mL Lysis Buffer'da yeniden süspanse edilir.Ardından, uygun miktarda proteaz kokteyli ekleyin ve DNase I ve beta-mercaptoethanol ile karıştırın. Karışımı karanlıkta, buz üzerinde 30 dakika boyunca karıştırın. Sonrasında, 4 °C'de 20 dakika boyunca 25.000 ×g'de santrifüj edin.Santrifüjün ardından, kromatografi hazırlığı için süpernatantı yeni bir şişeye aktarın. Dört adet mikro santrifüj tüpüne 400 µL nikel NTA ve aseton ekleyin. 16.000 ×g hızda üç dakika boyunca santrifüjleyin.Süpernatantı atın. Ardından 400 µL lizis yıkama tamponu ekleyin. Son yıkamayı takiben, önceki yıkama adımlarını üç kez tekrarlayın.Nikel NTA'yı liziz tamponunda yeniden süspanse edin ve dört tüpün tamamını hücre süpernatını içeren şişeye ekleyin. Elde edilen karışımı, karıştırma işlemi sürerken, karanlık bir kapta buz üzerinde 60 dakika boyunca yavaşça karıştırın. Floresan proteinlerin fotobeyazlamasını önlemek için alüminyum folyoyla sararak bir ecno pack kromatografi kolonu hazırlayın.Ayrıca, kolonun altına yerleştirilmiş bir rakete 12 adet toplama tüpü yerleştirin. Karışım 60 dakika boyunca karıştırıldıktan sonra, 10 mililitre SNA nikel NTA karışımını yükleyin ve tamamen geçmesini bekleyin. Fraksiyonları toplamaya başlayın.Ardından, 10 mililitre lizis yıkama tamponu ekleyin. Tamamen geçmesine izin verin. Daha sonra 10 mililitre IZO tamponu ekleyin ve geçmesini bekleyin.Fraksiyonları toplamaya devam edin. Ardından, 0,5 mililitre elüsyon tamponu akıtın ve 12 fraksiyonun tamamı toplanana kadar elüsyon tamponu akışını tekrarlayın. Hangi fraksiyonun en yüksek protein konsantrasyonuna sahip olduğunu belirlemek için her fraksiyondan dört mikrolitreye sayfa jelinde yürütme yapın ve Coomassie ile boyayın.Standart prosedürlere uygun olarak, en konsantre fraksiyonları birleştirin ve elüsyon tamponu ile önceden durulanmış, 10 kilo dalton gözenek boyutuna sahip bir nano step filtreye 500 microliters ekleyin. Proteini, beş dakika boyunca 16, 000 times gravity hızında santrifüjleyerek konsantre edin. Tamponu atın, kalan protein fraksiyonunu karıştırın ve filtre santrifüjüne 500 microliters daha ekleyin.Aynı işlemi seçilen tüm fraksiyonlar için tekrarlayın. Ardından, konsantre proteinin nihai hacmini elüsyon tamponu ile yaklaşık 50 µL'ye tamamlayın. Daha sonra, bir mikropipet ile filtre yüzeyinden nazikçe karıştırarak toplayınız; süper saf protein elde etmek için iyon değişim ve boyut dışlama kolonlarından geçirmeye devam edin ve nihai protein konsantrasyonunu belirleyin.Ardından, kargo moleküllerini Alexa 555 veya Alexa 647 gibi aşırı miktarda yardımcı reaktif organik boya ile işaretleyin. Bu işlem, GFP'nin doğal yeşil floresanının; düşük foto-stabilitesi ve hücre otofloresansı ile örtüşen spektrumu nedeniyle nükleer transportun tek molekül görüntülemesinde kullanılamamasından dolayı yapılmaktadır. İşaretli protein, deneylerden bir gün önce 25 µL'lik birkaç fraksiyona bölünmeli ve -80 °C'de saklanmalıdır. Steril 35 mm'lik bir Petri kabına otoklavlanmış bir lamel yerleştirin ve üzerine 9 mL DMEM pipetleyin.Ardından, bir mililitre hücre kültürünü pipetleyin ve hücrelerin kullanıldığı lamellenin üzerine eşit şekilde damlatın. Buradaki hücreler, GFP ile işaretlenmiş bir dış membran proteini POM 1 21 eksprese edecek şekilde önceden genetik olarak modifiye edilmiştir. Kapları 12 saat boyunca karbondioksit inkübatöründe bekletin.Deney günü, akış odalarının hazırlanmasına başlayın. Ardından, hücre kaplı lamı inkübatörden çıkarın, lamı kurulayın ve ardından vakum gresli yapıştırıcı kullanarak monte edin. Ev yapımı işlenmiş alüminyum bir çerçeve içinde, hazırlık sırasında hücrelerin kurumadığından emin olmak esastır.10 mililitrelik plastik bir şırınga kullanarak, cımbız yardımıyla bir lamelle her iki yanına iki şerit silikon ekleyin. İki şerit silikon uygulanan küçük hazırlanmış lameli, hücre kaplı lamelin üzerine ters şekilde yerleştirin ve akış hücresini oluşturmak için hafifçe bastırın. Bir hücre kaplı lamel üzerinde iki ayrı hücre hazırlanmışsa, çapraz kontaminasyonu önlemek için iyi bir sızdırmazlık sağlandığından emin olmak çok önemlidir.Odacıkları birbirinden ayırıp sızdırmaz hale getirmek için, lamın üstünden altına kadar odacıkların arasına birkaç hat şeklinde silikon gres uygulayın. Ayrıca, odacıkların dış yanlarına da birkaç hat gres sürün> Hücrelerin kurumasını önlemek için akış odasına DMEM ekleyin.Ardından, pamuklu bir çubuk kullanarak lamın alt kısmını iki kez suyla ve ardından iki kez %100 etanol ile yıkayın. Çerçeveyi mikroskoba yerleştirin. Akış odasına 25 µL taşıma tamponu ekleyip emdirerek iki kez yıkama yapın.Çıkış tarafına uygulanan küçük bir filtre kağıdı parçası kullanarak, hücreleri 25 µL digitonin ile yaklaşık iki dakika boyunca bir kez permeabilize edin; permeabilizasyon, brightfield kullanılarak gerçek zamanlı olarak izlenmelidir. Son olarak, çekirdeklerin ozmotik şişmesini önlemek için %1,5 polivinilpirolidon veya PVP ile desteklenmiş 25 µL taşıma tamponu ile hücreleri yıkayın. Mikroskop altında permeabilize hücreleri bulun ve parlak yeşil floresan bir halka tanımlayın.Ardından hücrenin ekvatoruna odaklanın ve floresan kargo moleküllerini eklemeden önce bir görüntü alın. Nükleer zar bölgesini seçerek ve tamamen fotobleaching olana kadar 633 nanometre helyum neon lazerle aydınlatarak tüm otofloresansı ortadan kaldırın. Genellikle iki dakikadan fazla süre gereklidir.%1.5 PVP içeren taşıma tamponunda seyreltilmiş işaretli dekstran örneğinden 25 microliters hacminde akış odasına ekleyin ve bir filtre kağıdı fitili uygulayarak odada yayın. Odak noktası herhangi bir sert hareketle kolayca bozulabileceği için, içeri aktarılan kargo proteinlerinin, yani geçirgen hücrelerin eklenmesi sırasında dikkatli olunmalıdır. Fotobeyazlamayı önlemek ve fotobeyazlamaya uğramamış yeni tek molekül kısımlarının nükleer zarfına yaklaşmasına izin vermek için optik kıyıcıyı yaklaşık beş hertz frekansında çalıştırın.Örnek moleküller eklendikten hemen sonra, nükleer por kompleksleri üzerinden gerçekleşen translokasyonu yakalamak için bir dizi tek molekül translokasyon videosu alınmalıdır. Translokasyon yapan moleküllerin taşıma yörüngelerini aydınlatmak için 633 nanometre helyum neon lazer kullanın. Bu protokol, nükleer por kompleksi ile etkileşime giren tekil kargo moleküllerinin translokasyonunu gösteren bir dizi görüntünün toplanmasını sağlar.Permeabilize edilmiş hücrelerde, 1-21 hücre boyunca işlem gerçekleştirilmiştir. Bireysel transiting dekstran moleküllerinin uzamsal yörüngeleri takip edilerek, nükleer zar boyunca difüzyonun ince basamakları ayırt edilebilmektedir. Burada, kırmızı bir nokta olarak gösterilen tek bir dekstran molekülünün sitoplazmadan başladığı, yeşil piksel hattı olarak gösterilen nükleer zarla etkileşime girdiği ve burada çekirdekte sonlandığı bir sitoplazmadan çekirdeğe geçiş olayı gösterilmektedir.Dekstran molekülü sitoplazmadan başlamış, nükleer zarla etkileşime girmiş ve tekrar sitoplazmaya dönmüştür. Bu örnekte, dekstran molekülü çekirdekten başlamış, nükleer zarla etkileşime girmiş ve tekrar çekirdeğe dönmüştür. Burada ise dekstran molekülü çekirdekten başlamış, nükleer zarla etkileşime girmiş ve sitoplazmada sonlanmıştır.Bireysel transing dekstran moleküllerinin uzamsal yörüngeleri takip edilerek, nükleer zar boyunca difüzyonun ince basamakları ayırt edilebilir. Mavi çizgiler ve açık noktalarla gösterilen olayın yörüngeleri belirlenmiş ve siyah çizgiyle gösterilen nükleer zar ile üst üste getirilmiştir. Yeşil ve kırmızı çizgiler, nükleer zarın sitoplazma ve çekirdek tarafındaki 100 nanometrelik mesafeyi temsil etmektedir.Tek moleküllerin nükleer por kompleksi üzerinden translokasyonunu 400 mikrosaniyelik zaman çözünürlüğünde ve 10 nanometrelik mekansal çözünürlükte nasıl görselleştireceğinizi göstermiş olduk. Bu prosedür sırasında, mümkün olan maksimum sinyal-gürültü oranının elde edilmesinin gerekliliğini hatırlamak ve odak kolayca bozulabileceği için tek molekül deneyini gerçekleştirirken gerçekten dikkatli olmak önemlidir. İşte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

single-molecule-imaging-of-nuclear-transport

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Burada iki optik kapalı kalmış mikro-arasında asılı tek bir DNA molekülü ile etkileşim tek floresan etiketli protein molekülü tespit etmek için cihazları ve yöntemleri tarif etmektedir.

Protein-DNA Etkileşiminin Çalışmaları Tek molekül Manipülasyon ve Görüntüleme birleştiren

Biz kimyasal elementler mevcut içinde in situ insan hücreleri hem de onların vitro miktar tespiti için açıklayınız. Yöntem herhangi bir hücre tipi için uygundur ve Tek Kişilik hücrelerde vitro metal oksit nano tanecikleri pozlama takip kantitatif kimyasal analizler için özellikle kullanışlıdır.

Situ Algılama ve Metal Oksit nano tanecikleri nükleer Microprobe analizi ile tek hücre miktar

Bu protokol, bir NLS-NES-GFP proteininin nükleer ithalatında gerçek zamanlı değişikliği niceleyerek motor nöron benzeri NSC-34 hücrelerindeki nükleositoplazmik taşınım oranını duyarlı bir şekilde ölçmek için bir yöntem açıklamaktadır.

Motor Nöron benzeri NSC-34 Hücrelerinde Gerçek Zamanlı Nükleositoplazmik Taşınımı Ölçüm Testi

Bu protokol bırakmak Förster rezonans enerji transferi ve floresan mikroskopi Imaging ömür boyu göre SNARE proteinlerin karmaşık oluşumu nicel görselleştirme için yeni bir yöntem açıklanır.

Hücre içi SNARE mikroskobu Imaging Floresans ömür tarafından kaçakçılığı görüntülenmesi

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Fotoaktive nörofilament proteinini ifade eden transgenik farelerden periferik sinirlerin tek miyelinli aksonları içinde nörofilamentlerin aksonal naklini analiz etmek için floresan fotoaktivasyon yöntemlerini tanımlıyoruz.

Excised Mouse Tibial Nerve Nörofilament Transport Görüntüleme ve Analizi

Mevcut yöntemler, kolayca bulunabilen genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergelerini kullanarak Caenorhabditis elegans'ta in vivo olarak yüksek çözünürlüklü, sub-kompartmanlı kalsiyum görüntüleme için orantılı olmayan bir yaklaşımı tanımlamaktadır.

Nöronal Kalsiyum Kullanımının In Vivo Subsellüler Görüntülemesi

Bu protokol, optogenetik araçlar aracılığıyla nükleositoplazmik taşınmanın izlenmesinden elde edilen canlı hücre görüntüleme verilerinin otomatik analizlerinin nasıl verimli bir şekilde kurulacağını ve gerçekleştirileceğini açıklar.

Canlı hücrelerde nükleositoplazmik taşıma dinamiklerini ölçmek için LEXY ve LINuS optogenetik araçlarını ve otomatik görüntü analizini kullanma

Bu protokol, izole Arabidopsis çekirdeklerinin tek moleküllü lokalizasyon mikroskopik görüntülemesi için verimli bir iş akışı sunar; optimize edilmiş izolasyon, fiksasyon ve etiketleme kullanılarak kromatin ve RNA Polimeraz II'nin nano ölçekli görselleştirilmesini sağlar. Bu yaklaşım, yüksek çözünürlüklü görüntüleme için diğer kromatin ilişkili proteinlere veya histon modifikasyonlarına kolayca uyarlanabilir.

Arabidopsis çekirdeklerinde tek moleküllü lokalizasyon mikroskopisi için sadeleştirilmiş bir protokol

Membran protein fonksiyonu, hücre zarı lipid bileşimi tarafından düzenlenir. Bu video-makale nasıl değişmiş membran özellikleri gazetecilere olarak çift katlı yama elektrotlar, hem de nasıl kullanılacağı gibi gramicidin kanallarını kullanarak bir yama oluşturmak için ayrıntıları.

Çift katlı Elastik Özellikleri İzleme Değişiklikler için Tek Molekül Yöntemleri

Öğrenin tek molekül mikroskobisi ile nükleer ulaşım mekanizmalarını görselleştirmeyi. Floresan mikroskopi kullanarak HeLa hücrelerinde nükleer gözenek komplekslerinden geçiş dinamiklerini analiz edin.

Tek Molekül Görüntüleme Nükleer Ulaştırma

Daha fazla video keşfet