Name: Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-19T17:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 7 s
Description: Keşfedin ince kafatası pencere tekniği ile fare mikroglia hücrelerinin iki foton mikroskobisi kullanılarak canlı görüntülenmesini. HIV-1 Tat proteininin neden olduğu nöro-inflamasyon süreçlerini uzun süreli gözlemleyin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Emily A. Kara kafa plaka tasarımı için teşekkür ederim. NIH ödül HAG destek için minnettarız: PO1 MH64570, RO1 MH56838, RO1 MH078989, R21 MH03851 ve bu işi mümkün olmazdı onsuz Geoffrey Waasdorp Pediatrik Nöroloji Fonu cömert desteği. AKM Ulusal Sağlık Enstitüsü, (EY019277), Whitehall Vakfı, Alfred P. Sloan Vakfı ve Kariyer Ödülü Burroughs Wellcome Fonu Biyomedikal Bilimler tarafından finanse edilmektedir. MET Viyana de la recherche tr Sante du Quebec (FRSQ) doktora sonrası eğitim ödülü tarafından finanse edilmektedir. DFM NIH, T32 GM07356 ve T32 AI049815 tarafından finanse Tıp Bilim Adamı Yetiştirme Programı, bir stajyer.

1. Hayvan Görüntüleme için hazırlanması <ol><li> Deneylerde, biz ifade GFP. Mikroglia dahil olmak üzere mononükleer hücre soyları, farelerin 4 Farklı suşlar belirli bir proje ihtiyaçlarını karşılamak için kullanılabilir olması yetişkin CX 3 CR 1 GFP / + fareler kullanın. </li><li> Hayvan artık ağrılı uyaranlara yanıt verir sonra intraperitoneal enjeksiyonu ile 0.05 mg / kg fentanil, 5.0 mg / kg midazolam ve 0.5 mg / kg Medetomidine oluşan üç ilaç kokteyli fare anestezisi. TSCW için 5 Cerrahi hazırlık başlar gibi kuyruk tutam. Cerrahi ve görüntüleme boyunca, anestezi sonrası hipotermi önlemek için ısıtma pedi üzerinde hayvan tutun. Gerekirse, üçte biri bir rapel doz anestezik kokteyl orijinal dozunun orijinal anestezi uçağı geri yüklemek için verilen olabilir. </li><li> Anestezi sırasında gözleri nemli tutmak için koruyucu bir oftalmik merhem Kapak hayvanın gözleri, hayvanın göz kırpma refleksi bastırır. Bir jilet kullanarak hayvanın derisi saç, makaslar, makas, ya da kimyasal yöntemlerle çıkarın. % 10 povidon-iyot çözeltisi ve% 70 etanol ile saçlı deri dezenfekte edin. Tüm cerrahi aletler, cam boncuk sterilizatör, veya% 70 etanol ile dezenfekte ile sterilize otoklava gerekir. </li><li> , Küçük bir makas kullanarak kafa derisi kafatasına kaudal 4-5 mm başlangıç ​​ve ileri gözleri önünde ilerleyen bir orta hat kesi olun. Bu kesi cilt sırasında fare kafası iki foton görüntüleme (Şekil 1) stabilize etmek için kullanılır kafa plaka yapıştırma engel olmaz yeterince uzun olması önemlidir. Diseksiyon kapsamında inceltilerek alan tanımlayın. Kafatası bu alanlarda daha az istikrarlı ve büyük damarların ve meninks altta yatan görüntüleme ile engel olacak şekilde, doğrudan kraniyal sütür üzerinde bulunan ilgi alanları kaçının. </li><li> Kafatasının üst membranlar kuru ve ince cımbız ya da jilet kullanarak ellerinden kazımak için steril bir pamuklu bir bez ile ferrik klorür% 10 çözüm% 100 etanol uygulayın. Kararsız kafası plaka eki zarların sonuçları kaldırmak için başarısız. </li><li> Permabond 910 yapıştırıcı kafa plaka altında izleme penceresinin kenarlarında ince bir tabaka yerleştirin. Yapıştırıcı ile kaplanmış hafif bir basınç (Şekil 1) Hayvanın kafatası ilgi alanı içinde kafa plaka koyun. Kafa plaka sadece kafatasının kemik yapıştırılmış olduğu önemlidir. Kafa plaka ve kafatası arasında sıkışmış herhangi bir deri ya da membranlar bağ istikrar azalacaktır. Akrilat anında bir şırınga bağ tutkal kullanarak görüntüleme penceresi etrafında küçük bir miktar uygulayın. Son olarak, Loctite 454 görüntüleme pencere kenarlarına sızıntılarını önlemek için küçük bir miktar uygulanır. </li><li> (Şekil 1) hayvan sahibinin baş plaka Vida ve forseps bir çift ile hafifçe problama bir diseksiyon kapsamında başkanı plaka stabilite kontrol. Kafa plakasına göre kafatası hiçbir hareket olmamalıdır. Herhangi bir sızıntı olmadığından emin olmak için izleme penceresi üzerine bir damla serum fizyolojik yerleştirin. </li></ol> 2. İnceltilen Kafatası Kortikal Pencere hazırlanması <ol><li> Kafatası inceltme için hazırlık kafatası, steril pamuklu ve basınçlı hava bir arada kullanarak kurutun. 4000 rpm'de Microtorque II matkap steril bir IRF 007 matkap ucu ile kafatası Biz başlangıçta ince. Çok nazik, kafatasının 2-2.5 mm çaplı dairesel alanda incelme başlar. , Kafatasının hemen hemen paralel, sadece hafif süpürme hareketleri kullanın; hiçbir doğrudan aşağı yönlü baskı kullanabilirsiniz. Basınçlı hava kullanarak kemik tozu kaldırmak için her 20-30 saniyede bir delme işlemini durdurun. Bu sondaj tatili, altta yatan bir beyin dokusu ısıya bağlı hasar var kafatası soğumasını bekleyin. <ol class="lalpha"><li> Delme ilerledikçe, nemli süngerimsi kemik tabaka (yani "diploe") geçiş dikkat edin. Bu katman ulaşıldığında, matkap ekstra dikkatli. </li></ol></li><li> Bazen inceltilmiş alana tuzlu yerleştirerek ve diseksiyon kapsamında izleme kafatası inceliği kontrol edin. Tuzlu daha fazla ısı dağılımı sağlayacaktır. Kafatası inceltilmiş olduğu gibi, küçük damarsal görünür hale gelir. </li><li> MicroBlade kafatası istikrar konusunda daha çok dokunsal geribildirim sağlar, tuzlu su altında final incelme elde etmek için steril bir diş MicroBlade kullanın. Bu sadece matkap ile çok daha ince hazırlıkları için sağlar. Deneyimlerimizi, optimal kafatası kalınlığı 10-30 mikron. <ol class="lalpha"><li> Epifloresans birden çok kez altında ince bir kafatası penceresi ilk birkaç girişimleri sırasında kafatasının inceliği kontrol etmek için önemlidir. Görünür mikroglia ve damarsal netlik ve derinlik pencere görüntüleme için hazır olduğunda iyi bir gösterge verir. </li></ol></li><li> Sonra pencere tutkal # 0 coverglass wi ısmarlama bir dikdörtgen parça hazırdır Pencerenin üzerinde her iki tarafta en az 2 mm boyut th. 1.0 mm çaplı cam pipet kullanarak, siyanoakrilat yapıştırıcı inceltilmiş kafatası alan üzerine küçük bir damla koyun ve küçük bir parça aşağı lamel dikkatlice düşük, daha sonra aşırı miktarda tutkal sıkmak kafatası karşı hafifçe bastırın. Optik opak hale altında hapsolmuş hava alanı yol açacağından cam ve tutkal arasında kabarcık oluşumunu önlemek için önemlidir. Ne zaman kuru saydam kalır ve aynı zamanda kemik ve kafatası ince ve saydam pencerenin altında tutmak membran regrowth engeller çünkü siyanoakrilat yapıştırıcı kullanılır. Kapak cam üstünde herhangi bir yapıştırıcı varsa, kapağı cam ve tutkal kuruduktan sonra dikkatlice kaldırmak için MicroBlade kullanın. </li><li> Bir analjezik (örneğin, Buprenorfin 2 mg / kg alt-kutanöz), kilo kaybı, salivasyon, piloerection, solunum sesleri, hareket yemek veya içmek için isteksizlik dahil olmak üzere, ameliyat sonrası hemen idare ve yeniden uygulandığında ağrı herhangi bir işaret vs. </li></ol> 3. İki foton Görüntüleme <ol><li> Iki foton görüntüleme için hazırlık olarak, tuzlu su ile TSCW kapak ve Epifloresans altında ilgi alanı (Şekil 2) bulun. Sonraki görüntü alanı sağlamak için, fotoğrafik bir kamerayı kullanarak bir resim çekmek. </li><li> Sapphire lazer 920 nm ayarlı iki foton görüntüleme için, bir Ti ile ısmarlama iki foton mikroskop 6 kullanın. Floresans tüm alan algılama modu ve 580/180 emisyon filtresi photomultiplier tüp kullanılarak tespit edilir. A 20X su daldırma lens (0.95 NA) görüntüleme oturum boyunca kullanılır. 50 ve 65 mW arasında maksimum çıkış amacı lazer güç ayarlanır. </li><li> Kortikal tabakalar halinde, ilgi alanı I veya II (pial yüzeyinin altında 150 mikron kadar). Yeniden görüntüleme kolaylaştırmak için 1X, 2X, aynı alanda fotoğraflarını çekmek ve 3X dijital zoom. Kan damarları, aynı alanda kolayca sonraki görüntüleme oturumları sırasında bulmak için nirengi noktaları gibi hizmet edebilir. 80-90 ile bir zoom 3X, çoklu z yığınları altında Z-her yığını ve 0.69 mikron adım adımları (mikrogliyal morfoloji ve davranış zamanla iyi bir örnekleme sağlayan 30 dakika için her 5 dakikada elde edilebilir Şekil 3). Z yığınlarının satın almalar arasında, bir TSCW üzerine tuzlu su seviyesi, yanı sıra hayvan anestezi derinliği doğrulamanız gerekir. </li></ol> 4. HIV-1 nörotoksin, Tat enjeksiyon <ol><li> Birincisi, 35 gauge iğne ve Tat birikmesini önlemek için 10 mcL Microvolume şırınga iç astar silanize. Silanizing solüsyonu (Sigmacote) hem iğne ve şırınga doldurana kadar çekin. Oda sıcaklığında 5 dakika oturup çözüm izin verin. Boş şırınga çözüm, piston kaldırmak ve şırınga ve iğne tamamen kurumasını bekleyin. Son olarak, deiyonize su ile iyice şırınga ve iğne yıkayın. </li><li> Çapı da daha küçük bir matkap ucu kullanarak 3 mm rostral veya iki foton görüntüler elde edilmiştir TSCW lateral yapın ve küçük bir kraniotomi 0,5 mm, keskin uçları ile forseps bir çift dikkatle kadar kafatası inceltme inceltilmiş katman kaldırabilirsiniz. kolayca kemik. Biz, 3-eksenli mikromanipülatör ve kraniotomi iğne ucu kadar astar sonra monte bir Ultramicropump III şırınga pompası tarafından kontrol edilen 35 gauge iğne ile donatılmış 10 mcL Microvolume şırınga kullanımı, altında 900 mm ile 700 derinliğe kadar dikkatli bir şekilde gelişmiş. pial yüzey 3 mcL Tat 1-72 (veya diğer pro-inflamatuar ilaçlar) ya da tuzlu su (veya kontrol aracı) 80 nL / dak teslim edilir. </li></ol> 5. Hayvan Barınakları <ol><li> Hayvan, tek bir gün içinde birden çok kez görüntülenmiş ise, oftalmik merhem ve görüntüleme oturumları arasında rahatsızlık veya kafatası hasar görmesini önlemek için vazelin karışımı ile kafatası açık bir alanı kapsayacak. Küçük baş-plaka (bkz. Şekil 1B) destek köprü bağlantısını kesin ve kolay erişilebilir yiyecek ve su ile ısıtılmış bir kafeste hayvan. Bütün hayvanlar her zaman cerrahi sonrası tek başına ev sahipliği için. Belirli bir günde bir hayvan için görüntüleme oturumlar tamamlandıktan sonra, dikkatle, tüm baş plakalı kaldırmak ve kafatası üzerinde # 6 ya da daha küçük bir dikiş ile cilt sütür. Yine, deneysel gün arasında kolayca erişilebilir yiyecek ve su ile tek tek hayvanların ev. Hayvanlar için günlük herhangi bir stres belirtileri, ağrı, ya da enfeksiyon kontrol edin. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 cerrahi ve iki foton görüntüleme (A) ve kafa plaka tasarım (B) için hayvan Sabitleme. <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 GFP etiketli mikroglia Epifloresans ile görüntülendi. jove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2059/2059fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. GFP etiketli mikroglia TSCW implantasyonu sonra iki foton görüntüleme ile görüntülendi pial yüzeyinin altında, yaklaşık 50 mikron TSCW implantasyonu (gün 0) 15-30 dakika sonra alınan tek iki foton bölümler yanı sıra, 7 ve 17 gün sonra, mikroglia inflamatuar hakaret yokluğunda inaktive devam ederken, pencereler açık kalmasını göstermektedir. Z-projeksiyonlar 6 alınmış ve 24 saat aktif mikroglia HIV nörotoksin tat sergi etkileyici morfolojik değişiklikler sonrası enjeksiyon. Ölçek çubuğu: 10 mm.

<ol><li>Mostany, R., &amp, P. ortera-C. ailliau, C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+craniotomy+surgery+procedure+for+chronic+brain+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A craniotomy surgery procedure for chronic brain imaging.</a> J Vis Exp. 12, (2008).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4, (2009).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nature Protoc. 5, 213-21 (2010).</li>
<li>Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+fractalkine+receptor+CX%283%29CR1+function+by+targeted+deletion+and+green+fluorescent+protein+reporter+gene+insertion%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion.</a> Mol Cell Biol. 20, 4106-41 (2000).</li>
<li>Mrsic-Flogel, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homeostatic+regulation+of+eye-specific+responses+in+visual+cortex+during+ocular+dominance+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Homeostatic regulation of eye-specific responses in visual cortex during ocular dominance plasticity.</a> Neuron. 54, 961-96 (2007).</li>
<li>Majewska, A., Yiu, G., &amp, Y. uste, R, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+custom-made+two-photon+microscope+and+deconvolution+system%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">A custom-made two-photon microscope and deconvolution system.</a> Pflugers Arch. 441, 2-3 (2000).</li>
<li>Sharer, L. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathology+of+HIV-1+infection+of+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22A+review.+J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Pathology of HIV-1 infection of the central nervous system.</a> A review. J Neuropathol Exp Neurol. 51, (1992).</li>
<li>Everall, I. P., Aliberti, J., &amp, B. alcerzyk, M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+density+in+the+superior+frontal+and+temporal+gyri+does+not+correlate+with+the+degree+of+human+immunodeficiency+virus-associated+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+%28Berl%22%5BJournal%5D)">Neuronal density in the superior frontal and temporal gyri does not correlate with the degree of human immunodeficiency virus-associated dementia.</a> Acta Neuropathol (Berl. 88, 538-53 (1994).</li>
<li>Masliah, E., Banati, R. B., &amp, Q. uinlan, M, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+injury+is+a+pathological+substrate+for+human+immunodeficiency+virus-related+cognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Dendritic injury is a pathological substrate for human immunodeficiency virus-related cognitive disorders.</a> Ann Neurol. 42, 963-96 (1997).</li>
<li>Everall, I. P., Banati, R. B., &amp, U. pender, B, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+synaptic+density+is+reduced+in+mild+to+moderate+human+immunodeficiency+virus+neurocognitive+disorder%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Pathol%22%5BJournal%5D)">Cortical synaptic density is reduced in mild to moderate human immunodeficiency virus neurocognitive disorder.</a> Brain Pathol. 9, (1999).</li>
<li>Glass, J. D., Fedor, H., Wesselingh, S. L., &amp, M. cA. rthur, C, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocytochemical+quantitation+of+human+immunodeficiency+virus+in+the+brain%3A+correlations+with+dementia%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Immunocytochemical quantitation of human immunodeficiency virus in the brain: correlations with dementia.</a> Ann Neurol. 38, (1995).</li>
<li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28, (2000).</li>
</ol>

HIV-1 ile ilişkili bilişsel açıkları (EL) için gerçek bir substrat muhtemelen HIV-1 mononükleer fagositler serbest pro-inflamatuvar mediatörlerin neden olduğu yıkım, sinaptik mimarisi olduğunu artan bir fikir birliği yoktur. Mikroglia aktivasyonu, çok çekirdekli dev hücreler ve astrositik hipertrofisi nedeniyle gliozis 7 CNS HIV-1 enfeksiyon ve enflamasyonun nonspesifik işaretlerinden kabul edilir. Buna karşılık, sinaptik karmaşıklığı kaybı, CNS 8,9,10,11 makrofaj yükünün yanı sıra premortem nörolojik hastalığın şiddeti ile korele edilmiştir. Ancak, mikroglia, periferik infiltre eden makrofaj ve EL ile hasta nöronlar arasındaki dinamik etkileşimler sadece geleneksel immünositokimyasal çalışmalarda elde edilen geleneksel statik işleme kullanarak modellenebilir olamaz. Laboratuarlarımızda Son çalışmalar, periferik ve santral mononükleer hücreleri ve nöronlar arasındaki bu etkileşimlerin en azından bazı HIV-1 proteininin Tat 1-72 stereotaktik beyin parankiminin (Lu, Marker, Tremblay, içine enjeksiyon bölümünde modellenebilir olduğunu ileri sürmüşlerdir Qi ve Gelbard, yayınlanmamış veri). Bu nedenle, neuroAIDS için izlenebilir küçük bir hayvan modeli, in vivo iki foton görüntüleme monosit kökenli makrofajlar, beyin ikamet mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşimi incelemek için uygulamaya karar verdi . Açık-kafatası ya da inceltilmiş-kafatası hazırlıkları zaman bir kısa bir süre (saat) kortikal mimari bir tek muayene, subakut olaylar zaman elbette artifactually, cerrahi manipülasyon nedeniyle mikroglia / makrofaj aktive olmadan bu hazırlıkların kullanmak değil. Ilgilenen Alan İnceleme göze iken kalvarial pencere. Burada basit bir şekilde yapıştırma TSCW yenileyici kalvaryumda önlemenin yanı sıra ≥ 3 hafta translusensi sağlamak cam lamel inceltilmiş kafatası alan üzerinde küçük bir parça bu sınırlama engellemeyi göstermektedir. Biz daha bu tekniği bize (CX 3 CR 1 / GFP için heterozigot farelerin korteks HIV Tat 1-72 stereotaktik enjeksiyon yanıt yanı sıra beyin-yerleşik mikroglia beyin mikrovasküler giren periferik monositler davranışlarını izlemek için izin verdiğini göstermek mononükleer soy hücreleri belirlemek için). Bu teknik, farklı genetik geçmişleri olan fareler üzerinde kullanmak için kolayca adapte olabilir, örneğin, rutin heterozigot CX 3 CR 1 / GFP kullanmak X Thy-1, monosit kökenli makrofajlar, beyin ikamet mikroglia ve nöronlar arasındaki etkileşimi araştırmak için YFP 12 fareler EL ile ilgili nöro in vivo modeller. Bizim TSCW hazırlanması, araştırmacılar, çevre ve hayvan deneysel tedavi öncesi ve sonrasında sürekli görüntülü hangi hafta süreleri, üzerinde oluşabilir MSS arasında hücre-hücre etkileşimleri çalışma sağlar. Böylece, her hayvan, kendi kontrolü olarak hizmet verebilir. Bu TSCW model için bir ihtar soruşturma kapsamında hedef hücreleri ya genetik olarak geliştirilmiş floresan proteinleri (eXFP) ifade veya kalvaryumda mekanik ihlali olmadan bir floresan boya ile etiketlenmiş tasarlanmıştır gerektiğini ve bu eXFP ifade yeterince güçlü olmalıdır haftalık bir süre içinde tekrarlanan görüntüleme seans sonrası hücresel mimarisi görüntülenmiştir izin.

<table><tbody><tr><td>Fentanil Sitrat</td><td>Hospira Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midazolam hidroklorür</td><td>Baxter Internationl Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medetomidin hidroklorür (Domitor)</td><td>Pfizer Pharma GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isıtma pedleri</td><td>Beyond Bodi Heat</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tobramisin ve dekzametazon oftalmik pomad (TobraDex)</td><td>Alcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Povidon-iyot %10 çözelti</td><td>Betadine Puredue Pharma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ferrik klorür %10 çözelti</td><td>Ricca Chemical Company</td><td>3120-32</td><td></td></tr><tr><td>Metil siyanoakrilat 910</td><td>Permabond</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilat 454</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TEETS protez materyali çapraz bağlı metil metakrilat</td><td>Co-Oral-lte Dental Mfg CO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtorque II angldruva kiti</td><td>Pearson Assessments</td><td>R14-0002</td><td></td></tr><tr><td>IRF 007 frez uçları</td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td></td></tr><tr><td>Norland bükülebilir mikro bıçak tam radyus</td><td>Salvin Dental</td><td>BLAD-NORLAND-69</td><td></td></tr><tr><td>Siyanoakrilat</td><td>The Original Superglue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>#0 cam lamel</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>63750-01</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;l Mikro hacimli şırınga</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>ILS010LT</td><td></td></tr><tr><td>UltraMicroPump III</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>UMP3-1</td><td></td></tr><tr><td>35 gauge NanoFil iğne</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>NL35BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Bilyalı Değirmen, Karbür uçlar #1/4</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>501860</td><td></td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SL2-100</td><td></td></tr><tr><td>Fotomultiplier tüp</td><td>Hamamatsu Corp.</td><td>HC125-02</td><td></td></tr><tr><td>Ti:Safir lazer Mai-Tai</td><td>Newport Corp.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kronik İki foton için İnce kafatası pencere tekniği in vivo</emnöro-inflamasyon modelleri murin mikroglia> görüntüleme

A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation

Geleneksel nörobilim in vivo fare ve merkezi sinir sisteminin iki foton görüntüleme veya açık kafatası 1,2 veya 3 hazırlıkları inceltilmiş-kafatası yer vardır . Açık kafatası tekniği çok yönlü olmakla birlikte invazif ve mikroglial aktivasyon neden olabileceğinden, mikroglia eğitim için optimal değildir. Inceltilmiş kafatası yaklaşım minimal invaziv olmasına rağmen, kronik görüntüleme için gerekli kafatasının yeniden inceltme tekrarlanan doku hasarı ve mikrogliyal aktivasyon riskleri artırır ve görüntüleme oturumları sınırlı sayıda sağlar. Burada iki foton mikroskopi kullanılarak zaman uzun bir süre boyunca in vivo fare mikroglia izlenmesi için kronik bir kafatası ince pencere yöntemi mevcut. Biz istikrarlı, erişilebilir, inceltilmiş kafatası kortikal pencere (TSCW) aralıklı gözlem üç hafta boyunca yarı saydam kalır bir apposed cam lamel nasıl hazırlanacağını gösteriyor. Bu TSCW hazırlık, çok daha inceltme açık kraniotomi veya tekrarlanan kafatası daha mikroglia aktivasyonu açısından immünolojik asal keyfi bir görüntüleme oturumları sayısı ve haftalık bir süre içinde sağlar. ≤ 150 mm pial yüzeyinin altında gelişmiş yeşil flüoresan protein ile mikroglia görselleştirmek için CX 3 CR 1 GFP / + fareler 4 TSCW hazırlar. Biz de bu hazırlık dayanıklı microgliosis tetikleme kapasitesine sahiptir TSCW bitişik Tat HIV-1 nörotoksik protein, stereotaktik beyin enjeksiyonları ile birlikte kullanılabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, bu yöntem, HIV Associated Nörobilişsel Bozukluğu (EL) ve yöntemine işaret bileşeni ile diğer nörodejeneratif hastalıklar modelleri canlı beyin zamanla mikrogliyal morfoloji ve motilite değişiklikleri incelemek için son derece yararlı.

Biz sürekli fare mikroglia görselleştirme ve dolaşımdaki monositler için bir yöntem tarif<em&gt; In vivo</em&gt; Transkraniyal iki foton mikroskopi kullanılarak saat, gün veya hafta içinde. Biz HIV-1 düzenleyici protein Tat komşu stereotaktik enjeksiyonu ile aktif hale getirilebilir latent mikroglia aralıklı gözlem sağlar seyrelmiş bir kafatası pencere nasıl hazırlanacağını gösteriyor.

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo</emNöro-inflamasyon Modelleri murin mikroglia> Görüntüleme

Geleneksel olarak nörobilimde, fare merkezi sinir sisteminin in vivo iki foton görüntülemesi, ya açık kafatası yönteminin1,2 kullanımını ya da ...

HIV enfekte erişkin hastalarda nöroinflamasyon, normal sinaptik sinyallemeyi engelleyerek soyutlama, sözel akıcılık, dikkat, öğrenme, yeni bilgiler ve hafıza ile ilgili zorlukları içeren nörobilişsel eksikliklere yol açar. HIV-1 tat, burada HIV'li hastalarda görülen sinaptik disfonksiyonu taklit edebilen inflamatuar moleküllerin salgılanmasını indükler. Mikroglialar dahil olmak üzere mononükleer hücrelerde GFP eksprese eden erişkin fareler, ince kafatası iki foton mikroskopisi kullanılarak HIV-1 tat kaynaklı nöroinflamasyonu araştırmak için kullanılır.Tat enjeksiyonu sonrası mikroglia yanıtları in vivo olarak görüntülenebilir. Elde edilen görüntüler, mikroglial uzantıların kısalması ve kalınlaşmasının yanı sıra fagositoz kupuna benzer yapıların oluşumunu ve serebral mikro damarlardaki periferik monosit trafiğini göstermektedir. Merhaba, ben Rochester Üniversitesi, Sinirsel Gelişim ve Hastalık Merkezi ile Harris Galbard laboratuvarından Dan Marker.Merhaba, ben Rochester Üniversitesi Nörobiyoloji ve Anatomi Bölümü'ndeki Esca Laboratuvarı'ndan EF Trombley. Merhaba, ben de Albas Lab'dan Shain Luu. Bugün size ince kafatası preparatı kullanarak iki foton görüntüleme prosedürünü göstereceğiz.Bu prosedürü kronik nöroinflamasyonu incelemek için kullanıyoruz. O halde, burada gösterilen deneye başlayalım. Mikroglia dahil olmak üzere mononükleer hücre hatlarında GFP eksprese eden OT'ler kullanılır.Belirli bir projenin ihtiyaçlarını karşılamak için farklı fare suşları kullanılabilir. Cerrahi işlem için fentanil, midazolam ile anestezi uygulanmış bir farenin hazırlıklarına başlayın. Öncelikle, hayvanın kuyruk sıkıştırma gibi ağrılı stimülasyonlara artık yanıt vermediğinden emin olun.Anestezi sonrası hipotermiyi önlemek için hayvanı bir ısıtma pedine yerleştirin. Ardından, gözlerin nemli kalmasını sağlamak için hayvanın gözlerini koruyucu bir oftalmik pomad ile kapatın. Tüm cerrahi aletler otoklavlanmış veya cam boncuk sterilizatörü ile sterilize edilmiş olmalıdır; aletleri %70 etanol içinde bekleterek daha fazla dezenfekte edin.Makas kullanarak hayvanın kafa derisindeki tüyleri temizleyin, ardından bölgeyi %10'luk povidon iyot çözeltisi ve %70'lik etanol ile dezenfekte edin. Küçük bir makas kullanarak kafa derisinde, kafatasının dört ila beş milimetre kaudalından başlayan ve gözlerin önüne kadar ilerleyen orta hat kesisi yaparak cerrahi işleme başlayın. Bu kesi, iki foton görüntüleme sırasında fare başını sabitleyen plakanın yapıştırılmasına derinin engel olmayacağı kadar uzun olmalıdır.Ardından, kafatası üzerindeki membranları kurutmak için steril pamuklu çubuğa %100 ethanol uygulayın. Bu membranları ince bir pens yardımıyla sıyırarak uzaklaştırın. Membranlar temizlenmezse, kafa plakası sabitleme işlemi stabil olmayacaktır.Bir diseksiyon mikroskobu altında, inceltilecek bölgeyi belirleyin. Kafatası bu bölgelerde daha az stabil olduğundan ve alttaki büyük damarlar ile meningesler, ilgi alanına yönelik görüntüleme penceresine gönderilen görüntüleri engelleyeceğinden, doğrudan kranial sütürlerin üzerinde yer alan ilgi alanlarından kaçının. Ardından, bir pamuklu çubuk kullanarak %10'luk ferric chloride çözeltisi ile kafatasını tekrar deneyin.Kafa plakasının altındaki görüntüleme penceresinin kenarlarına ince bir tabaka perma bond, nine 10 yapıştırıcı sürün. Ardından, yapıştırıcının tutunması için hafifçe bastırarak plakayı hayvanın kafatasındaki ilgili bölgenin üzerine yerleştirin. Bir şırınga kullanarak görüntüleme penceresinin kenarına az miktarda akrilik uygulayın.Son olarak, sızıntıları önlemek için izleme penceresinin kenarlarına az miktarda Tite 4 54 uygulayın. Baş plakasını hayvan tutucuya vidalayın ve bir diseksiyon mikroskobu altında stabiliteyi kontrol edin. Bir pensle hafifçe dokunulduğunda, kafatası baş plakasına göre hareket etmemelidir.İnceltme işlemine hazırlık olarak sızıntı olmadığından emin olmak için görüntüleme penceresine bir damla salin yerleştirin. Kafatasını, steril pamuklu çubuklar ve basınçlı hava kombinasyonunu kullanarak kurulayın. Kafatasını, mikro drill'de IRF 0 0 7 matkap ucu kullanarak inceltin.4.000 RPM hızında. İki ila 2,5 milimetre çapındaki dairesel bir alanı çok nazikçe inceltmeye başlayın. Sadece kafatasına neredeyse paralel, hafif süpürme hareketleri kullanın.Doğrudan aşağıya doğru baskı uygulamayın. Basınçlı hava kullanarak kemik tozlarını temizlemek için her 20 ila 30 saniyede bir delme işlemini durdurun. Delme sırasında verilen bu aralar, kafatasının soğumasını sağlayarak alttaki beyin dokusunda ısıya bağlı hasar oluşmasını önler.Delme işlemi ilerledikçe, Diplo olarak adlandırılan daha nemli, dikenli kemik tabakasına geçişe dikkat edin. Bu tabakaya ulaşıldığında, matkabı kullanırken ekstra dikkatli olun. Salini ince bölgeye yerleştirip diseksiyon mikroskobu altında inceleyerek kafatasının inceliğini ara ara kontrol edin.Salin, ısı dağılımını daha da kolaylaştıracaktır. Kafatası inceldikçe daha küçük damarlar görünür hale gelir. Salin altında son inceltme işlemini gerçekleştirmek için dental bir mikro bıçak kullanın.Mikrobıçak, kafatasının stabilitesi hakkında çok daha fazla taktil geri bildirim sağlar. Bu durum, yalnızca matkap kullanıldığına kıyasla çok daha ince preparasyonlar yapılmasına olanak tanır. Görüntüleme için optimal kafatası kalınlığı 10 ile 30 micrometers arasındadır.Tüm inceltme işlemi normalde 15 ile 30 dakika arasında sürer. İnce bir kafatası penceresi oluştururken, kafatasının inceliğini epi-floresans altında defalarca kontrol edin. Görünür mikroglia ve damarlanmanın keskinliği ile derinliği, pencerenin görüntüleme için ne zaman hazır olduğuna dair iyi bir gösterge sağlar.Pencere hazır olduğunda, ince kafatası bölgesine küçük bir damla Cy akrilik yapıştırıcı yerleştirmek için bir milimetre çapında cam pipet kullanın ve üzerine dikkatlice bir parça lamel kapatma camı indirin. Ardından, görüşü engelleyebilecek hava kabarcıkları oluşmamasına dikkat ederek, fazla yapıştırıcıyı dışarı itmek için kafatasına hafifçe bastırın. Kuruduktan sonra, iki foton görüntüleme hazırlığı kapsamında, lamel kapatma camının üzerinde kalan yapıştırıcıyı bir mikro bıçak kullanarak dikkatlice temizleyin.İnce kafatası kortikal penceresini salin ile kaplayın ve epi floresan altında ilgi alanını belirleyin. Bölgenin daha sonra görüntülenmesini sağlamak için görüntüleme amaçlı bir fotoğraf makinesi kullanarak fotoğraf çekin. Burada, 920 nanometreye ayarlanmış bir ti safir lazer içeren özel yapım bir iki foton mikroskobu kullanılmıştır.Floresans, tüm alan tespit modunda bir fotomultiplier tüp veya PMT ve bir 5 81 80 emisyon filtresi kullanılarak tespit edilir. Görüntüleme oturumu boyunca 20x su daldırma objektifi kullanılır. Objektifin maksimum lazer güç çıkışını 50 ile 65 milliwatts arasında ayarlayın.Ardından, kortikal tabaka bir veya iki olmak üzere, deri yüzeyinin 150 micrometers altına kadar olan bir ilgi alanı seçin. Yeniden görüntülemeyi kolaylaştırmak için aynı görüş alanının bir x, iki x ve üç x dijital yakınlaştırmadaki fotoğraflarını çekin. Kan damarları, sonraki görüntüleme oturumları sırasında aynı görüş alanını kolayca bulmak için referans noktaları olarak kullanılabilir.Üç x yakınlaştırmada, her biri 80 ila 90 Z adımı içeren ve her beş dakikada bir 0,69 mikrometre adım şeklinde 30 dakikaya kadar birden fazla Z-yığın görüntüsü alın. Bu, mikroglia morfolojisinin ve davranışının zaman içindeki iyi bir örneklemesini sağlar; Z-yığın görüntülerinin alınımı arasında serum fizyolojik seviyesini ve anestezi derinliğini doğrulayın. Gerektiğinde, enjeksiyondan günler önce enjekyon sırasında şırınga ve iğne üzerine tortu birikmesini önlemek için işlem sırasında anestezi kokteylinin orijinal dozunun üçte biri oranında bir takviye dozu verilebilir.35 gauge iğnenin ve 10 microliter mikro hacimli şırınganın iç astarını, hem iğneyi hem de şırıngayı doldurana kadar boyutlandırma çözeltisini çekerek silolayın. Çözeltinin oda sıcaklığında beş dakika boyunca beklemesine izin verin, ardından çözeltiyi şırıngadan boşaltın, pistonu çıkarın ve şırınga ile iğnenin tamamen kurumasını sağlayın. Son olarak, şırıngayı ve iğneyi deiyonize su ile iyice yıkayın.Siloizasyon işleminden sonra, yeniden kodlama gerekene kadar bir şırınga ve iğne altı aydan fazla süreyle kullanılabilir. Enjeksiyon gününde, siloize edilmiş bir cam lam üzerine küçük bir damla TAT çözeltisi yerleştirin. Silikonize bir pipet ucu kullanarak, bu damladan mikro hacimli şırıngaya istenen miktarda çözelti yükleyin.Bir matkap ucu kullanarak, iki foton görüntülerinin alındığı ince kafatası kortikal penceresinin 3 mm rostral veya lateral kısmında, 0,5 mm çapında küçük bir kraniyotomi gerçekleştirin. Bunu başarmak için kafatasını dikkatlice inceltin. Ardından, ince kemik tabakasını çıkarmak için sivri uçlu bir pens kullanın.35 gauge iğneyi ve şırıngayı kraniyotomi ile hizalamak için bir mikromanipülatör kullanın. Ardından, iğneyi soyulmuş yüzeyin 700 ile 900 mikrometre altına kadar dikkatlice ilerletin. Mikroişlemci kontrollü bir şırınga pompası kullanarak, dakikada 80 nanolitre hızla üç mikrolitre madde iletin.Bu şekil, ince kafatası kortikal penceresinin implantasyonundan sonra, soyulmuş yüzeyin yaklaşık 50 mikrometre altında, iki foton görüntüleme ile görselleştirilen GFP etiketli mikrogliaları göstermektedir. İnce kafatası kortikal penceresinin implantasyonundan 15 ila 30 dakika sonra, sıfırıncı günde alınan tek iki foton kesitlerinin yanı sıra yedi ve 17 gün sonra alınanlar, inflamatuar saldırıların yokluğunda mikroglialar aktive kalmaya devam ederken pencerelerin berrak kaldığını kanıtlamaktadır. Bu durum, bağışıklık efektör hücreleri ile diğer nöral hücre tipleri arasındaki hem normal hem de inflamatuar etkileşimlerin araştırılmasında bu yöntemin faydasını vurgulamaktadır.In vivo, HIV nörotoksini TAT enjeksiyonundan altı ve 24 saat sonra alınan Z projeksiyonları, aktive olmuş mikrogliaların belirgin morfolojik değişikliklerini sergilemektedir. Bu durum, akut ve kronik nöroinflamasyon modellerinde mikrogliaların morfolojik değişikliklerini gerçek zamanlı olarak inceleme yeteneğimizi daha da kanıtlamaktadır. Bu prosedürü uygularken, ince bir kafatası penceresinin nasıl hazırlanacağını ve nöroinflamasyonu incelemek için nasıl kullanılacağını size göstermiş olduk.Hazırlama işleminin kendisinden kaynaklanabilecek herhangi bir hasarı önlemek için kafatasıyla uğraşırken acele etmemeniz gerektiğini unutmamak önemlidir. Şimdilik bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

a-thin-skull-window-technique-for-chronic-two-photon-vivo-imaging

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video ve tamamlayıcı malzeme, kronik bir...

Fare Visual Cortex İnceltilen kafatası Hazırlık Kronik Görüntüleme

Biz milimetre yayılan ve beyin iltihabı olmadan ay dayanır farenin kafatasında bir görüntüleme penceresi oluşturmak için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem de iki foton mikroskopi kullanılarak kan akımı, hücresel dinamiği ve hücre / vasküler yapının uzunlamasına çalışmalar için uygundur.

Fare Beyin Uzun vadeli Görüntüleme için Parlak ve Takviyeli inceltilmiş-kafatası Pencere

Kaynak: Bisht, K.,  et al. Farelerde nöro-immün dinamiklerin tekrarlayan in vivo görüntülemesini gerçekleştirmek için hassas beyin haritalaması. J. Vis. Uzm. (2020)Bu video, kafatası implantı olan transgenik bir farede nöro-immün dinamiklerin floresan görüntülemesini göstermektedir. Vasküler ve nöronal stabilite, nöronal aktiviteye karşı immün yanıtları yansıtan dinamik mikroglial değişikliklerle birlikte görüntülenir.

Kafatası İmplantı Kullanılarak Nöro-İmmün Dinamiklerin Floresan Görüntülemesi

Source: Maruoka, H., et. al. uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi. J. Vis. Exp. (2022) Bu video, görsel stimülasyon sırasında uyanık bir farede nöronal aktiviteyi ve mikroglial dinamikleri görüntülemek için iki fotonlu bir mikroskopi prosedürünü göstermektedir. kalsiyum geçişleri ve hücresel etkileşimler.

Uyanık Bir Farede Mikroglial Dinamiklerin ve Nöronal Aktivitenin Eş Zamanlı Görüntülenmesi

Kaynak: Kamei, R., et. al., Fare Hipokampüsündeki Mikroglia'nın İn Vivo Kronik İki Foton Görüntülemesi. J. Vis. Uzm. (2022)Video, hipokampal CA1 (Cornu ammonis 1) ve dentat girustaki mikroglial dinamiklerin in vivo iki foton mikroskobu için kurulum ve görüntüleme sürecini göstererek optimum optik hizalama ve yapısal bütünlük değerlendirmesi sağlar.

Fare hipokampüsünde mikroglial dinamiklerin in vivo iki fotonlu görüntülenmesi

Akut beyin travması bugüne kadar yeterli bir tedavisi olmayan ciddi bir yaralanma olduğunu. Multiphoton mikroskopi uzunlamasına akut beyin travması gelişim sürecini inceleyerek ve kemirgenlerde terapötik stratejiler sondalama sağlar. Beynin in vivo iki foton görüntüleme ile incelenmiştir akut beyin travması iki model bu protokolde gösterilmiştir.

Boyuna İki foton görüntüleme ile takip Farelerde Akut Beyin Travma

Bu protokol, nöro-glio-vasküler yapıların uzunlamasına görüntülemesi, hem sağlıklı hem de hastalıklı koşullarda fonksiyon ve fonksiyon için kullanılabilecek kronik bir kafatası pencere implantasyon tekniğini açıklamaktadır. Genellikle tercih edilirken bazı kritik sınırlamalara sahip olan transkraniyal görüntüleme yaklaşımına tamamlayıcı bir alternatif olarak hizmet vermektedir.

Farelerde Nöro-İmmün Dinamiğin Vivo Görüntülemesinde Tekrarlayan Performans için Hassas Beyin Haritalaması

Burada, uyanık, baş kısıtlı farelerde beyin hücrelerinin uzunlamasına görüntülenmesi için kronik bir kraniyal pencerenin implantasyonu için bir protokol sunulmaktadır.

Uyanık Farelerde Tekrarlanan In Vivo Görüntüleme için Kraniyal Pencerenin İmplantasyonu

Bu yazıda, fare hipokampal CA1'deki istirahat mikrogliasının kronik in vivo gözlemi için hassas kontrollü cerrahi ve iki foton mikroskobu kullanılarak bir yöntem açıklanmaktadır.

İn Vivo Fare Hipokampüsünde Mikroglia'nın Kronik İki Foton Görüntülemesi

Burada, uyanık farelerde mikroglial dinamiklerin ve nöronal aktivitenin eşzamanlı görüntülenmesi için adeno ilişkili virüs enjeksiyonunu kraniyal pencere implantasyonu ile birleştiren bir protokolü tanımladık.

Uyanık Farelerde Mikroglial Dinamiğin ve Nöronal Aktivitenin Eşzamanlı Görüntülenmesi

Bu çalışma, farelere tekrarlayan bir travmatik beyin hasarının verilmesini ve iki foton mikroskobu kullanılarak nöron eksprese edilen bir EGFP'nin daha sonraki intravital görüntülemesi için bir kraniyal pencerenin eşzamanlı implantasyonunu göstermektedir.

Kapalı Kafatası Travmatik Beyin Hasarı ve Kraniyal Penceresi Olan Farelerde Floresan Protein Ekspresyonunun İki Foton Mikroskobu Kullanılarak İntravital Görüntülenmesi

Keşfedin ince kafatası pencere tekniği ile fare mikroglia hücrelerinin iki foton mikroskobisi kullanılarak canlı görüntülenmesini. HIV-1 Tat proteininin neden olduğu nöro-inflamasyon süreçlerini uzun süreli gözlemleyin.

Kronik İki foton için İnce kafatası Pencere Tekniği In vivo Görüntüleme

Daha fazla video keşfet