Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Bu prosedürün genel amacı, tümöre özgü T hücresi adoptif transfer immünoterapisinin etkinliğini in vivo olarak incelemektir. Bu, ilk olarak, akciğer metastazları oluşturmak için farelere lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla tümör hücrelerinin nakledilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, tümör taşıyan fareleri tümöre özgü sitotoksik T lenfositleri CTL'leri ile tedavi etmektir.

Son adım, tümör nodüllerini görselleştirmek ve ölçmek için bir araç olarak Hindistan mürekkebini kullanmaktır. Sonuç olarak, tümör boyutunun ölçülmesi ve tümör nodüllerinin sayısının ölçülmesi yoluyla farklı tedavilerin CIE'sini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, benim adım Mary Zimmerman ve Georgia Tıp Fakültesi'nde Dr.Kevin Lu'nun laboratuvarının bir üyesiyim.

Merhaba, benim adım Shelene Hu.İkinci sınıf öğrencisiyim ve aynı zamanda Dr.Lou'nun laboratuvarında çalışıyorum. Bu tekniğin hayatta kalma eğrileri gibi geleneksel yöntemlere göre en büyük avantajı, bu prosedürün hem kalitatif hem de Kantitatif olmasıdır. Tekniklerin anlamı, insan kanseri hastalarında T hücresi evlat edinen immünoterapiyi taklit ettiği için kanser tedavisine kadar uzanabilir.

Öyleyse başlayalım: Tümör hücresi enjeksiyonlarından bir gün önce, bir T 75 şişesini bir kere 10'a kadar yedinciye kadar tohumlayın. CMS dört,% 10 serum içeren 10 mililitre RPMI ortamında hücrelerle buluştu. Hızlı büyüyen tümör hücreleri elde etmek için, enjeksiyon gününde gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

Ortamı çıkarın ve hücreleri PBS ile bir kez durulayın, ardından tümör hücrelerini beş dakika boyunca 37 santigrat derecede% 0.05 tripsin EDTA ile toplayın. % 10 serum içeren 10 mililitre RPMI ortamı ile reaksiyonu durdurun. Hücreleri konik bir tüpe aktarın.

Hücreleri 1300 RPM'de bir val legend RT santrifüjünde üç dakika boyunca döndürün. Oda sıcaklığında, snat'ı çıkarın, hücreleri yıkamak için 10 mililitre taze bir XHB Ss içinde tekrar süspanse edin. Sonra tekrar döndürün ve aynı şekilde yeniden askıya alın.

Bir hemo üzerindeki tümör hücrelerini sayın. Sitometre. HBSS'deki hücreleri seyreltin, böylece her enjeksiyon için gerekli hücreler yeniden askıya alınır. Toplam 100 mikrolitrelik bir hacimde, altı ila sekiz haftalık B SEA farelerini ılık suya batırılmış bir beherde ısıtın.

Kuyruk damarını genişletmek için, fareyi bankın üzerindeki bir kuyruk damarı tutucusuna yerleştirin. Lateral kuyruk damarına 100 mikrolitre tümör hücresi enjekte etmek için bir mikro şırınga kullanın. Enjeksiyondan sonra enfeksiyonu önlemek için septik bir teknik kullanın.

Kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine hafif bir baskı uygulayın. Fareyi kafese geri koyun ve tümörün istenen aşamaya gelmesine izin verin. Aktarım gününde, hazırlanan saflaştırılmış sitotoksik T lenfositlerini veya CTL'leri yeniden süspanse etmek için yukarı ve aşağı pipetleyin.

Metinde açıklandığı gibi, tüm hücreleri bir plakadan 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın, hacmin tüpün üçte ikisinden fazlasını aşmasına izin vermeyin. Konik tüpe steril bir Pasteur pipeti yerleştirin ve lenfosit ayrımını katmanlayın. Toplam hacim 14 mililitreye yaklaşana kadar hücrelerin altındaki orta veya LSM.

Katmanları rahatsız etmemeye dikkat edin. Oda sıcaklığında 2000 dakika boyunca 2000 RPM'yi santrifüjleyin. Döndükten sonra rotoru yavaşlatmak için freni kullanmayın, CTL'leri yeni bir 15 mililitrelik konik boruya aktarın.

HBSS'yi yaklaşık 10 mililitrelik bir hacme ekleyin. Yıkamak için. Hücreleri sayın, beş dakika boyunca 1300 RPM'de dönün: Oda sıcaklığında, bir HBSS'yi enjeksiyonlar için gerekli hücre yoğunluğuna yeniden süspanse edin.

Enjeksiyon başına toplam hacmi 100 mikrolitrede tutmak. Bu videoda daha önce görüldüğü gibi aynı kuyruk enjeksiyon tekniğini kullanın. CTL'leri tümör taşıyan farelere enjekte etmek için, fareyi kafese geri koyun ve CTL'lerin tümör ile etkileşime girmesine izin verin.

Fareler genellikle CTL tedavisinden 14 ila 21 gün sonra analiz için sakrifiye edilir. Akciğer metastazlarını görselleştirmek için, kurban edilmiş bir fareyi bir strafor tahtanın üzerine sırt üstü yerleştirin. Trakeaya engelsiz erişim sağlamak için bacakları sabitleyin.

Karın ortasından başlayarak ventral tarafa %70 etanol püskürtün. Orta hat boyunca göğüs kafesinden tükürük bezlerine doğru kesmek için makas kullanın. Trakeayı açığa çıkarın.

Trakeayı çevreleyen dokuları çıkarmak için forseps kullanın. 200 mikrolitrelik bir pipet ucunu trakeanın altına geçirin ve ucu bir elinizle tutun. Trakeayı yavaşça yukarı kaldırın ve vücuttan uzaklaştırın.

Platformu 180 derece döndürün. Hindistan mürekkebini trakea yoluyla akciğerlere enjekte etmek için 50 mililitrelik bir şırınga kullanın. Güçlü bir direnç hissedene kadar akciğerleri mürekkeple tamamen şişirin.

Soluk borusunu kesmek için makas kullanın. Akciğerlerin altına bir çift forseps kaydırın ve fareden kaldırın. Akciğerleri kimyasal bir davlumbazda bir litrelik su kabında kısa bir süre durulayın.

Akciğerleri, beş mililitre FTI çözeltisi içeren bir cam kurulum safrasına aktarın. Tümör dokusu siyah akciğerlerde beyaz nodüller olarak ortaya çıkacaktır. Birkaç dakika sonra, tümörler artık sayılabilir ve süresiz olarak FTI çözeltisine başlayabilir. Burada.

Meme karsinomu ile transfekte edilen fareler için akciğerler. Hücre hattı dört T, biri tümörleri gösteren beyaz lekeler gösterir. K 79 E'ye karşı IRF sekiz baskın negatif bağışıklık ile transfekte edilen fareler, tümör hücrelerinin gelişmiş metastatik potansiyelini gösterir.

Bu görüntüler, CTL adoptif transfer immünoterapisinin etkinliğinin histolojik bir analizini göstermektedir. Salin enjekte edilen tümör taşıyan fareler, altı gün sonra oklarla gösterilen çok sayıda tümör gösterdi. Öte yandan, tümöre özgü T hücreleri enjekte edilen fareler, aynı deneyde tümörlerde bir azalma gösterdi.

Hindistan mürekkep işlemi, CTL evlat edinme transferinin etkinliğini ölçmek için daha basit bir yol sunar. Burada, tümör taşıyan akciğerlerdeki beyaz tümör nodülleri, onları CTL adoptif transferinden başarılı bir şekilde geçen akciğerlerden açıkça ayırır ve nodüllerin sayılması, histoloji ile mümkün olmayan bir dereceye kadar nicelleştirmeye izin verir. Bu prosedürü denerken, daha kolay ve daha doğru kuyruk damarı enjeksiyonları için fareleri ısıtmayı unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, tümör boyutunu ve sayılarını ölçmek için bu basit prosedürle tedavinin etkinliğini nasıl değerlendireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde iyi şanslar.