Name: HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-07T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 8 s
Description: Öğrenin, canlı konfokal mikroskopi kullanarak T hücreleri arasında HIV transferini görselleştirme yöntemini. Bu teknik, virolojik sinapslar arasındaki viral iletim dinamiklerini incelemek için güvenilir bir protokol sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu derlemede, Ulusal Sağlık hibe Enstitüleri, AI074420-02, Burroughs Wellcome Araştırmacı Ödülü, BKC için Hirschl&#39;ın Kariyer Bilim Adamı Ödülü ve NSF Biophotonics Bilim ve Teknoloji Merkezi, Kooperatif Sözleşmesi PHY012099, TH UCD Sağlık Sistemi Araştırma Ödülü tarafından desteklenen UCD CTSC NCRR ULRR024146.

Bu yöntem bildirilen araştırma <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/323/5922/1743">Hübner ve ark Bilim 323: 1743-1747 (2009)</a> . 1. Genel bakış HIV hücre-hücre yayılmasını başlangıçta donör hücreleri ve birincil CD4 + T lenfositleri acceptor hücreleri 1,2,3 olarak HIV ile enfekte Jurkat hücreleri kullanılarak tarif edilmiştir. Bu çalışmalarda, virüs sabit hücrelerin antikor boyama ile tespit edildi. Canlı hücrelerde virüs hücreye transfer izlemek için, biz HIV, HIV Gag-iGFP 4 olarak adlandırılan bir rekombinant, bulaşıcı moleküler klon istifade eder. MA ve CA etki alanları arasında Gag protein dahili takılı yeşil floresan proteininin (GFP) taşır. HIV Bu moleküler klon yardımcı virüs için gerek kalmadan enfektivite korur. Bu klon yapılan virüs partikülleri stoichiometrically hücreleri arasındaki viral montaj ve transfer izlemek için güçlü bir floresan bir sinyal sağlayarak, yeşil floresan protein ile yüklenir. Ile birlikte kullanıldığında asal hücre izleme floresan boyalar, alıcı hücreleri girdi donör hücreleri ayrımcılık ve bir HIV virüslü bir T hücre bulaşmamış T hücre 5 transfer görselleştirmek için izin olabilir. Mühürlü bir gaz geçirgen görüntüleme odasında kültüre ise Virolojik sinaps oluşumu ve sonra virüs bir hücreden diğerine transferi canlı hücreler görülebilir. (Gün 1) 2. HIV Gag iGFP hazırlanması Jurkat T Hücreler transfekte <ol><li> Dikkatle 2 x 10 5 ve 8 x 10 5 hücreleri / Jurkat kültür medya (RPMI 1640,% 10 fetal sığır serumu ml arasında konsantrasyonda hücreleri koruyarak insan CD4 + T hücre hattı Jurkat (ATCC, Manassas, VA) hazırlayın . 100 ünite / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin). Başarının Anahtarı: 8 x 10 5 hücre / mL aşan konsantrasyonlarda Jurkat hücreleri Kültür transfeksiyon verimliliğinde bir azalmaya neden olacaktır. Not: aşağıda açıklandığı gibi HIV Gag-iGFP proviral DNA T hücrelerine, bir çoğaltma yetkin insan immün yetmezlik virüsü üretim sonuçları transfeksiyon. Bunun gibi, bütün işlemleri sertifikalı biyogüvenlik düzeyi 2 + veya biyogüvenlik seviye 3 (BL2 + / BL3) doku kültürü odası, sadece eğitimli laboratuar personel tarafından yapılmalıdır. İş görüntüleme tesislerinde bulaşıcı HIV ile yerel kurumsal biyogüvenlik ofisi tarafından onaylanması gerekir. </li><li> Amaxa nucleofection yöntemi (Lonza, Walkersville, MD) kullanarak viral plazmid, HIV Gag-iGFP Jurkats Transfect. 150 10 dakika süreyle santrifüj yoluyla Pelet 5 x 10 6 hücre x g. Süpernatant aspire ve steril fosfat hücrelerin yıkayın tamponlu salin (PBS). Hücreler santrifüj ve üreticinin ek içeren, önceden ısıtılmış nucleofector çözüm V 97 mcL pelet tekrar süspansiyon. Hücre süspansiyonu plazmid endotoksin ücretsiz HIV Gag-iGFP (1 mcg / ml) üç mcL ekleyin ve hafifçe karıştırın. G-18 programı kullanarak, bir küvet ve nucleofect hücre süspansiyonu aktarın. Hemen antibiyotik olmadan prewarmed Jurkat kültür ortamı 3 mL hücrelere aktarın. </li><li> CD4 + hedef hücreleri virolojik sinaps için hazırlamak için, standart bir Ficoll-Paque (GE Healthcare, Uppsala, İsveç) protokolünü kullanarak buffy kat insan periferik kan mononükleer hücreleri edinin. CD4 + T hücreleri, daha sonra olumsuz bir manyetik boncuk izolasyon kiti (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) kullanılarak seçilir. Bu cryogenically donma medya 5 x 10 6 cells/500 mcL (% 90 fetal sığır serum/10% DMSO) hacimde sıvı N2 saklanabilir. Çözülmüş birincil CD4 + T hücrelerinin IL-2 10 adet / ml ile desteklenmiş RPMI% 10 FBS, kültür. </li></ol> (2. Gün) 3. HIV Gag-iGFP ve Floresan Boyalar ile Hedef Hücreler boyanması ile transfekte Jurkats Canlı Hücreler Kurtarma <ol><li> Jurkat hücreleri gecede transfeksiyon kurtarmak için izin verin. Sonra bir Ficoll hypaque yoğunluk gradiyenti malzeme üzerinde santrifüj hücresel enkaz kaldırmak. 1.5 ml, 15 ml konik bir tüp alt Ficoll-Paque koyun. Yavaşça RPMI bir 5 ml hacminde transfekte Jurkats bu degrade malzeme kaplaması. Fren kapalı olarak oda sıcaklığında, 20 dakika boyunca 400 xg&#39;de hücreler santrifüjleyin. Dikkatle bir pipet kullanarak medya / Ficoll arayüzü hücreleri kaldırmak. Yeni bir 15 ml konik tüp aktarabilirsiniz. 10 dakika için 300 xg&#39;de toplam hacmi 15 ml ve santrifüj RMPI ile hücreler sulandırınız. Iyi bir 2 cm (6 sıra plaka) 3 mL Jurkat kültür ortamı pelletini tekrar ve hücrelerin doku kültürü inkübatör dönün. </li><li> Donör hücreleri hedef hücreleri, hücre-hücre transferi deneyleri ayırt etmek için prelabel CD4 + floresan boya ile hedef hücreler. İlköğretim CD4 + T hücreleri bile etiketliKullanmadan önce ing. Biz CellTracker ve CellTrace boyalar (Invitrogen, Carlsbad, CA) ile mükemmel bir başarı etiketleme T hücreleri oldu. Boya konsantrasyonu ve inkübasyon süreleri, özellikle kullanılan boya ve hücre tipine bağlı olarak optimize edilmesi gerekir iken, bir temsilci protokolü izlemektedir. Pelet 4 x 10 6 birincil CD4 + T 10 dakika için 400 xg&#39;de iplik hücreleri. 2 mL PBS 5 ml PBS ve tekrar süspansiyon hücreleri yıkayın. Nihai konsantrasyonu 1.5 mcM CellTracker Orange (CMTMR, Invitrogen, Carlsbad, CA) ve 37 ° C&#39;de 20 dakika inkübe edin. 8 mL komple Jurkat medya ekleyin ve 10 dakika için 400 xg&#39;de santrifüj. 3 ml, 10 adet / ml, IL-2 ve geceleme doku kültürü inkübatörde ile desteklenmiş tam medya hücrelerin tekrar </li></ol> (Gün 3) 4. Canlı Hücre Görüntüleme kullanarak HIV İzleme Hücre-hücre Transfer Gag-iGFP Biz rutin HIV Gag-iGFP transfekte Jurkat hücreler 48 saat sonrası transfeksiyon kullanabilirsiniz. Ancak, 24 saat gibi erken bir sürede başarıyla hücreleri kullanılır, ve 72 saat sonrası transfeksiyon gibi geç. <ol><li> Yaklaşık 48 saat sonrası transfeksiyon, HIV Gag iGFP ifade Jurkats CO ile yıkanmış sayılır 2 bağımsız medya (Invitrogen, Carlsbad, CA), ve canlı hücre görüntüleme medya (CO 2 bağımsız medya,% 10 fetal sığır serumu, yeniden süspanse 1-3 x 10 7 hücre / ml &#39;lik bir konsantrasyon az 100 U / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin, 10 adet / ml, IL-2). </li><li> Benzer bir şekilde, yıkama ve 1-3 x 10 7 hücre / ml canlı hücre görüntüleme medyada bir konsantrasyon etiketli birincil CD4 + T hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Mix HIV Gag-iGFP-transfekte Jurkats birincil CD4 + T hücreleri tedavi doku kültürü, gaz geçirgen, microchamber (Ibidi, Verona, WI) bir 1:2 veya 1:03 oranında ve yük. Örneğin, HIV Gag-iGFP transfekte Jurkats etiketli birincil CD4 + T hücrelerinin yüzde 40 mcL ile 20 mcL karıştırın. Bu karışımı 50 mcL Ibidi odasına yerleştirin ve fişler ile donatıldı mühür. Fişleri, fiş / Ibidi odasına arayüzü ile parafilm sararak sabitleyin. </li></ol> 5. Mikroskopi platformlarda dikkat edilmesi gereken noktalar: dönen disk konfokal görüntüleme Hücreleri ile bir Ibidi görüntüleme odasına yerleştirdikten sonra, derhal cihazı ters bir optik mikroskop (iX71 Olympus, Merkez Vadisi, PA) üzerine monte edin. Ibidi odasında sadece uygun güvenlik kıyafetler giyiyor BL2 + eğitilmiş laboratuvar personeli tarafından mikroskop transfer edilmelidir. Canlı hücre görüntüleme genellikle istikrarlı bir 37 ° C çevre korumak için pahalı inkübasyon odaları kullanmasına rağmen, bu bir T-tipi termokupl ucu ile birlikte basit ve ekonomik bir termostatik ısıtıcı (ASI 400, Nevtek, Williamsville, VA) kullanılarak elde edildi yanına monte Uygun sıcaklık geri bildirim için örnek. CO 2-bağımsız medya CO 2 odasının kullanımı kaçınarak, yüksek hücre canlılığı korumak sağlar bulduk . Oda sıcaklığı dalgalanmalara karşı platformu tampon ve arka plan oda ışığı engellemek için, büyük bir siyah kefen sistemi etrafında yalıtımlı bir hava cebi oluşturarak tüm mikroskop / ısıtıcı kurulum üzerinde bol dökümlü. Bu, sıcaklık değişimi ve ilişkili sıcaklık ile ilgili örnek sürüklenme büyük ölçüde azaltır, ama 30 dakika boyunca örnek montaj önce ön ısıtma gerektirir. 6. Veri Toplama, Transfer ve Görüntü İşleme Görüntüler yüksek sayısal açıklık (NA) büyük ölçüde çözünürlüğünü artırır olarak bir 60x 1.42 NA immersiyon yağı amacı (UPlanApo N, Olympus) kullanılarak alınır. 3D konfokal görüntüler oluşturmak için, tarama aynı anda tarama hızını önemli ölçüde artırmak için&gt; 800 konfokal noktalar kullanan dönen bir disk konfokal birimi (CSU-10, Yokagawa, Japonya) tarafından yapılır. Hızı, CSU-10 photobleaching ve fototoksisite azaltır hızlı, düşük ışık koşullarında görüntüleme izin için çok hassas bir elektron çarparak ücret çiftli cihazı (EMCCD, IXON + 897, Andor Technologies, İrlanda) kamera ile eşleştirilmiş. Iltifat için Floresan ışık kaynağı bir tarafından seçilen istenen dalga boyunda (488 nm) ve lazer güç mikroskop objektif (&lt;1 mW) hemen önce ölçülen dalga boyu çok ArKr iyon gaz lazer (Innova 70C, Tutarlı, Santa Clara) acousto optik ayarlanabilir filtre (AOTF), (Andor Teknolojileri). Daha photobleaching azaltmak ve toplam görüntüleme süresini uzatmak için, hızla AOTF (mikrosaniye) yeni elde edilen bir görüntüyü CCD (15-30 ms maruz) teslim ederken kamera (10-20 ms) devre dışı lazer ışını her zaman kapanır. bilgisayara. Lazer ışığı 405/488/568/647 dört bant dikroik ayna (Semrock, Rochester, NY) ile dönen disk sistemi birleştirilmiştir. Floresans emisyon 525/50 bant geçiren bir filtre tekerlek (Ludl Elektronik Ürünler, Hawthorne, NY) içinde bir filtre (Semrock) süzülür monte bEMCCD kamera ve konfokal dönen disk ünitesi etween. Z-evre (Mad City Labs, Madison, WI) dahil olmak üzere tüm donanım ve satın alma, Andor iQ v1.8 yazılımı tarafından kontrol edilir. 1,2-1,9 etrafında ikinci 3D görüntü yığınlarının satın alma hızını en üst düzeye çıkarmak için, hücre çifti hemen alan EMCCD kamera kayıt bölgesi kırpmak. Ayrıca, bazı bilgiler z pahasına, 0,45-0,75 mikron arasında büyük bir z adım satın alma hızlandırmak için kullanılır. Bu koşullar altında Görüntüleme 6 saate kadar sürebilir sürekli 20-60 dakika segmentleri kullanarak minimum photobleaching. Toplamda, her bir veri parçası genellikle 5-20 GB, on binlerce görüntü alınır alanı kaplar. Büyük veri dosyaları taşıma ve analizi kolaylaştırmak için, her bir satın alma seti Andor iQ v1.8 yazılımı kullanarak 1 Gb TIFF görüntü dosyası kesimleri olarak parçalanır ve ihraç edilmesi gerekiyor. Burada, birçok mükemmel yazılım paketleri Metamorph, Volocity ve ImageJ (biz onun varyasyon Fiji öneririz) gibi görüntü analizi için kullanılabilir. Iki floresan belirteçlerinin izlenebilir zaman, biz aynı anda bir satın alma düşürmeden her ikisi de rekor &quot;split screen modu.&quot; Her iki işaretleri, bir seferde iki farklı ArKr lazer çizgileri (genellikle 488 ve 568 nm) heyecan duyuyoruz. EMCCD kamera iki farklı görüntü ayıran bir görüntü splitter (OptoSplit II, Cairn, Kent, UK) önce doğrudan yerleştirilebilir. Her görüntü daha sonra bağımsız bir kez &quot;bölünmüş ekran&quot; etkisi yaratmak kamera floresan filtreleri (Semrock) ve öngörülen yan yana süzülür. Bu daha sonra manuel kırpma ve daha sonra görüntü işleme görüntü hizalayarak gerektirecektir. 7. Görüntü İşleme ve Veri Analizi dikkat edilmesi gereken noktalar Biz genellikle Volocity (Perkin Elmer, Waltham, MA), Macintosh bilgisayarlarda (Apple, Inc.) Görüntü analizi gerçekleştirmek. Dönen disk lazer konfokal mikroskobu görüntüleri ilk sonra Volocity ile deconvolved, photobleaching için doğru yoğunluğu ayarlanır. Gag puncta yoğunluğu ölçüm ve izleme Volocity Niceleme modülü ile yapılır. Önceden oluşmuş bir sinaps göre hareket hesaplanması gereken görüntü setleri için, otomatik bir izleme algoritması, tüm dizi boyunca sinaptik düğmesine izler istihdam edilmektedir. Otomatik parça seçme yazılımı tarafından tanımlanan faiz bölgelerin Elle muayene, yazılım, istenilen nesneyi doğru takip doğrulamak için yapılmalıdır. Çevredeki nesnelerin kontrastı çok zayıf nesneler için, manuel izleme-kare bir çerçeve temelinde yapılabilir. Volocity yazılım paketi, istenilen nesneleri içinde XYZ konumu, hacmi ve entegre sinyal ihracat sağlar. Sinaptik düğmeye merkezine hareketleri normalleştirilmesi izlenen nesnenin sinaps ve hız mesafe hesaplanır. 8. Temsilcisi Sonuçlar Karıştırma 10 ila 15 dakika içinde bir birincil CD4 kalarak HIV Gag-iGFP ifade Jurkat hücreleri + T hücreleri görselleştirmek mümkün olmalıdır. Görüntüleme bu konjugatları, bir synaspe sonra hedef hücreleri enfekte hücrelerin yanı sıra Gag puncta hareketlerini değerlendirmek. Sinaps oluşur birinin kısa bir süre sonra hedef hücre içine Gag iGFP puncta hareket gözlemleyebiliriz.

<ol><li>Blanco, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+level+of+coreceptor-independent+HIV+transfer+induced+by+contacts+between+primary+CD4+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">High level of coreceptor-independent HIV transfer induced by contacts between primary CD4 T cells.</a> J Biol Chem. 279, 51305-51314 (2004).</li>
<li>Sourisseau, M., Sol-Foulon, N., Porrot, F., Blanchet, F., Schwartz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inefficient+human+immunodeficiency+virus+replication+in+mobile+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Inefficient human immunodeficiency virus replication in mobile lymphocytes.</a> J Virol. 81, 1000-1012 (2007).</li>
<li>Jolly, C., Kashefi, K., Hollinshead, M., Sattentau, Q. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+cell+to+cell+transfer+across+an+Env-induced%2C+actin-dependent+synapse%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">HIV-1 cell to cell transfer across an Env-induced, actin-dependent synapse.</a> J Exp Med. 199, 283-293 (2004).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+%28HIV-1%29+Gag+localization+and+oligomerization+monitored+with+live+confocal+imaging+of+a+replication-competent%2C+fluorescently+tagged+HIV-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sequence of human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) Gag localization and oligomerization monitored with live confocal imaging of a replication-competent, fluorescently tagged HIV-1.</a> J Virol. 81, 12596-12607 (2007).</li>
<li>Hubner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+3D+video+microscopy+of+HIV+transfer+across+T+cell+virological+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative 3D video microscopy of HIV transfer across T cell virological synapses.</a> Science. 323, 1743-1747 (2009).</li>
</ol>

Biz burada, hücre-hücre HIV transferi görselleştirmek için basit bir yöntem açıklanmaktadır. Laboratuar ve diğerleri &#39;tarafından yapılan son araştırma, HIV baskın modu T hücreleri arasında yayılmış olabileceğini düşündürmektedir. Burada anlatılan yöntemi HIV rekombinant formu istihdam temel yapısal protein, Gag genetik olarak kodlanmış olan yeşil floresan protein etiketi taşıyan Gag iGFP, HIV adı verilen. Çünkü her virüs parçacık üretilen GFP yüksek düzeyde, HIV Bu çoğaltma yetkili klonu, gerçek zamanlı olarak bireysel virüs partikülleri takip etmek için araştırmacılar sağlar. Bu virüs, HIV montaj ve hücre-hücre transferi ile ilgili çalışmalarda özellikle yararlı olacaktır. HIV hücre-hücre transferi ile transferi oldukça verimlidir. Üç saat boyunca ko-kültür, biz rutin akış sitometri ile değerlendirilen virüs birincil T hücrelerinin% 20-30 transfer bakın. Benzer verimliliği niteliksel canlı hücre görüntüleme sırasında görülür. Viral bulaşmış T hücrelerinin hemen eş-kültür başladıktan sonra bulaşmamış birincil T hücreleri ile sinaps oluşturarak başlar. İlginç, değil tüm ilköğretim T hücreleri lazer cımbız (yayınlanmamış gözlemler, GM) ile zorla etkileşimleri rağmen, HIV ile enfekte Jurkat hücreleri ile etkileşim yeteneğine sahiptir. HIV Gag-iGFP şüphesiz hücre-hücre transferi, in vitro ve in vivo hem de en duyarlı T hücre alt grupları belirlemek için yararlı olacaktır.

<table><tbody><tr><td>Jurkat T Hücreleri</td><td>ATCC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tam kandan lökosit buffy coat'ları</td><td>New York Blood Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovin Serum</td><td>Hyclone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector Sistemi ve Solution V</td><td>Lonza Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Maxi Prep Kitleri</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HIV Gag-iGFP plazmidi</td><td>Chen Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD4+ T Hücresi İzolasyon Kiti</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Celltracker/CellTrace Boyaları</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;-Bağımsız Besiyeri</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Görüntüleme Odacıkları</td><td>Ibidi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Olympus IX-71 Evirtilmiş Mikroskop</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PlanApo N 1.42NA 60X yağlı objektif</td><td>Olympus Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Innova 70C ArKr iyon gaz lazeri</td><td>Coherent Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CSU-10 Nipkow tipi dönen disk konfokal ünitesi</td><td>Yokogawa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5 dikroik ışın ayırıcı</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>525/50 bant geçiren filtre</td><td>Semrock</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iXon+ 897 elektronla çoğaltılmış şarj coupled cihaz kamera</td><td>Andor</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ASI 400 Termostatik Isıtıcı</td><td>Nevtek</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

hiv ve live konfokal mikroskop floresan klonlar kullanılarak hiv görselleştirme hücre-hücre transferi

Visualizing Cell-to-cell Transfer of HIV using Fluorescent Clones of HIV and Live Confocal Microscopy

Kaynaştırma sevdikleri proteinler yeşil flüoresan protein, biyologlar, floresan video mikroskopi kullanılarak karmaşık hücresel süreçleri yaşayan çalışma yeteneğine sahip. Insan immün yetmezlik virüsü hücre-hücre iletim sırasında insan immün yetmezlik virüsü çekirdek protein hareketlerini izlemek için, HIV bulaşıcı bir moleküler klon bağlamında Gag protein, HIV Gag-iGFP denilen GFP etiketli. Biz viral klon video konfokal mikroskopi kullanılarak bu çalışma. Aşağıdaki görüntülenmiştir deneyde, bir insan T hücre hattı HIV Gag-iGFP transfect ve biz floresan etiketli bulaşmamış CD4 + T hücreleri virüs için hedef hücreler olarak hizmet etmek için kullanır. Hücrelerarası yapılar arasında kolayca viral üretim ve nakliye takip edebilirsiniz farklı floresan etiketleri kullanarak virolojik sinaps denir. Basit gaz geçirgen görüntüleme odaları, bize gün dakika canlı konfokal mikroskobu ile sinaps gözlemlemek için izin verir. Bu yaklaşımlar, bir hücreden diğerine hareket gibi viral proteinleri izlemek için kullanılabilir.

Bu görüntülenmiştir deney canlı konfokal görüntüleme deneyleri için HIV floresan moleküler klon kullanan için bir rehber.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Biyologlar, yeşil floresan proteini favori proteinlerine füzyonlayarak, artık ... kullanarak canlı ve kompleks hücresel süreçleri inceleme yeteneğine sahiptirlar.

Bu prosedür, HIV eksprese eden jerk CAT T hücreleri ile enfekte olmamış primer T hücreleri arasındaki virolojik sinapslar aracılığıyla GFP etiketli HIV'nin transferini görselleştirmek için canlı hücre görüntüleme yöntemini kullanmaktadır. Hücreden hücreye transfer testi, HIV gag IG FP'nin (HIV 1'in enfeksiyöz floresan bir klonu) yüklendiği ve HIV gag IG FP eksprese eden transfect edilmiş jerk kedi hücreleri ile başlar. Transfect edilmiş jerk kedi hücreleri daha sonra C-M-T-M-R etiketli enfekte olmamış primer T hücreleri ile karıştırılır ve GFP etiketli HIV'nin virolojik sinaps boyunca transferinin gözlemlenebileceği bir görüntüleme haznesine yerleştirilir.Elde edilen veriler, T hücresi virolojik sinapsları boyunca HIV transferinin detaylarını ortaya çıkarmak için görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Merhaba, ben Mount Sinai Tıp Fakültesi Tıp Bölümü'ndeki Ben Chen laboratuvarından Benjamin Dale. Ben de UC Davis Tıp Merkezi'ndeki NSF Biyofotonik Merkezi'nde Dr. Thomas Huser laboratuvarında görev yapan Greg McNerney.Ben de Dr. Thomas Huser'ın laboratuvarından Deanna Thompson. Bugün size canlı konfokal mikroskopi kullanarak HIV-1'in hücreden hücreye transferini görselleştirme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürde, JERK hat hücreleri, HIV-1'in enfeksiyöz bir moleküler klonu ile transfekte edilir; bu işlem yalnızca sertifikalı biyogüvenlik alanlarında çalışan eğitimli laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilmelidir.Burada gösterilen protokol, seviye iki artı veya biyogüvenlik seviyesi üç doku kültürü odalarında gerçekleştirilebilir. Görüntüleme tesislerinde enfeksiyöz HIV ile çalışılması, yerel kurumsal biyogüvenlik ofisi tarafından onaylanmalıdır. Donör hücre olarak kullanılacak jerk kedi hücrelerini mililitre başına 2 × 10⁵ ile 8 × 10⁵ hücre arasındaki bir konsantrasyonda muhafaza edin.Jerk cat kültüründe, mililitrede 8x10⁵ hücreden fazla olan medya hücre konsantrasyonu, transfeksiyon verimliliğinde azalmaya neden olur. Prosedüre başlamak için, eşlik eden yazılı protokolde açıklanan amax nucleo affection yöntemini kullanarak 5x10⁶ jerk cat hücresini HIV gag IGFP viral plazmidi ile transfekte edin ve hücrelerin gece boyunca toparlanmasına izin verin. Periferik kan mononükleer hücreleri, tam insan kanı buffy coat'larından FICO yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile saflaştırılır.Primer CD4+ T hücreleri, bir CD4+ T hücresi izolasyon kiti kullanılarak negatif seçilim yoluyla periferik kan mononükleer hücrelerinden saflaştırılır. Negatif seçilimli CD4+ T hücreleri manyetik bir kolondan toplanır ve mililitre başına 10 ünite rekombinan insan IL-2 eklenmiş, %10 FPS içeren PMI ortamında kültüre edilir; ayrıca izole edilen primer CD4+ T hücreleri alikotlara ayrılarak kriyojenik dondurma kapları yardımıyla dondurulabilir. Dondurma kapları, minimum üç ila dört saat boyunca -70 °C'lik bir dondurucuya yerleştirilir.Hücreler daha sonra uzun süreli saklama için sıvı azota aktarılır. Jurkat hücreleri transfekte edildiğine ve hedef birincil CD4 pozitif T hücreleri izole edildiğine göre, transfeksiyonu takip eden günde hücrelerin temizlenmesi ve etiketlenmesi işlemine geçiniz. Jurkat hücreleri artık enfeksiyöz floresan HIV konstrüktünü eksprese etmektedir.Enfeksiyöz örneklerle çalışırken, önü kapanan bir laboratuvar önlüğü ve iki çift eldiven giyeriz. Transfekte edilen hücrelerdeki hücresel debrisleri, yüksek paket yoğunluklu bir ortam üzerinden santrifüj ederek uzaklaştırın. Öncelikle, 15 mililitrelik konik bir tüpün tabanına 1,5 mililitre fial pack dağıtın.Ardından, transfect edilmiş jerk hat hücrelerini 5 mL hacmindeki PMI ortamımızla birlikte gradyan materyalinin üzerine nazikçe ekleyin. Bu aşamada, transfect edilmiş jerk hat hücreleri enfektif HIV üretme kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, HIV eksprese eden hücrelerle temas eden tüm pipet uçları %10'luk çamaşır suyu çözeltisi ileledezenfekte edilmelidir.Biyogüvenlik kabini içindeki bir kaba atmadan önce, tüpün kapağını kapatın, tüpün dış kısmına %70 ethanol çözeltisi püskürtün ve kuru bir kim wipe ile silin; ardından hücreleri oda sıcaklığında, fren kapatılmış şekilde, 400 Gs hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, bir pipet kullanarak hücreleri besiyeri-pellet arayüzünden dikkatlice alın ve hücreleri yeni bir 15 milliliter konik tüpe aktarın. Hücreleri PMI medyumumuz ile toplam 15 milliliters hacme ulaşana kadar seyreltin ve 300 GS hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Oda sıcaklığında, peleti üç mililitre jerk hat kültür ortamında süspanse ederiz ve altı kuyucuklu bir plakanın iki santimetrelik kuyucuğuna aktarırız. Plakayı, ertesi gün kullanılmaya hazır olana kadar doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Aynı günün akşamında, hedef hücreler olarak kullanılan primer CD4 pozitif T hücrelerini donör hücrelerden ayırt edebilmek için etiketleyin. Öncelikle, altı primer CD4 pozitif T hücresinden 4x10⁶ tanesini 400 G'de 10 dakika santrifüj ederek peletleyin.Ardından hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın ve yeniden süspande edin. İki mililitre PBS içinde süspande edin, nihai konsantrasyonu 1.5 micromolar olacak şekilde cell tracker orange ekleyin ve 37 °C'de dakikalarca inkübe edin. Hücrelerin inkübasyonu tamamlandığında, sekiz mililitre tam chica medyumu ekleyin ve 400 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Hücreleri, mililitre başına 10 ünite IL two ile desteklenmiş üç mililitre tam medyumsun içinde yeniden süspanse edin ve gece boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, donör ve hedef hücreler hücreden hücreye transfer deneyi için hazır hale gelir. Hücreden hücreye transfer deneyini kurmadan önce, platformu oda sıcaklığındaki dalgalanmalara karşı korumak için görüntüleme haznesini hazırlayın.Oda arka plan ışığını engellemek için, tüm mikroskop ısı düzeneğinin üzerine büyük siyah bir örtü serilerek sistem çevresinde yalıtımlı bir hava cebi oluşturulur. Görüntüleme haznesi, sıcaklık geri bildirimi için numunenin yanına yerleştirilmiş T tipi bir termokupl ucu bulunan termostatik bir ısıtıcı kullanılarak stabil 37 °C'de tutulur. Numuneyi yerleştirmeden önce 30 dakika boyunca ön ısıtma yapın.HIV'nin hücreden hücreye geçişinin 3B konfokal görüntülerini oluşturmak için ters optik mikroskopla dönen disk konfokal görüntüleme kullanılır. Z tablası dahil tüm donanım ve veri toplama işlemleri, and veya IQ versiyon 1.8 yazılımı tarafından kontrol edilir; tarama işlemi, hızını desteklemek amacıyla tarama hızını ciddi şekilde artırmak için eş zamanlı olarak 800'den fazla konfokal nokta kullanan bir CS U 10 dönen disk konfokal ünitesi ile gerçekleştirilir. CS U 10, hem fotobağlamayı hem de fototoksisiteyi azaltan, düşük ışıkta hızlı görüntüleme sağlayan yüksek hassasiyetli bir elektron çarpanlı şarj coupled cihaz kamerası ile eşleştirilmiştir.Floresan ışık kaynağı, çok dalga boylu bir argon kripton iyon gaz lazeridir. İstenen dalga boylarını seçmek için bir akustik optik ayarlanabilir filtre veya A OTF kullanılır; burada bu dalga boyları 488 nanometre ve 568 nanometredir. Ayrıca fotobleşmeyi daha da azaltmak ve görüntüleme süresini uzatmak için güç kontrolü sağlanır. A OTF, kamera görüntü almadığında, her 15 ila 30 milisaniyelik pozlamanın ardından lazeri hızla kapatarak, görüntüler E-M-C-C-D kamerasından bilgisayara aktarılırken gereksiz pozlamayı önler.Lazer ışığı, 405, 488, 568 ve 647 nm dört bantlı dikroik ayna kullanılarak dönen disk sistemine entegre edilir; floresan emisyonu, bir görüntü ayırıcıyla birlikte 560 nanometrelik uzun geçiren dikroik ayna kullanılarak dalga boyuna göre ayrılır. Yeşil kanal 525/50 nanometrelik bant geçiren filtre ile, kırmızı kanal ise 609/54 nanometrelik bant geçiren filtre ile filtrelenir. İki kanal, E-M-C-C-D kamerasına yan yana yansıtılır.Görüntüleme odası ısınırken, hücreden hücreye aktarım deneyi için hücreleri hazırlayın. HIV gag IGFP eksprese eden ette hücrelerini saymak için bir hemositometre kullanın. Virüs eksprese eden hücrelere doğrudan maruz kalmamak için hemositometreyi bir Petri kabına yerleştirin.Hücreleri karbondioksitten bağımsız besiyeri ile yıkayın ve mililitre başına 1 ila 3 × 10⁷ hücre konsantrasyonunda canlı hücre görüntüleme besiyerinde yeniden süspande edin. Karbondioksitten bağımsız besiyeri kullanımı, karbondioksit ortam odasına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Görüntüleme için.Hücreleri sayın, yıkayın ve etiketlenmiş primer CD4 pozitif T hücrelerini, tıpkı Jurkat hücreleri için gösterildiği gibi yeniden süspande edin. Ardından, hücreden hücreye transferi başlatmak için 20 µL HIV gag IGFP transfekte edilmiş Jurkat hücresini 40 µL etiketlenmiş primer CD4 pozitif T hücresi ile karıştırın ve 50 µL'lik miktarı doku kültürü işlemine tabi tutulmuş, gaz geçirgen bir EBD mikro odasına yükleyin. Odayı tıpalarla kapatın ve tıpaları, tıpa-EBD odası arayüzünü parafilm ile sararak sabitleyin.%70 etanol emdirilmiş bir kimyasal mendil ile görüntüleme haznesini silin ve çeker ocak altında kısa bir süre hava ile kurumasını bekleyin. Kazara maruz kalmayı önlemek için kapalı görüntüleme haznesini sızdırmaz bir kap içerisinde taşıyın. IBD görüntüleme haznesi hücrelerle yüklendikten hemen sonra taşıma sırasında hazne düşürülmediği sürece, cihazı mikroskoba monte edin.Yüksek sayısal açıklığın, 3D görüntü yığınları başına elde etme hızını maksimize etmek için çözünürlüğü önemli ölçüde artırması nedeniyle, hücre çiftlerinin görüntülerini 60 x 1.42 NA yağ daldırma objektif kullanarak alın. EM CD kamerasının kayıt bölgesini bir hücre çiftinin hemen çevresine kadar kırpın. Ayrıca, bu koşullar altında 0,45 ve 0,75 mikrometre arasında büyük bir Z adımı da görüntüleme hızını artırmaya yardımcı olabilir.Görüntüler 20 ila 60 dakikalık aralıklarla sürekli olarak kaydedilir. Aynı örnek noktasının tekrarlanan görüntülemesi, elde edilirken minimum fotobleaching ile altı saate kadar uzayabilir. Her bir veri segmenti, toplamda beş ila 20 gigabayt yer kaplayabilen on binlerce görüntüden oluşur.Büyük dosyaların taşınmasını ve analizini kolaylaştırmak için, her dosya parçalara ayrılarak bir gigabyte'lık TIFF görüntü dosyası segmentleri olarak dışa aktarılır. Elde edilen görüntüleri analiz etmek için çeşitli görüntü analiz yazılım programlarından herhangi birini kullanın. Yoğunluk ağarma düzeltmesi ile gag puncta'larının otomatik ve manuel takibi dahil olmak üzere görüntü analizinin ayrıntıları için beraberindeki yazılı protokole başvurun.Karıştırmadan sonraki 10 ila 15 dakika içerisinde, HIV gag IGFP eksprese eden jerk kedi hücrelerinin primer CD four pozitif T hücrelerine yapıştığı görüntülenerek gözlemlenebilir. Bu konjugatlar aracılığıyla, hem enfekte hücrelerdeki hem de hedef hücrelerdeki gag punktalarının hareketleri değerlendirilebilir. Sinaps oluşumundan sonra, 30 dakika ile üç saat arasında, gag IG FP punktalarının cell tracker ile işaretlenmiş hedef hücrelere doğru hareketi gözlemlenebilir.T-hücreleri arasında HIV'nin hücreden hücreye transferini nasıl görselleştireceğinizi az önce gösterdik. Bu prosedürleri uygularken, HIV eksprese eden hücrelere maruz kalmış örneklerle çalışırken tüm biyogüvenlik seviyesi iki artı veya biyogüvenlik seviyesi üç önlemlerine uymayı hatırlamak çok önemlidir. Ayrıca, transfeksiyonu optimize etmek için iyi korunan JCA hücreleri ve endotoksin içermeyen DNA kullanmayı unutmayın.İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

visualizing-cell-to-cell-transfer-hiv-using-fluorescent-clones-hiv

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Yerinde tetramer boyama in situ hibridizasyon (ISTH) birleştirerek bir tekniği görselleştirme, haritalama ve analiz, virüs bulaşmış hedefleri virüs spesifik CD8 + T hücreleri mekansal yakınlığı ve bu bağışıklık etkileyiciler ve hedefleri arasındaki nicel ilişkilerin belirlenmesi sağlar enfeksiyon sonuçlarını.

Aynı zamanda Virüs CD8 + T Hücreleri ve virüsle enfekte olan hücreleri görselleştirin için bir Tekniği In situ</em

Biz Tat duyarlı LTR ek olarak, bu tür bir lentiviral vektör geliştirdik, HIV-1 Tat ve Rev-bağımlı bir moda muhabiri gen ekspresyonu düzenleyen Rev-yanıt elemanı (RRE). Vektör GFP ifadesi üzerinden canlı hücreler kopyalayan HIV özel algılama izin verir.

Yeşil Floresan Protein ifade Rev-bağımlı lentiviral Vector kullanarak HIV-1 Olumlu Hücreler Özgül İşareti

Bu makale toplam iç yansıma floresans (TIRF) mikroskop camı desteklenen düzlemsel bilayers bir HIV-1 zarf kaynaklı virolojik sinaps oluşumu görselleştirmek için bir yöntem açıklanır. Yöntem ayrıca, HIV-1 zarfı ile endüklenen virolojik sinaps oluşumu sırasında meydana gelen sinyal molekülleri aktivasyonu ve dağıtılması algılamak için immünfloresans boyama yöntemi ile kombine edilebilir.

Görüntülemede HIV-1 Zarf bağlı Virolojik Synapse ve Sentetik Lipid Bilayers üzerine Sinyal

Floresans tarafından viral RNA tespit edilmesi<em&gt; In situ</em&gt; Hibridizasyon (FISH)

Source: Lê-Bury, G., et al. Phagosome Migration and Velocity Measured in Live Primary Human Macrophages Infected with HIV-1. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates live confocal imaging of HIV-1-infected human macrophages to visualize and quantify phagosome migration using GFP fluorescence and bright field tracking, providing insights into how HIV alters intracellular trafficking during Fc receptor–mediated phagocytosis.

Live Imaging of Phagosome Migration in HIV-1-Infected Human Macrophages

Kaynak: Shah, R., et al. Single-Cell Multiplexed Fluorescence Imaging to Visualize Viral Nucleic Acids and Proteins and Monitor HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virus, and Influenza Infection. J. Vis. Exp. (2020)Bu video, dallanmış DNA hibridizasyonu ve immünofloresans kullanarak enfekte insan lenfositlerinde HIV-1 DNA, RNA ve kapsid proteininin eş zamanlı görselleştirilmesini göstermekte ve böylece tekil hücreler içindeki viral replikasyon aşamalarının detaylı analizine olanak tanımaktadır.

Enfekte İnsan Lenfositlerinde Viral Nükleik Asitlerin ve Proteinlerin Çoklu Floresan Görüntülemesi

Biz yüksek hızlı 3D canlı hücre floresan ışık mikroskobu ve yüksek çözünürlüklü kriyo-elektron tomografi birleştiren bir karşılıklı mikroskopi yöntemi açıklanmaktadır. Biz burada görüntüleme, dinamik ana HeLa hücreleri ile etkileşime küçük bir HIV-1 parçacıkların bağıntılı yöntemin özelliği göstermektedir.

Dinamik Etkileşimler 3D Yapısal Analiz için karşılıklı Mikroskopi

Alphaherpes virüs enfeksiyonlarının Canlı hücre görüntüleme yönelik ulaşım ve hücreler arası yayılma dinamik olayların analizi sağlar. Burada, birincil nöronların enfeksiyon sırasında viral meclislerinin görselleştirme kolaylaştırmak için floresan füzyon proteinleri ifade rekombinant viral suşlar kullanmak yöntemleri sunuyoruz.

Alphaherpes Virüs İleriye Taşıma ve Değişken Canlı Hücre Görüntüleme

Burada floresan görüntüleme yaklaşımı için bir protokol, D NA, RNA ve protein'in (MICDDRP) multiplex immunofloresan cell bazlı detectionu, viral protein ve farklı tip ve karaya oturmuş nükleik asitlerin eşzamanlı floresan tek hücreli görselleştirmesini yapabilen bir yöntemdir. Bu yaklaşım çok çeşitli sistemlere uygulanabilir.

Viral Nükleik Asitleri ve Proteinleri Görselleştirmek ve HIV, HTLV, HBV, HCV, Zika Virüsü ve İnfluenza Enfeksiyonunu İzlemek için Tek Hücreli Çoklanmış Floresan Görüntüleme

Burada, nanoakışkan bir cihazda akut olaylar ve üretken HIV-1 enfeksiyonu için tek hücrelerin izlendiği bir protokol sunuyoruz. Görüntüleme verileri virüs konakçısı reseptör etkileşimlerini ve sinyal yolu dinamiklerini tanımlar. Bu, nanoakışkan yüksek verimli boyuna tek hücreli kültür ve görüntülemenin sinyal kinetik ve moleküler etkileşimleri incelemek için ilk yöntemidir.

Multiparametre Optofluidik Platform Kullanılarak Kalsiyum Akını ve HIV-1 Enfeksiyonunun Tek Hücreli Karakterizasyonu

Öğrenin, canlı konfokal mikroskopi kullanarak T hücreleri arasında HIV transferini görselleştirme yöntemini. Bu teknik, virolojik sinapslar arasındaki viral iletim dinamiklerini incelemek için güvenilir bir protokol sunar.

HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Daha fazla video keşfet