Name: Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-26T15:03:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Öğrenin, farelerde deneysel akciğer metastazı modeli oluşturmayı ve sitotoksik T lenfositlerle immünoterapi uygulayarak tümör nodüllerini India mürekkebiyle görselleştirmeyi. Bu yöntem kanser tedavisi araştırmalarında tedavi etkinliğini nicel olarak değerlendirmeye olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ulusal Sağlık Enstitüleri (KL için CA133085) ve Amerikan Kanser Derneği (KL RSG-09-209-01-TBG) hibe ile desteklenir.

1. Deneysel metastaz Fare Modeli <ol><li> Gün önce tümör hücresi enjeksiyonları, 1'e kadar tohum T75 balon x 10 7 CMS4 Met hücreleri RPMI orta hızlı büyüyen tümör hücreleri elde etmek için% 10 serum içeren 10 ml. 37 o gece inkübe ° C </li><li> Enjeksiyon gününde, orta kaldırmak ve hücreler PBS ile bir kez yıkayın, sonra 37 0.05% tripsin-EDTA ile tümör hücrelerinin hasat ° C 5 dakika. 10 ml% 10 serum içeren RPMI orta ile reaksiyon durdurun. Konik bir tüp hücreleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 3 dakika 1300 rpm'de Sorvall Legend RT santrifüj hücreleri aşağı spin. Süpernatantı. Yıkamak için 10 ml taze 1X HBSS hücrelerin yeniden süspanse edin, sonra tekrar aşağı spin ve aynı şekilde tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Bir hemasitometre tümör hücreleri saymak. Böylece her enjeksiyon için gerekli hücrelerin toplam hacmi 100 mcL yeniden süspanse, HBSS hücrelerin sulandırınız. </li><li> Kuyruk ven genişletmek için ılık suya batırılmış beher 6-8 haftalık BALB / c farelerde ısıtın. Fare, bankta bir kuyruk ven süzgeç koyun. 100 mcL tümör hücrelerinin lateral kuyruk damar içine enjekte etmek için bir mikroenjektör kullanın. Bulaşmasını önlemek için aseptik teknik kullanın. Kanama durduktan kadar enjeksiyondan sonra enjeksiyon yerinde hafif bir basınç uygulayın. </li><li> Fare kafesine geri dönün ve istenilen aşamada tümör büyümesine izin. </li></ol> 2. Sitotoksik T-Lenfosit (KVK) Kabul edilmiş Transferi İmmünoterapi <ol><li> Transfer gününde, saflaştırılmış T-lenfositleri sitotoksik ya da CTL, metinde açıklandığı gibi hazırlanmış tekrar süspansiyon pipet ve aşağı yukarı. Hacmi daha fazla tüpün 2 / 3 'ünden fazla izin vermeyen, tüm hücreleri bir plaka 15 ml konik tüp transferi. </li><li> Steril bir Pasteur pipeti konik tüp içine yerleştirin ve toplam hacmi 14 ml yaklaştığında kadar hücrelerin altında, Lenfosit Ayırma, Orta veya LSM yatıyordu. </li><li> Katmanları rahatsız etmemek için dikkatli olun. Oda sıcaklığında 20 dakika 2000 rpm'de santrifüjleyin. Sonra rotor iplik yavaş fren kullanmayın. </li><li> Yeni bir 15 ml konik tüp CTL'lerin aktarın. Yıkamak için yaklaşık 10 ml hacmi HBSS ekleyin. </li><li> Hücreleri saymak. Oda sıcaklığında 5 dakika 1300 rpm'de Spin. Enjeksiyon başına toplam hacmi 100 mcL tutarak, enjeksiyon için gerekli hücre yoğunluğu HBSS tekrar </li><li> CTL'lerin Tümör taşıyan farelere enjekte etmek için bu video daha önce görüldüğü gibi aynı kuyruk enjeksiyon tekniği kullanın. </li><li> Fare kafesine geri dönün ve CTL tümör ile etkileşim kurmak için izin. Fareler genellikle 14-21 gün CTL tedavi sonra analiz için feda. </li></ol> 3. Akciğer metastaz, Görselleştirme <ol><li> Akciğer metastazları görselleştirmek için, plastik bir yönetim kurulu sırtını bir kurban fare yerleştirin. Trakea engelsiz erişim sağlamak için bacaklarını Pin. % 70 etanol ile ventral taraf püskürtün. </li><li> , Orta karın itibaren, göğüs kafesi, tükürük bezlerinin doğru, orta hat boyunca kesme, ve makas kullanın. Trakea Açığa. Trakea çevre dokulara çıkarmak için forseps kullanın. </li><li> Trakea altında 200 mcL pipet geçirin. Tek elle Holding ucu hafifçe vücuttan trakea yukarı kaldırın ve uzak. </li><li> Platform 180 ° döndür. Trakea yoluyla ciğerlerine Hindistan Mürekkep enjekte etmek için 50 ml şırınga kullanın. Güçlü bir direnç hissedene kadar mürekkep ile akciğerler tamamen şişirmek. </li><li> Trakea kesmek için makas kullanın. Slayt, akciğerlerin altında forseps bir çift ve onları farenin dışarı çıkarın. Akciğerlerde su 1L beher kısaca durulayın. </li><li> Kimyasal bir davlumbaz, Fekete çözüm 5 ml cam sintilasyon içeren bir flakon için akciğerlere transfer. Tümör dokusu, birkaç dakika sonra siyah akciğerler üzerindeki beyaz nodüller olarak ortaya çıkacaktır. Tümörler şimdi sayılır ve süresiz Fekete çözümü olarak saklanabilir. </li></ol> 4. Görüntülenmiştir Akciğerler Temsilcilik Metastazları <ol><li> Burada, meme karsinom hücre hattı 4T1 ile enjekte edilen farelerden alınan akciğerlerin tümörler gösteren beyaz lekeler gösteriyor. Bir IRF8 dominant-negatif mutant K79E ile transfekte 4T1 hücreleri enjekte edildi Fare, tümör hücrelerinin gelişmiş metastatik potansiyelini gösteriyor. </li><li> Bu görüntüler CTL evlatlık transfer immünoterapi etkinliği bir histolojik analiz göstermektedir. Tümör taşıyan farelere enjekte edildi sarı oklar (A) ile gösterilir, 6 gün sonra birden fazla tümörler gösterdi. Tümör spesifik T hücreleri ile enjekte edilen farelerin, diğer taraftan, tümörler (B) bir azalma gösterdi. </li><li> Aynı deneyde, Hindistan mürekkep tedavi CTL evlatlık transferi etkinliğini ölçmek için basit bir yol verir. Burada, tümör taşıyan akciğerler üzerindeki beyaz tümör nodülü CTL evlatlık transferi başarıyla geçirmiş ve nodüller sayma akciğerler açıkça ayırt bir dereceye kadar izin verirhistoloji ile kantitatif mümkün değildir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Deneysel deneysel tümör metastazı ve CTL adaptif transfer immünoterapi fare modeli şeması. Kırmızı nokta, tümör hücreleri ve yeşil noktalar CTL'lerin göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 IRF8 fonksiyonunun bozulması, tümör hücrelerinin metastatik potansiyeli geliştirilmiş . Fare meme karsinom hücre hattı 4T1 stably vektör (4T1.Vector) veya vektör bir IRF8 dominant-negatif mutant K79E (4T1.IRF8K79E) (15, 16) ifade ile transfekte edildi. Tümör hücreleri fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Tümör taşıyan akciğerleri tümör nodülü görselleştirmek Türkiye mürekkep ile şişirildi. Tümör nodüller kolaylıkla siyah akciğer dokusunda arka plan üzerinde beyaz lekeler olarak görülür. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 CTL evlatlık transfer immünoterapi etkinliğini histolojik analiz. Fare sarkom hücre hattı CMS4-met fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Üç gün sonra, tuzlu su (A) veya tümör-spesifik T hücrelerinin (B) Tümör taşıyan farelere enjekte edildi. Akciğerler geleneksel H &amp; E histolojik boyama tarafından CTL tedavi altı gün sonra incelendi. Tümör nodüller oklarla gösterilir. <img src="/files/ftp_upload/2077/2077fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Hindistan mürekkep enflasyon tümör nodülleri Görselleştirme. Fare sarkom hücre hattı CMS4-met fare lateral kuyruk damarlar halinde iv enjekte edildi. Üç gün sonra, serum fizyolojik (kontrol) veya tümör-spesifik T hücreleri (CTL) Tümör taşıyan farelere enjekte edildi. Akciğerler, ondört gün CTL tedavi sonra incelendi. Tümör nodülü olan beyaz noktalar, kolay CTL tedavinin etkinliğinin ölçümü için izin verir.

<ol><li>Ryan, M. H., Bristol, J. A., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+extensive+pulmonary+metastases+in+mice+by+adoptive+transfer+of+antigen-specific+CD8%28%2B%29+CTL+reactive+against+tumor+cells+expressing+a+naturally+occurring+rejection+epitope%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regression of extensive pulmonary metastases in mice by adoptive transfer of antigen-specific CD8(+) CTL reactive against tumor cells expressing a naturally occurring rejection epitope.</a> J Immunol. 167 (8), 4286-4292 (2001).</li>
<li>Caldwell, S. A., Ryan, M. H., McDuffie, E., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Fas%2FFas+ligand+pathway+is+important+for+optimal+tumor+regression+in+a+mouse+model+of+CTL+adoptive+immunotherapy+of+experimental+CMS4+lung+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Fas/Fas ligand pathway is important for optimal tumor regression in a mouse model of CTL adoptive immunotherapy of experimental CMS4 lung metastases.</a> J Immunol. 171 (5), 2402-2412 (2003).</li>
<li>Liu, K., Caldwell, S. A., Greeneltch, K. M., Yang, D., Abrams, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CTL+Adoptive+Immunotherapy+Concurrently+Mediates+Tumor+Regression+and+Tumor+Escape%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">CTL Adoptive Immunotherapy Concurrently Mediates Tumor Regression and Tumor Escape.</a> J Immunol. 176 (6), 3374-3382 (2006).</li>
<li>Yang, D., Stewart, T. J., Smith, K. K., Georgi, D., Abrams, S. I., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downregulation+of+IFN-gammaR+in+association+with+loss+of+Fas+function+is+linked+to+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Downregulation of IFN-gammaR in association with loss of Fas function is linked to tumor progression.</a> International journal of cancer. 122 (2), 350-362 (2008).</li>
<li>Pages, F., Berger, A., Camus, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+memory+T+cells%2C+early+metastasis%2C+and+survival+in+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353 (25), 2654-2666 (2005).</li>
<li>Galon, J., Costes, A., Sanchez-Cabo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type%2C+density%2C+and+location+of+immune+cells+within+human+colorectal+tumors+predict+clinical+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Type, density, and location of immune cells within human colorectal tumors predict clinical outcome.</a> Science. 313 (5795), 1960-194 (2006).</li>
<li>Strater, J., Hinz, U., Hasel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+CD95+expression+predisposes+for+recurrence+in+curatively+resected+colon+carcinoma%3A+clinical+evidence+for+immunoselection+and+CD95L+mediated+control+of+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Impaired CD95 expression predisposes for recurrence in curatively resected colon carcinoma: clinical evidence for immunoselection and CD95L mediated control of minimal residual disease.</a> Gut. 54 (5), 661-665 (2005).</li>
<li>Camus, M., Tosolini, M., Mlecnik, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+intratumoral+immune+reaction+and+human+colorectal+cancer+recurrence%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Coordination of intratumoral immune reaction and human colorectal cancer recurrence.</a> Cancer research. 69 (6), 2685-2693 (2009).</li>
<li>Dudley, M. E., Wunderlich, J. R., Yang, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+cell+transfer+therapy+following+non-myeloablative+but+lymphodepleting+chemotherapy+for+the+treatment+of+patients+with+refractory+metastatic+melanoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Adoptive cell transfer therapy following non-myeloablative but lymphodepleting chemotherapy for the treatment of patients with refractory metastatic melanoma.</a> J Clin Oncol. 23 (10), 2346-2357 (2005).</li>
<li>Srivastava, M. K., Sinha, P., Clements, V. K., Rodriguez, P., Ostrand-Rosenberg, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloid-derived+suppressor+cells+inhibit+T-cell+activation+by+depleting+cystine+and+cysteine.+Cancer+research%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Myeloid-derived suppressor cells inhibit T-cell activation by depleting cystine and cysteine. Cancer research.</a> 70 (1), 68-77 (2010).</li>
<li>Nagaraj, S., Gabrilovich, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+escape+mechanism+governed+by+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Tumor escape mechanism governed by myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer research. 68 (8), 2561-2563 (2008).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nature reviews. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Heijstek, M. W., Kranenburg, O., Rinkes, B. orel, H, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+colorectal+cancer+and+liver+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+surgery%22%5BJournal%5D)">Mouse models of colorectal cancer and liver metastases.</a> Digestive surgery. 22 (1-2), 1-2 (2005).</li>
<li>Yang, D., Ud Din, N., Browning, D. D., Abrams, S. I., Liu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+lymphotoxin+beta+receptor+with+tumor-specific+T+lymphocytes+for+tumor+regression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Targeting lymphotoxin beta receptor with tumor-specific T lymphocytes for tumor regression.</a> Clin Cancer Res. 13 (17), 5202-5210 (2007).</li>
<li>Yang, D., Thangaraju, M., Browning, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IFN+Regulatory+Factor+8+Mediates+Apoptosis+in+Nonhemopoietic+Tumor+Cells+via+Regulation+of+Fas+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">IFN Regulatory Factor 8 Mediates Apoptosis in Nonhemopoietic Tumor Cells via Regulation of Fas Expression.</a> J Immunol. 179 (7), 4775-4782 (2007).</li>
<li>Yang, D., Thangaraju, M., Greeneltch, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repression+of+IFN+regulatory+factor+8+by+DNA+methylation+is+a+molecular+determinant+of+apoptotic+resistance+and+metastatic+phenotype+in+metastatic+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Repression of IFN regulatory factor 8 by DNA methylation is a molecular determinant of apoptotic resistance and metastatic phenotype in metastatic tumor cells.</a> Cancer research. 67 (7), 3301-3309 (2007).</li>
<li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+identification+of+experimental+pulmonary+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Accurate identification of experimental pulmonary metastases.</a> Journal of the National Cancer Institute. 36 (4), 641-645 (1966).</li>
</ol>

Fare Ulusal Kanser Enstitüsü (Friderick MD) alınan ve Georgia hayvan tesis Tıp Koleji alır. Deneyler ve bakım / refah federal düzenlemeler ile anlaşma ve Georgia IACUC komitesinin Tıp Koleji tarafından onaylanmış bir protokol.

Çözümler: Hindistan Mürekkep Çözümü (17): <ol><li> 150 ml, 250 ml balona distile su dökün. </li><li> 4 damla amonyum hidroksit, distile su ekleyin. </li><li> 30 ml Hindistan Mürekkep stok (yani Sanford Black Magic su geçirmez Çizim Mürekkep 4465 Öğe 44.011), amonyak ve su karışımı ekleyin. </li><li> 200 ml&#39;lik bir hacim distile su ile kapalı üst. Çözüm enjeksiyon için hazırdır. </li></ol> Fekete Çözümü (17): Fekete çözümü normal dokuların siyah arka plan beyaz tümör nodülü ayırt etmek için ağartıcı Hindistan mürekkep şişirilmiş tümör taşıyan akciğerler için kullanılır. <ol><li> 1L cam şişe, 350ml 95% EtOH ekleyin. </li><li> 150ml distile su ekleyin </li><li> 50ml formaldehit </li><li> 25ml buzul asidik asit ekle </li></ol>

deneysel metastaz ve ctl kabul edilmiş transfer İmmünoterapi fare modeli

Experimental Metastasis and CTL Adoptive Transfer Immunotherapy Mouse Model

Deneysel metastaz fare modeli basit ve fizyolojik ilgili henüz metastaz modeli. Tümör hücrelerinin fare kuyruğu damarlar içine (iv) damar içine enjekte ve tümör hücre spontan metastaz son adımları benzeyen, böylece, akciğerlerde kolonize: distal organlarda kan dolaşımı, ekstravazasyonu ve sömürgeciliğin yaşam. Metastatik tümör distal organ yılında kurulan: tedavilerin hedef genellikle metastaz bitiş noktası bu yana tedavi edici bir açıdan bakıldığında, deneysel metastaz modeli en basit ve ideal bir model. Bu modelde, tümör hücrelerinin fare kuyruğu damarlar içine iv enjekte edilir ve akciğerlerde kolonize ve büyümeye izin. Tümör spesifik CTL sonra iv metastaz taşıyan fare içine enjekte edilir. Akciğer metastazları sayısını ve boyutunu enjekte edilecek tümör hücrelerinin sayısı ve tümör büyümesini zaman kontrol edilebilir. Bu nedenle, çeşitli aşamalarında metastaz, geniş metastaz minimal metastaz modellenmiş olabilir. Akciğer metastazı, böylece daha kolay görsel gözlem ve miktar sağlayarak, mürekkep ile enflasyon analiz edilir.

Tümör hücrelerinin T hücre etkileşimi analizi için deneysel bir akciğer metastazı ve CTL immünoterapi fare modeli<em&gt; In vivo</em&gt;.

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Deneysel metastaz fare modeli, basit ancak fizyolojik olarak anlamlı bir metastaz modelidir. Tümör hücreleri intravenöz (i.v.) olarak ... içine enjekte edilir.

Bu prosedürün genel amacı, tümöre özgü T-hücresi adaptif transfer immünoterapisinin in vivo etkinliğini incelemektir. Bu işlem, öncelikle akciğer metastazlarını oluşturmak amacıyla farelere lateral kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla tümör hücreleri transplantasyonu yapılarak gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, tümör taşıyan farelerin tümöre özgü sitotoksik T lenfositleri (CTL'ler) ile tedavi edilmesidir.Son adım, tümör nodüllerini görselleştirmek ve nicelendirmek için bir araç olarak Çin mürekkebi kullanmaktır. Nihayetinde, tümör boyutunun ölçülmesi ve tümör nodülü sayısının nicelendirilmesi yoluyla farklı tedavilerin CIE değerlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Merhaba, benim adım Mary Zimmerman ve Georgia Tıp Koleji'ndeki Dr. Kevin Lu'nun laboratuvarının bir üyesiyim.Merhaba, benim adım Shelene Hu. İkinci sınıf öğrencisiyim ve aynı zamanda Dr. Lou'nun laboratuvarında çalışıyorum. Bu tekniğin sağkalım eğrileri gibi geleneksel yöntemlere göre temel avantajı, bu prosedürün hem kalitatif hem de kantitatif olmasıdır. Tekniklerin uygulamaları, insan kanser hastalarındaki T-hücresi adaptif immünoterapisini taklit ettiği için kanser tedavisine kadar genişleyebilir.Hadi başlayalım. Tümör hücresi enjeksiyonlarından bir gün önce, %10 serum içeren 10 mL RPMI medyumunda 1x10⁷ CMS4MET hücresi olacak şekilde bir T75 flaskı ekimleyin. Hızlı büyüyen tümör hücreleri elde etmek için enjeksiyon gününe kadar 37 °C'de gece boyunca inkübe edin.Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri bir kez PBS ile durulayın, ardından tümör hücrelerini 37 °C'de beş dakika boyunca %0,05 trypsin EDTA ile hasat edin. Reaksiyonu %10 serum içeren 10 mL RPMI besiyeri ile durdurun. Hücreleri konik bir tüpe aktarın.Hücreleri, oda sıcaklığındaki (RT) bir santrifüjde 1300 RPM hızda üç dakika boyunca çöktürün. Oda sıcaklığında süpernatantı uzaklaştırın, hücreleri yıkamak için 10 mililitre taze 1X HB SS içerisinde yeniden süspande edin. Ardından aynı şekilde tekrar çöktürün ve yeniden süspande edin.Tümör hücrelerini bir hemo.Cytometer ile sayın. Her bir enjeksiyon için gerekli hücreler yeniden süspanse edilecek şekilde hücreleri HBSS içinde seyreltin. Altı ila sekiz haftalık B SEA farelerini, sıcak su dolu bir beherin içinde ısıtarak toplam 100 mikrolitre hacme getirin.Kuyruk venini genişletmek için fareyi tezgah üzerindeki bir kuyruk ven sabitleyiciye yerleştirin. Lateral kuyruk venine 100 µL tümör hücresi enjekte etmek için bir mikro şırınga kullanın. Enjeksiyondan sonra enfeksiyonu önlemek için aseptik teknik uygulayın.Kanama durana kadar enjeksiyon bölgesine hafifçe baskı uygulayın. Fareyi kafesine geri koyun ve tümörün istenen aşamaya gelene kadar büyümesini bekleyin. Transfer gününde, hazırlanan saflaştırılmış sitotoksik T lenfositlerini veya CTL'leri yeniden süspansiyona getirmek için pipetle aşağı yukarı karıştırın.Metinde açıklandığı üzere, tüm hücreleri bir plakadan 15 millilitre konik tüpe aktarın ve hacmin tüpün üçte ikisini geçmesine izin vermeyin. Konik tüpe steril bir Pasteur pipeti yerleştirin ve toplam hacim 14 millilitreye yaklaşana kadar hücrelerin üzerine lenfosit ayırma ortamı veya LSM ekleyin.Katmanları bozmamaya dikkat edin. Oda sıcaklığında 2000 RPM hızda 20 dakika santrifüjleyin. Santrifüj işlemi bittikten sonra rotoru yavaşlatmak için freni kullanmayın, CTL'leri yeni bir 15 mililitrelik konik tüpe aktarın.Yaklaşık 10 mililitre hacimde HBSS ekleyin. Yıkamak için hücreleri oda sıcaklığında, 1300 RPM'de beş dakika santrifüjleyin. Enjeksiyonlar için gerekli hücre yoğunluğuna ulaşana kadar HBSS ile yeniden süspande edin.Enjeksiyon başına toplam hacmi 100 µL düzeyinde tutun. Bu videonun daha önceki bölümlerinde görülen kuyruk enjeksiyon tekniğinin aynısını uygulayın. CTL'leri tümör taşıyan farelere enjekte etmek için fareyi kafesine geri koyun ve CTL'lerin tümörle etkileşime girmesine izin verin.Fareler genellikle CTL tedavisinden 14 ila 21 gün sonra analiz için sakrifiye edilir. Akciğer metastazlarını görüntülemek için, sakrifiye edilmiş bir fareyi sırtı üzerine gelecek şekilde bir strafor levhaya yerleştirin. Trakeaya engelsiz erişim sağlamak için bacaklarını iğneleyin.Karın orta kısmından başlayarak ventral tarafı %70 ethanol ile püskürtün. Makas kullanarak göğüs kafesi boyunca orta hat üzerinden tükürük bezlerine doğru kesin. Trakeayı açığa çıkarın.Trakeayı çevreleyen dokuları uzaklaştırmak için pens kullanın. Bir elinizle tutarak 200 µL'lik bir pipet ucunu trakeanın altına yerleştirin. Trakeayı nazikçe yukarı kaldırarak vücuttan ayırın.Platformu 180 derece döndürün. Trake üzerinden akciğerlere India ink enjekte etmek için 50 mililitrelik bir şırınga kullanın. Güçlü bir direnç hissedene kadar akciğerleri mürekkeple tamamen şişirin.Trakeayı kesmek için makas kullanın. Bir pensetle akciğerlerin altına girerek onları fareden çıkarın. Akciğerleri, kimyasal çeker ocak içindeki bir litrelik su dolu bir beherde kısa süreliğine yıkayın.Akciğerleri, beş mililitre FTI çözeltisi içeren cam bir kaba aktarın. Tümör dokusu, siyah akciğerler üzerinde beyaz nodüller şeklinde belirecektir. Birkaç dakika sonra tümörler sayılabilir ve FTI çözeltisi içerisinde süresiz olarak saklanabilir.Meme karsinomu ile transfekte edilmiş farelerin akciğerleri. Cell line four T one hattı, tümörleri belirten beyaz lekeler göstermektedir. IRF sekiz dominant negatif immune K 79 E ile transfekte edilen fareler, tümör hücrelerinin artmış metastatik potansiyelini göstermektedir.Bu görüntüler, CTL adaptif transfer immünoterapisinin etkinliğinin histolojik analizini göstermektedir. Salin enjekte edilen tümör taşıyıcısı farelerde, altı gün sonra oklarla belirtilen çok sayıda tümör görülmüştür. Diğer yandan, tümöre özgü T hücreleri enjekte edilen farelerde aynı deneyde tümörlerde azalma görülmüştür.Çin mürekkebi uygulaması, CTL adaptif transferinin etkinliğini ölçmek için daha basit bir yol sunar. Burada, tümör taşıyan akciğerlerdeki beyaz tümör nodülleri, onları CTL adaptif transferi başarıyla gerçekleşmiş akciğerlerden açıkça ayırır ve nodüllerin sayılması, histoloji ile mümkün olmayan bir derecede nicelleştirme sağlar. Bu prosedürü uygularken, daha kolay ve daha doğru kuyruk veni enjeksiyonları için fareleri ısıtmayı hatırlamak önemlidir.Bu videoyu izledikten sonra, tümör boyutunu ve sayısını belirlemeye yönelik bu basit prosedür aracılığıyla tedavinin etkinliğinin nasıl değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

experimental-metastasis-ctl-adoptive-transfer-immunotherapy-mouse

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Kanserin metastaz kansere bağlı ölümlerin önemli bir nedenidir. Biz solid organ tümörlerinin metastaz mekanizmaları çalışmak için bir "hasta" gibi ortotopik singenik fare modeli sistemi kurulması için hayatta kalma cerrahi yönteminin derinlemesine bir açıklama sağlar.

Bir &quot;Hasta gibi&quot; Ortotopik singenik Fare Modeli Hepatoselüler karsinomu metastazı

Ortotopik meme kanseri primer tümör modeli ve primer tümörün cerrahi olarak çıkarılması açıklanan spontan metastaz oluşturmak için fare ömrünü uzatmak için. tümör büyümesi ve ilerlemesi izlenir ve lusiferaz floresan görüntüleme ile ölçülür.

Spontan Meme Kanseri metastaz Ortotopik Fare Modeli

Metastatik klonların uzak bölgeleri kolonize etme yeteneği, çoğalma kapasitelerine ve/veya önemli bir çoğalma olmaksızın konakçı mikro ortamda hayatta kalma yeteneklerine bağlıdır. Burada, metastatik klonlar tarafından her iki tip karaciğer kolonizasyonunun kantitatif olarak görselleştirilmesine izin veren bir hayvan modeli sunuyoruz.

İleri Hayvan Karaciğer Kolorektal Metastaz Model: Görüntüleme Teknikleri ve Metastatik Klonların Özellikleri

Burada, hastalarda fonksiyonel olarak bir Ommaya rezervuarı andıran bir murine ksinograft modelini tarif ediyoruz. Murine Ommaya'yı evrensel olarak ölümcül leptomeningeal hastalık için yeni terapötikleri incelemek için geliştirdik.

Leptomeningeal Hastalığın Doğrudan Hedefli Tedavisini Incelemek için Bir Murine Ommaya Xenograft Modeli

Burada, bir fare tümörü modelinde tümöre özgü ve periferi kaynaklı tümör kaynaklı lenfositlerin karakterizasyonu için bir tümör transplantasyon protokolü sunulmaktadır. Alıcı kaynaklı immün hücrelerin akışının akım sitometrisi ile spesifik olarak izlenmesi, antitümör immün yanıtlar sırasında bu hücrelerin fenotipik ve fonksiyonel değişikliklerinin dinamiklerini ortaya koymaktadır.

Farelerde Tümör Sızan CD8 + T Hücrelerinin Dinamiğini Değerlendirmek için Tümör Transplantasyonu

Bu makalede, melanom metastazının yeni aday aracılarını ve etki mekanizmalarını test etmek için kullanılan tekniklerin bir iş akışı açıklanmaktadır.

Melanom Metastazının Yeni Arabulucularının Belirlenmesi için Sağlam Bir Keşif Platformu

Protokol, Flt3L eksprese eden B16-F10 melanomu ile hücre bazlı tümör aşılamasını kullanan bir kanser immünoterapi modeli sunmaktadır. Bu protokol, kültürlenmiş tümör hücrelerinin hazırlanması, tümör implantasyonu, hücre ışınlaması, tümör büyümesinin ölçülmesi, intratümöral immün hücrelerin izolasyonu ve akış sitometrisi analizi dahil olmak üzere prosedürleri göstermektedir.

Hematopoetik Sitokin ile Tümör Aşılaması Kullanılarak Deneysel Melanom İmmünoterapi Modeli

Bu protokol, immün yetmezliği olan farelerin çekum duvarına hasta kaynaklı kanser hücrelerinin ortotopik implantasyonunu açıklar. Model, ilerlemiş kolorektal kanser metastatik hastalığını özetler ve klinik olarak anlamlı bir akciğer ve karaciğer metastazı senaryosunda yeni terapötik ilaçların değerlendirilmesine izin verir.

Farelerde Hasta Kaynaklı Kanser Hücrelerinin Ortotopik İmplantasyonu, İleri Kolorektal Kanseri Özetliyor

Burada sunulan deneysel tasarım, lenf nodu (LN) metastazı sırasında antijene özgü CD8+ T hücrelerinin çalışmaları için yararlı bir üreme modeli sağlar, bu da seyirci CD8+ T hücrelerinin bozulmasını dışlar.

Tümör Oluşumu Sırasında Antijene Özgü CD8+ T Hücrelerinin Dinamiğinin Değerlendirilmesi için Drenaj Lenf Nodu Metastazı Modeli

Evlat edinen hücre transferi için farelerden alınan tümör infiltre lenfositleri (TIL'ler) akış sitometrisi yoluyla kullanmak için bir yöntem tanımladık. Bu protokol, sinjeneik pankreas kanseri fare modelinde tümörlere karşı TIL'lerin spesifik sitotoksisitesini doğrulamayı ve pankreas kanseri için evlat edinen hücre tedavilerinin geliştirilmesine ilişkin içgörüler sağlamayı amaçlamaktadır.

Pankreas Kanserinin Bir Fare Modelinde Tümör İnfiltre Eden Lenfositlerin Flow Sitometri Tabanlı İzolasyonu ve Terapötik Değerlendirmesi

Öğrenin, farelerde deneysel akciğer metastazı modeli oluşturmayı ve sitotoksik T lenfositlerle immünoterapi uygulayarak tümör nodüllerini India mürekkebiyle görselleştirmeyi. Bu yöntem kanser tedavisi araştırmalarında tedavi etkinliğini nicel olarak değerlendirmeye olanak tanır.

Deneysel metastaz ve CTL Kabul edilmiş Transfer İmmünoterapi Fare Modeli

Daha fazla video keşfet