HIV ve Live Konfokal Mikroskop Floresan Klonlar kullanılarak HIV görselleştirme Hücre-hücre Transferi

Bu prosedür, HIV eksprese eden jerk CAT T hücreleri ile enfekte olmamış primer T hücreleri arasındaki virolojik sinapslar boyunca GFP etiketli HIV'in transferini görselleştirmek için canlı hücre görüntülemesi kullanır. Hücreden hücreye transfer testi, HIV gag IG FP (HIV 1'in enfeksiyöz floresan bir klonu) ile jerk CAT T hücrelerinin transfekte edilmesiyle başlar; transfekte edilen jerk kedi hücreleri HIV gag IG FP eksprese eder. Ardından, bu hücreler C-M-T-M-R etiketli enfekte olmamış primer T hücreleri ile karıştırılır ve GFP etiketli HIV'in virolojik sinaps üzerinden transferinin gözlemlenebileceği bir görüntüleme haznesine yerleştirilir.

Elde edilen veriler, T hücresi virolojik sinapsları boyunca HIV transferinin detaylarını ortaya çıkarmak için görüntü analiz yazılımı kullanılarak analiz edilir. Merhaba, ben Mount Sinai Tıp Fakültesi Dahiliye Bölümü'ndeki Ben Chen laboratuvarından Benjamin Dale. Ben, UC Davis Tıp Merkezi'ndeki NSF Biyofotonik Merkezi'nde Dr. Thomas Huser laboratuvarından Greg McNerney.

Ben de Dr. Thomas Huser'in laboratuvarından Deanna Thompson. Bugün size, canlı konfokal mikroskopi kullanarak HIV-1'in hücreden hücreye transferinin görselleştirilmesine yönelik bir prosedürü göstereceğiz. Bu prosedürde, Jurkat hücreleri HIV-1'in enfeksiyöz bir moleküler klonu ile transfekte edilir; bu işlem yalnızca sertifikalı biyogüvenlik tesislerinde çalışan eğitimli laboratuvar personeli tarafından gerçekleştirilmelidir.

Bu protokol, seviye iki artı veya biyogüvenlik seviyesi üç doku kültürü odalarında gerçekleştirilebilir. Görüntüleme tesislerinde enfeksiyöz HIV ile çalışılması, yerel kurumsal biyogüvenlik ofisi tarafından onaylanmalıdır. Donör hücre olarak kullanılacak jerk kedi hücreleri, 2 × 10⁵ ile 8 × 10⁵ hücre/mL arasındaki bir konsantrasyonda tutun.

Jerk cat kültüründe, besiyeri hücre konsantrasyonunun 8 × 10⁵ hücre/ml değerini aşması, transfeksiyon verimliliğinde azalmaya yol açar. İşleme başlamak için, eşlik eden yazılı protokolde açıklanan amax nucleo affection yöntemini kullanarak 5 × 10⁶ jerk cat hücresini viral plazmit HIV gag IGFP ile transfekte edin ve hücrelerin gece boyunca toparlanmasına izin verin. Periferik kan mononükleer hücreleri, tüm insan kanı buffy coat tabakalarından FICO yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile saflaştırılır.

Primer CD4 pozitif T hücreleri, bir CD4 pozitif T hücresi izolasyon kiti kullanılarak negatif seçilim yoluyla periferik kan mononükleer hücrelerinden saflaştırılır. Negatif seçilimli CD4 pozitif T hücreleri manyetik kolondan toplanır ve mililitre başına 10 ünite rekombinant insan IL-2 ile desteklenmiş %10 FPS içeren PMI ortamında kültüre edilir; ayrıca izole edilen primer CD4 pozitif T hücreleri alikotlara ayrılarak kriyojenik dondurma kapları yardımıyla dondurulabilir. Dondurma kapları, minimum üç ila dört saat boyunca -70 °C dondurucuya yerleştirilir.

Hücreler daha sonra uzun süreli saklama için sıvı azota aktarılır. Jurkat hücreleri transfekte edildiğine ve hedef primer CD4 pozitif T hücreleri izole edildiğine göre, transfeksiyonun ertesi günü hücrelerin temizleme ve etiketleme işlemlerine geçiniz. Jurkat hücreleri şu anda enfeksiyöz floresan HIV konstrüktunu eksprese etmektedir.

Enfeksiyöz numunelerle çalışırken, önü kapanan bir laboratuvar önlüğü ve iki çift eldiven giyilir. Transfekte edilen hücrelerdeki hücresel döküntüleri, yüksek paket yoğunluklu bir ortamla santrifüj ederek uzaklaştırın. İlk olarak, 15 mL'lik konik bir tüpün tabanına 1,5 mL fial pack ekleyin.

Ardından, transfekte edilmiş jerk hat hücrelerini 5 mL PMI ortamı hacminde gradyan materyalin üzerine nazikçe ekleyin. Bu aşamada, transfekte edilmiş jerk hat hücreleri enfeksiyöz HIV üretme kapasitesine sahiptir. Bu nedenle, HIV eksprese eden hücrelerle temas eden tüm pipet uçları %10'luk çamaşır suyu çözeltisi ile dezenfekte edilmelidir.

Biyogüvenlik kabini içindeki bir atık kabına atmadan önce tüpün kapağını kapatın, tüpün dış kısmına %70 ethanol solüsyonu püskürtün ve kuru bir kim wipe ile silin; hücreleri oda sıcaklığında, fren kapalıyken 20 dakika boyunca 400 Gs ile santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, hücreleri medya-pellet arayüzünden dikkatlice uzaklaştırmak için bir pipet kullanın ve hücreleri yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Hüreleri PMI ortamı ile toplam 15 mililitre hacme ulaşana kadar seyreltin ve 10 dakika boyunca 300 GS ile santrifüjleyin.

Oda sıcaklığında, pellet'i üç mililitre jerk hat kültür ortamında süspanse ederiz ve altı kuyucuklu bir plakanın iki santimetrelik bir kuyucuğuna aktarırız. Plakayı, ertesi gün kullanılana kadar doku kültürü inkübatörüne yerleştirin. Aynı günün akşamında, hedef hücreler olarak kullanılan primer CD4 pozitif T hücrelerini, donör hücrelerden ayırt edebilmek için etiketleyin. İlk olarak, altı primer CD4 pozitif T hücresinden 4×10⁶ tanesini 400 G'de 10 dakika santrifüj ederek pelletleyin.

Ardından hücreleri beş mililitre PBS ile yıkayın ve yeniden süspande edin. İki mililitre PBS içinde süspande edin, 1.5 micromolar nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde cell tracker orange ekleyin ve 37 °C'de dakikalarca inkübe edin. Hücrelerin inkübasyonu tamamlandığında, sekiz mililitre tam chica medyumu ekleyin ve 400 ×g'de 10 dakika santrifüj edin.

Hücreleri, mililitre başına 10 unit IL 2 ile desteklenmiş üç mililitre komple medyuma yeniden süspande edin ve gece boyunca doku kültürü inkübatöründe bekletin. Gece boyu süren inkübasyonun ardından, donör ve hedef hücreler hücreden hücreye transfer deneyi için hazır hale gelir. Hücreden hücreye transfer deneyini kurmadan önce, platformu odadaki sıcaklık dalgalanmalarına karşı korumak için görüntüleme haznesini hazırlayın.

Odadaki arka plan ışığını engellemek için, tüm mikroskop ısı düzeneğinin üzerine geniş, siyah bir örtü serilerek sistem çevresinde yalıtılmış bir hava cebi oluşturulur. Görüntüleme haznesi, sıcaklık geri bildirimi için numunenin yanına yerleştirilmiş T tipi bir termokupl ucu bulunan termostatik bir ısıtıcı kullanılarak sabit 37 °C'de tutulur. Numuneyi yerleştirmeden önce 30 dakika boyunca ön ısıtma yapın.

HIV'in hücreden hücreye transferinin 3D konfokal görüntülerini oluşturmak için ters çevrilmiş bir optik mikroskop ile dönen disk konfokal görüntüleme kullanılır. Z tablası da dahil olmak üzere tüm donanım ve veri toplama işlemleri, and veya IQ versiyon 1.8 yazılımı tarafından kontrol edilir; tarama işlemi, hızını tamamlamak amacıyla tarama hızını önemli ölçüde artırmak için eş zamanlı olarak 800'den fazla konfokal nokta kullanan bir CS U 10 dönen disk konfokal ünitesi tarafından gerçekleştirilir. CS U 10, hem fotobeyazlamayı hem de fototoksisiteyi azaltan, düşük ışıkta hızlı görüntüleme yapılmasına olanak tanıyan yüksek hassasiyetli bir elektron çarpanlı şarj coupled cihaz kamera ile eşleştirilmiştir.

Floresan ışık kaynağı, çok dalga boylu bir argon kripton iyon gaz lazeridir. Fotobleaching'i (fotobeyazlama) daha da azaltmak ve görüntüleme süresini uzatmak için güçleri kontrol ederken, burada 488 nanometre ve 568 nanometre olan istenen dalga boylarını seçmek için bir AOTF (akusto-optik ayarlanabilir filtre) kullanılır. AOTF, kamera görüntü toplamadığında, her 15 ila 30 milisaniyelik pozlamayı takiben lazerle hızlıca kapanarak, görüntüler E-M-C-C-D kameradan bilgisayara aktarılırken gereksiz pozlamayı önler.

Lazer ışığı, 405, 488, 568 ve 647 nm dört bantlı dikroik ayna kullanılarak dönen disk sistemine dahil edilir; floresan emisyonu, bir görüntü ayırıcı ile birlikte 560 nanometrelik bir uzun geçiren dikroik ayna kullanılarak dalga boyuna göre ayrıştırılır. Yeşil kanal 525/50 nanometrelik bir bant geçiren filtre ile, kırmızı kanal ise 609/54 nanometrelik bir bant geçiren filtre ile süzülür. İki kanal, E-M-C-C-D kamerasına yan yana yansıtılır.

Görüntüleme odası ısınırken, hücreden hücreye aktarım deneyi için hücreleri hazırlayın. HIV gag IGFP eksprese eden ette hücrelerini saymak için bir hemositometre kullanın. Virüs eksprese eden hücrelere doğrudan maruz kalmayı önlemek için hemositometreyi bir Petri kabına yerleştirin.

Hücreleri karbondioksit bağımsız besiyeri ile yıkayın ve canlı hücre görüntüleme besiyerinde mililitre başına 1 ila 3 × 10⁷ hücre konsantrasyonunda yeniden süspande edin. Karbondioksit bağımsız besiyeri kullanımı, karbondioksit ortam odası ihtiyacını ortadan kaldırır. Görüntüleme için.

Hücreler, daha önce Jurkat hücreleri için gösterildiği gibi sayılır, yıkanır ve işaretli primer CD4 pozitif T hücreleri yeniden süspande edilir. Ardından, hücreden hücreye transfer işlemini başlatmak için 20 µL HIV gag IGFP transfekte edilmiş Jurkat hücresini 40 µL işaretli primer CD4 pozitif T hücresi ile karıştırın ve 50 µL'lik kısmı doku kültürü işleminden geçmiş gaz geçirgen bir EBD mikro odasına yükleyin; odayı tıkaçlarla kapatın ve tıkaçları, tıkaç ile EBD odası arayüzünü parafilm ile sararak sabitleyin.

Görüntüleme haznesini %70 etanol ile ıslatılmış bir kimyasal temizleme beziyle silin ve çeker ocak içinde kısa bir süre havada kurumaya bırakın. Kazara maruziyeti önlemek için mühürlenmiş görüntüleme haznesini kapalı bir kap içerisinde taşıyın. IBD görüntüleme haznesi hücrelerle yüklendikten hemen sonra, taşıma sırasında haznenin düşürülmesi durumunda cihazı mikroskoba monte edin.

Yüksek sayısal açıklığın çözünürlüğü önemli ölçüde artırması sayesinde, her bir 3D görüntü yığınının elde edilme hızını maksimize etmek için hücre çiftlerinin görüntülerini 60 x 1.42 NA yağ daldırma objektifi kullanarak alın. EM CD kamerasının kayıt bölgesini, bir hücre çiftinin hemen çevresindeki alanla sınırlandıracak şekilde kırpın. Ayrıca, bu koşullar altında 0.45 ve 0.75 mikrometre arasındaki geniş bir Z adımı da görüntüleme hızını artırmaya yardımcı olabilir.

Görüntüler 20 ila 60 dakikalık aralıklarla sürekli olarak kaydedilir. Aynı örnek noktasının tekrarlanan görüntülemesi, elde edildiğinde minimum fotobeyazlama ile altı saate kadar uzayabilir. Her bir veri segmenti, toplamda beş ila 20 gigabayt yer kaplayabilen on binlerce görüntüden oluşur.

Büyük dosyaların taşınmasını ve analizini kolaylaştırmak için, her dosya parçalara ayrılır ve bir gigabaytlık TIFF görüntü dosyası segmentleri olarak dışa aktarılır. Elde edilen görüntüleri analiz etmek için çeşitli görüntü analiz yazılım programlarından herhangi birini kullanın. Yoğunluk beyazlama düzeltmesi ile gag punctalarının otomatik ve manuel takibi dahil olmak üzere görüntü analizinin ayrıntıları için beraberindeki yazılı protokole başvurun.

Karıştırma işleminden sonraki 10 ila 15 dakika içerisinde, HIV gag IGFP eksprese eden jerk kedi hücrelerinin primer CD4 pozitif T hücrelerine tutunduğu gözlemlenebilir. Bu konjugatlar aracılığıyla, gag puncta hareketleri hem enfekte hücrelerde hem de hedef hücrelerde değerlendirilebilir. Sinaps oluşumundan sonra, 30 dakika ile üç saat arasında, gag IG FP punctaların hücre izleyici ile markalanmış hedef hücrelere doğru hareketi gözlemlenebilir.

T-hücreleri arasında HIV'nin hücreden hücreye transferinin nasıl görselleştirileceğini gösterdik. Bu prosedürleri uygularken, HIV eksprese eden hücrelere maruz kalmış örneklerle çalışırken tüm biyogüvenlik seviyesi iki artı veya biyogüvenlik seviyesi üç önlemlerine uymayı hatırlamanız çok önemlidir. Ayrıca, transfeksiyonu optimize etmek için iyi bakımlı JCA hücreleri ve endotoksin içermeyen DNA kullanmayı unutmayın.

İşte böyle. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.