Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Bu prosedürün genel amacı, tümöre özgü T-hücresi adaptif transfer immünoterapisinin in vivo etkinliğini incelemektir. Bu, öncelikle akciğer metastazlarını oluşturmak amacıyla farelere lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla tümör hücrelerinin nakledilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, tümör taşıyan farelerin tümöre özgü sitotoksik T lenfositleri (CTL'ler) ile tedavi edilmesidir.

Son adım, tümör nodüllerini görselleştirmek ve niceliklerini belirlemek için Çin mürekkebi kullanmaktır. Nihayetinde, tümör boyutunun ölçülmesi ve tümör nodülü sayısının belirlenmesi yoluyla farklı tedavilerin CIE'sini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, benim adım Mary Zimmerman ve Georgia Tıp Koleji'ndeki Dr. Kevin Lu'nun laboratuvarının bir üyesiyim.

Merhaba, benim adım Shelene Hu. İkinci sınıf öğrencisiyim ve aynı zamanda Dr. Lou'nun laboratuvarında çalışıyorum. Bu tekniğin, sağkalım eğrileri gibi geleneksel yöntemlere göre temel avantajı, prosedürün hem kalitatif hem de kantitatif olmasıdır. Bu tekniklerin uygulamaları, insan kanser hastalarındaki T-hücresi adoptif immünoterapisini taklit ettiği için kanser tedavisine kadar uzanabilir.

Haydi başlayalım. Tümör hücresi enjeksiyonlarından bir gün önce, 10% serum içeren 10 mililitre RPMI medyumunda 1x10⁷ CMS4 met hücreyi bir T75 flaska ekleyin. Hızlı büyüyen tümör hücreleri elde etmek için, enjeksiyon gününe kadar 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.

Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile durulayın, ardından tümör hücrelerini 37 °C'de beş dakika boyunca %0,05 trypsin EDTA ile toplayın. Reaksiyonu %10 serum içeren 10 mL RPMI besiyeri ile durdurun. Hücreleri konik bir tüpe aktarın.

Hücreleri val legend RT santrifüjde 1300 RPM'de üç dakika boyunca çöktürün. Oda sıcaklığında süpernatanı uzaklaştırın, yıkama için hücreleri 10 mililitre taze bir XHB Ss içinde yeniden süspande edin. Ardından aynı şekilde tekrar çöktürün ve yeniden süspande edin.

Tümör hücrelerini bir hemo.Cytometer yardımıyla sayın. Her bir enjeksiyon için gerekli hücreler yeniden süspanse edilecek şekilde hücreleri HBSS içinde dilüe edin. Toplam 100 mikrolitre hacminde, altı ila sekiz haftalık B SEA farelerini sıcak su dolu bir beher içinde ısıtın.

Kuyruk venini genişletmek için fareyi tezgah üzerindeki bir kuyruk veni sabitleyiciye yerleştirin. Lateral kuyruk venine 100 µL tümör hücresi enjekte etmek için bir mikro şırınga kullanın. Enjeksiyondan sonra enfeksiyonu önlemek için aseptik teknik uygulayın.

Kanamayı durdurana kadar enjeksiyon bölgesine hafifçe baskı uygulayın. Fareyi kafesine geri yerleştirin ve tümörün istenen aşamaya gelmesini bekleyin. Transfer gününde, hazırlanan saflaştırılmış sitotoksik T lenfositlerini veya CTL'leri yeniden süspande etmek için pipetle aşağı yukarı karıştırın.

Metinde açıklandığı gibi, tüm hücreleri bir plakadan 15 mililitrelik konik tüpe aktarın ve hacmin tüpün üçte ikisinden fazla olmasına izin vermeyin. Konik tüpe steril bir Pasteur pipeti yerleştirin ve toplam hacim 14 mililitreye yaklaşana kadar hücrelerin altına lenfosit ayırma ortamı veya LSM ekleyin.

Katmanları bozmamaya dikkat edin. Oda sıcaklığında 2000 RPM hızda 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işlemi bittikten sonra rotoru yavaşlatmak için freni kullanmayın, CTL'leri yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.

Yaklaşık 10 mililitre hacme ulaşana kadar HBSS ekleyin. Yıkamak için, hücreleri oda sıcaklığında beş dakika boyunca 1300 RPM hızında santrifüjleyerek çöktürün. Enjeksiyonlar için gerekli hücre yoğunluğuna ulaşmak üzere HBSS ile tekrar süspande edin.

Enjeksiyon başına toplam hacmi 100 µL olarak tutun. Bu videonun önceki kısımlarında gösterilen kuyruk enjeksiyon tekniğini uygulayın. CTL'leri tümör taşıyan farelere enjekte etmek için fareyi kafesine geri koyun ve CTL'lerin tümörle etkileşime girmesine izin verin.

Fareler genellikle CTL tedavisinden 14 ila 21 gün sonra analiz için sakrifiye edilir. Akciğer metastazlarını görüntülemek için, sakrifiye edilen fareyi bir strafor tahta üzerine sırt üstü yerleştirin. Trakeaya engelsiz erişim sağlamak için bacakları iğneleyin.

Karın orta kısmından başlayarak ventral tarafı %70 ethanol ile püskürtün. Makas kullanarak göğüs kafesi boyunca orta hat üzerinden tükürük bezlerine doğru kesin. Trakeayı açığa çıkarın.

Trakeayı çevreleyen dokuları uzaklaştırmak için pens kullanın. Bir elinizle tuttuğunuz 200 µL pipet ucunu trakeanın altına yerleştirin. Trakeayı nazikçe yukarı kaldırarak vücuttan ayırın.

Platformu 180 derece döndürün. Trakea üzerinden akciğerlere Çin mürekkebi enjekte etmek için 50 mililitrelik bir şırınga kullanın. Güçlü bir direnç hissedene kadar akciğerleri mürekkeple tamamen şişirin.

Trakeayı kesmek için makas kullanın. Bir pensetle akciğerlerin altına girerek onları fareden dışarı çıkarın. Akciğerleri, kimyasal çeker ocak içerisindeki bir litrelik su dolu bir beherde kısa süreliğine durulayın.

Akciğerleri, beş mililitre FTI çözeltisi içeren cam bir düzeneğe aktarın. Tümör dokusu, siyah akciğerler üzerinde beyaz nodüller şeklinde belirecektir. Birkaç dakika sonra tümörler sayılabilir ve süresiz olarak FTI çözeltisi içinde saklanabilir.

Meme karsinomu ile transfekte edilmiş farelerin akciğerleri. Hücre hattı four T one, tümörleri belirten beyaz benekler göstermektedir. IRF eight dominant negatif immune to K 79 E ile transfekte edilen fareler, tümör hücrelerinin artmış metastatik potansiyelini göstermektedir.

Bu görüntüler, CTL adoptif transfer immünoterapisinin etkinliğinin histolojik analizini göstermektedir. Serum fizyolojik enjekte edilen tümör taşıyıcı farelerde, altı gün sonra oklarla belirtilen çok sayıda tümör görülmüştür. Öte yandan, tümöre özgü T hücreleri enjekte edilen farelerde aynı deneyde tümörlerde azalma görülmüştür.

Çin mürekkebi işlemi, CTL adoptif transferinin etkinliğini ölçmek için daha basit bir yol sunar. Burada, tümör taşıyan akciğerlerdeki beyaz tümör nodülleri, CTL adoptif transferi başarıyla gerçekleştirilmiş akciğerlerden açıkça ayırt edilmektedir ve nodüllerin sayılması, histoloji ile mümkün olmayan bir derecede nicelleştirme sağlar. Bu prosedürü uygularken, daha kolay ve daha doğru kuyruk veni enjeksiyonları için farelerin ısıtılması gerektiğini unutmamak önemlidir.

Bu videoyu izledikten sonra, tümör boyutunu ve sayısını belirlemek için kullanılan bu basit prosedür aracılığıyla tedavinin etkinliğinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.