Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo Görüntüleme

HIV enfekte erişkin hastalarda nöroinflamasyon, normal sinaptik sinyallemeyi engelleyerek soyutlama, sözel akıcılık, dikkat, öğrenme, yeni bilgiler ve hafıza ile ilgili zorlukları içeren nörobilişsel eksikliklere yol açar. HIV-1 tat, burada HIV'li hastalarda görülen sinaptik disfonksiyonu taklit edebilen inflamatuar moleküllerin salgılanmasını indükler. Mikroglialar dahil olmak üzere mononükleer hücrelerde GFP eksprese eden erişkin fareler, ince kafatası iki foton mikroskopisi kullanılarak HIV-1 tat kaynaklı nöroinflamasyonu araştırmak için kullanılır.

Tat enjeksiyonu sonrası mikroglia yanıtları in vivo olarak görüntülenebilir. Elde edilen görüntüler, mikroglial uzantıların kısalması ve kalınlaşmasının yanı sıra fagositoz kupuna benzer yapıların oluşumunu ve serebral mikro damarlardaki periferik monosit trafiğini göstermektedir. Merhaba, ben Rochester Üniversitesi, Sinirsel Gelişim ve Hastalık Merkezi ile Harris Galbard laboratuvarından Dan Marker.

Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Nörobiyoloji ve Anatomi Bölümü'ndeki Esca Laboratuvarı'ndan EF Trombley. Merhaba, ben de Albas Lab'dan Shain Luu. Bugün size ince kafatası preparatı kullanarak iki foton görüntüleme prosedürünü göstereceğiz.

Bu prosedürü kronik nöroinflamasyonu incelemek için kullanıyoruz. O halde, burada gösterilen deneye başlayalım. Mikroglia dahil olmak üzere mononükleer hücre hatlarında GFP eksprese eden OT'ler kullanılır.

Belirli bir projenin ihtiyaçlarını karşılamak için farklı fare suşları kullanılabilir. Cerrahi işlem için fentanil, midazolam ile anestezi uygulanmış bir farenin hazırlıklarına başlayın. Öncelikle, hayvanın kuyruk sıkıştırma gibi ağrılı stimülasyonlara artık yanıt vermediğinden emin olun.

Anestezi sonrası hipotermiyi önlemek için hayvanı bir ısıtma pedine yerleştirin. Ardından, gözlerin nemli kalmasını sağlamak için hayvanın gözlerini koruyucu bir oftalmik pomad ile kapatın. Tüm cerrahi aletler otoklavlanmış veya cam boncuk sterilizatörü ile sterilize edilmiş olmalıdır; aletleri %70 etanol içinde bekleterek daha fazla dezenfekte edin.

Makas kullanarak hayvanın kafa derisindeki tüyleri temizleyin, ardından bölgeyi %10'luk povidon iyot çözeltisi ve %70'lik etanol ile dezenfekte edin. Küçük bir makas kullanarak kafa derisinde, kafatasının dört ila beş milimetre kaudalından başlayan ve gözlerin önüne kadar ilerleyen orta hat kesisi yaparak cerrahi işleme başlayın. Bu kesi, iki foton görüntüleme sırasında fare başını sabitleyen plakanın yapıştırılmasına derinin engel olmayacağı kadar uzun olmalıdır.

Ardından, kafatası üzerindeki membranları kurutmak için steril pamuklu çubuğa %100 ethanol uygulayın. Bu membranları ince bir pens yardımıyla sıyırarak uzaklaştırın. Membranlar temizlenmezse, kafa plakası sabitleme işlemi stabil olmayacaktır.

Bir diseksiyon mikroskobu altında, inceltilecek bölgeyi belirleyin. Kafatası bu bölgelerde daha az stabil olduğundan ve alttaki büyük damarlar ile meningesler, ilgi alanına yönelik görüntüleme penceresine gönderilen görüntüleri engelleyeceğinden, doğrudan kranial sütürlerin üzerinde yer alan ilgi alanlarından kaçının. Ardından, bir pamuklu çubuk kullanarak %10'luk ferric chloride çözeltisi ile kafatasını tekrar deneyin.

Kafa plakasının altındaki görüntüleme penceresinin kenarlarına ince bir tabaka perma bond, nine 10 yapıştırıcı sürün. Ardından, yapıştırıcının tutunması için hafifçe bastırarak plakayı hayvanın kafatasındaki ilgili bölgenin üzerine yerleştirin. Bir şırınga kullanarak görüntüleme penceresinin kenarına az miktarda akrilik uygulayın.

Son olarak, sızıntıları önlemek için izleme penceresinin kenarlarına az miktarda Tite 4 54 uygulayın. Baş plakasını hayvan tutucuya vidalayın ve bir diseksiyon mikroskobu altında stabiliteyi kontrol edin. Bir pensle hafifçe dokunulduğunda, kafatası baş plakasına göre hareket etmemelidir.

İnceltme işlemine hazırlık olarak sızıntı olmadığından emin olmak için görüntüleme penceresine bir damla salin yerleştirin. Kafatasını, steril pamuklu çubuklar ve basınçlı hava kombinasyonunu kullanarak kurulayın. Kafatasını, mikro drill'de IRF 0 0 7 matkap ucu kullanarak inceltin.

4.000 RPM hızında. İki ila 2,5 milimetre çapındaki dairesel bir alanı çok nazikçe inceltmeye başlayın. Sadece kafatasına neredeyse paralel, hafif süpürme hareketleri kullanın.

Doğrudan aşağıya doğru baskı uygulamayın. Basınçlı hava kullanarak kemik tozlarını temizlemek için her 20 ila 30 saniyede bir delme işlemini durdurun. Delme sırasında verilen bu aralar, kafatasının soğumasını sağlayarak alttaki beyin dokusunda ısıya bağlı hasar oluşmasını önler.

Delme işlemi ilerledikçe, Diplo olarak adlandırılan daha nemli, dikenli kemik tabakasına geçişe dikkat edin. Bu tabakaya ulaşıldığında, matkabı kullanırken ekstra dikkatli olun. Salini ince bölgeye yerleştirip diseksiyon mikroskobu altında inceleyerek kafatasının inceliğini ara ara kontrol edin.

Salin, ısı dağılımını daha da kolaylaştıracaktır. Kafatası inceldikçe daha küçük damarlar görünür hale gelir. Salin altında son inceltme işlemini gerçekleştirmek için dental bir mikro bıçak kullanın.

Mikrobıçak, kafatasının stabilitesi hakkında çok daha fazla taktil geri bildirim sağlar. Bu durum, yalnızca matkap kullanıldığına kıyasla çok daha ince preparasyonlar yapılmasına olanak tanır. Görüntüleme için optimal kafatası kalınlığı 10 ile 30 micrometers arasındadır.

Tüm inceltme işlemi normalde 15 ile 30 dakika arasında sürer. İnce bir kafatası penceresi oluştururken, kafatasının inceliğini epi-floresans altında defalarca kontrol edin. Görünür mikroglia ve damarlanmanın keskinliği ile derinliği, pencerenin görüntüleme için ne zaman hazır olduğuna dair iyi bir gösterge sağlar.

Pencere hazır olduğunda, ince kafatası bölgesine küçük bir damla Cy akrilik yapıştırıcı yerleştirmek için bir milimetre çapında cam pipet kullanın ve üzerine dikkatlice bir parça lamel kapatma camı indirin. Ardından, görüşü engelleyebilecek hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek, fazla yapıştırıcıyı dışarı itmek için kafatasına hafifçe bastırın. Kuruduktan sonra, iki foton görüntüleme hazırlığı kapsamında, lamel kapatma camının üzerinde kalan yapıştırıcıyı bir mikro bıçak kullanarak dikkatlice temizleyin.

İnce kafatası kortikal penceresini salin ile kaplayın ve epi floresan altında ilgi alanını belirleyin. Bölgenin daha sonra görüntülenmesini sağlamak için görüntüleme amaçlı bir fotoğraf makinesi kullanarak fotoğraf çekin. Burada, 920 nanometreye ayarlanmış bir ti safir lazer içeren özel yapım bir iki foton mikroskobu kullanılmıştır.

Floresans, tüm alan tespit modunda bir fotomultiplier tüp veya PMT ve bir 5 81 80 emisyon filtresi kullanılarak tespit edilir. Görüntüleme oturumu boyunca 20x su daldırma objektifi kullanılır. Objektifin maksimum lazer güç çıkışını 50 ile 65 milliwatts arasında ayarlayın.

Ardından, kortikal tabaka bir veya iki olmak üzere, deri yüzeyinin 150 micrometers altına kadar olan bir ilgi alanı seçin. Yeniden görüntülemeyi kolaylaştırmak için aynı görüş alanının bir x, iki x ve üç x dijital yakınlaştırmadaki fotoğraflarını çekin. Kan damarları, sonraki görüntüleme oturumları sırasında aynı görüş alanını kolayca bulmak için referans noktaları olarak kullanılabilir.

Üç x yakınlaştırmada, her biri 80 ila 90 Z adımı içeren ve her beş dakikada bir 0,69 mikrometre adım şeklinde 30 dakikaya kadar birden fazla Z-yığın görüntüsü alın. Bu, mikroglia morfolojisinin ve davranışının zaman içindeki iyi bir örneklemesini sağlar; Z-yığın görüntülerinin alınımı arasında serum fizyolojik seviyesini ve anestezi derinliğini doğrulayın. Gerektiğinde, enjeksiyondan günler önce enjekyon sırasında şırınga ve iğne üzerine tortu birikmesini önlemek için işlem sırasında anestezi kokteylinin orijinal dozunun üçte biri oranında bir takviye dozu verilebilir.

35 gauge iğnenin ve 10 microliter mikro hacimli şırınganın iç astarını, hem iğneyi hem de şırıngayı doldurana kadar boyutlandırma çözeltisini çekerek silolayın. Çözeltinin oda sıcaklığında beş dakika boyunca beklemesine izin verin, ardından çözeltiyi şırıngadan boşaltın, pistonu çıkarın ve şırınga ile iğnenin tamamen kurumasını sağlayın. Son olarak, şırıngayı ve iğneyi deiyonize su ile iyice yıkayın.

Siloizasyon işleminden sonra, yeniden kodlama gerekene kadar bir şırınga ve iğne altı aydan fazla süreyle kullanılabilir. Enjeksiyon gününde, siloize edilmiş bir cam lam üzerine küçük bir damla TAT çözeltisi yerleştirin. Silikonize bir pipet ucu kullanarak, bu damladan mikro hacimli şırıngaya istenen miktarda çözelti yükleyin.

Bir matkap ucu kullanarak, iki foton görüntülerinin alındığı ince kafatası kortikal penceresinin 3 mm rostral veya lateral kısmında, 0,5 mm çapında küçük bir kraniyotomi gerçekleştirin. Bunu başarmak için kafatasını dikkatlice inceltin. Ardından, ince kemik tabakasını çıkarmak için sivri uçlu bir pens kullanın.

35 gauge iğneyi ve şırıngayı kraniyotomi ile hizalamak için bir mikromanipülatör kullanın. Ardından, iğneyi soyulmuş yüzeyin 700 ile 900 mikrometre altına kadar dikkatlice ilerletin. Mikroişlemci kontrollü bir şırınga pompası kullanarak, dakikada 80 nanolitre hızla üç mikrolitre madde iletin.

Bu şekil, ince kafatası kortikal penceresinin implantasyonundan sonra, soyulmuş yüzeyin yaklaşık 50 mikrometre altında, iki foton görüntüleme ile görselleştirilen GFP etiketli mikrogliaları göstermektedir. İnce kafatası kortikal penceresinin implantasyonundan 15 ila 30 dakika sonra, sıfırıncı günde alınan tek iki foton kesitlerinin yanı sıra yedi ve 17 gün sonra alınanlar, inflamatuar saldırıların yokluğunda mikroglialar aktive kalmaya devam ederken pencerelerin berrak kaldığını kanıtlamaktadır. Bu durum, bağışıklık efektör hücreleri ile diğer nöral hücre tipleri arasındaki hem normal hem de inflamatuar etkileşimlerin araştırılmasında bu yöntemin faydasını vurgulamaktadır.

In vivo, HIV nörotoksini TAT enjeksiyonundan altı ve 24 saat sonra alınan Z projeksiyonları, aktive olmuş mikrogliaların belirgin morfolojik değişikliklerini sergilemektedir. Bu durum, akut ve kronik nöroinflamasyon modellerinde mikrogliaların morfolojik değişikliklerini gerçek zamanlı olarak inceleme yeteneğimizi daha da kanıtlamaktadır. Bu prosedürü uygularken, ince bir kafatası penceresinin nasıl hazırlanacağını ve nöroinflamasyonu incelemek için nasıl kullanılacağını size göstermiş olduk.

Hazırlama işleminin kendisinden kaynaklanabilecek herhangi bir hasarı önlemek için kafatasıyla uğraşırken acele etmemeniz gerektiğini unutmamak önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.