Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

Bu prosedürün genel amacı, nefrotoksin olarak AMG Glikozid Gentamisin kullanarak zebra balıklarında akut böbrek hasarı modeli oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle döllenmeden sonraki ikinci gündeki zebra balığı larvalarının ortak kardinal venine gentamisin enjekte edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, döllenmeden sonraki dördüncü gündeki enjekte edilmiş larvalarda emus fenotiplerinin skorlanmasıdır.

Prosedürün üçüncü adımı, döllenmeden sonraki dördüncü gündeki zebrafish'lerin, böbrek tübül epiteli am antikoru ile immünohistokimyasal boyama için işlenmesidir. Prosedürün son adımı, zebrafish larvalarının kesitlerinin alınması ve hücre polaritesinin kaybı ile tübül yapısının bozulması nedeniyle hasar görmüş tübüllerin görselleştirilmesidir. Sonuç olarak, böbrek epiteli antikoru ile yapılan immünohistokimya aracılığıyla hasarlı renal tübül segmentlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Gelişimsel Biyoloji Bölümü'ndeki Neil Hari Laboratuvarı'ndan Carala San Cosentino. Bugün size, fertilizasyondan sonraki ikinci günündeki zebra balığı larvalarına aminoglikozid Gentamisin mikroenjeksiyonu yapma prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, zebra balığı larvalarında akut böbrek hasarı oluşturmak için kullanıyoruz.

Öyleyse başlayalım. Planlanan deneyden üç gece önce yetişkin zebra balıklarının çiftleştirilmesiyle başlayın. Döllenmeden iki gün sonraki embriyoları evrelemek için beş milimolar sodyum klorür, 0,17 milimolar potasyum klorür, 0,33 milimolar kalsiyum klorür ve 0,33 milimolar magnezyum sülfat kullanarak E3 medyumu hazırlayın, embriyoları toplayın ve 28,5 °C'deki bir inkübatörde, ısıtılmış E3 suyu içeren bir Petri kabına yerleştirin.

İlk günün sonunda Petri kabındaki ölü embriyoları uzaklaştırın. Embriyoları her Petri kabında 80 ila 100 embriyo olacak şekilde ayırın. Bir elektrot çekici kullanarak kapiler tüpleri yaklaşık 10 ila 20 mikron nihai çapa kadar çekip cam enjeksiyon iğnelerini hazırlayın.

Çektikten sonra, kapiları bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve kalıcı bir kalem kullanarak iğne boyunca yaklaşık on adet bir milimetrelik çizgi işaretleyin. İğneleri, kil rampalar üzerinde büyük bir Petri kabında saklayın. Ardından, tutma pipetini ateşle hazırlayın.

İnce duvarlı borosilikat cam bir kılcal borunun ucunun cilalanması. Cam kılcal boruyu uzun penslerle tutun ve kılcal borunun ucunu, alevin açık mavi iç konisinin üzerine dikey olarak bir ila iki saniye boyunca yerleştirerek ısıtın. Eşit bir erime elde etmek için kılcal boruyu döndürün.

Bu işlemi birkaç kez tekrarlayın, ardından kılcal boruyu bir sahne mikrometresi altında inceleyin. Kılcal borunun çapı 0,4 ile 0,5 milimetre arasında olmalıdır. Kılcal boruları ve tutucuları hazırladıktan sonra, manuel mikro şırınga pompasını üretici tarafından verilen talimatları izleyerek mineral yağ ile doldurun.

Pipet tutucusunu, manyetik bir stand ile demir plakaya bağlanmış bir joystick manipülatörüne yerleştirin. 20 µL nefrotoksin enjeksiyon karışımı hazırlayın. Kontrol rva için 2,4 nL Gentamicin ve 17,6 nL Lucifer yellow dextran kullanın.

Gentamisin, salin solüsyonu ile değiştirilir. Enjeksiyon mikroskobunun yanına, enjeksiyondan önce nefrotoksik ve kontrol karışımlarını damlatmak için iki mililitre mineral yağı içeren iki adet 30 milimetrelik Petri kabı hazırlayın. 400 miligram trica tozunu 97,7 mililitre çift distile su ve 2,1 mililitre bir molar triss içinde çözerek ve pH değerini yediye ayarlayarak anestezik solüsyonu hazırlayın.

Bu stok çözeltiyi, 4,2 mililitrelik Eloqua içeren dondurucuda saklayın. Tricaine'i anestezik olarak kullanmak için, 4,2 mililitrelik trica stok çözeltisini 100 mililitre E3 içinde seyrelterek oda sıcaklığında bırakın; ardından larvaları bir diseksiyon mikroskobu altında enjeksiyon için hazırlamak amacıyla koryonları ince penslerle manuel olarak temizleyin. Zebrafish larvalarını, oda sıcaklığında ısıtılmış trica içeren bir Petri kabına aktararak anesteziye alın.

Zebra balığı larvaları en az 15 dakika boyunca trica'ya maruz bırakılmalıdır. Mikroenjeksiyonlara başlamadan önce, enjeksiyon iğnesinin ucunu bir jilet yardımıyla açın. Eğimli bir uç oluşturmak için jileti hafif bir açıyla tutun ve uç açıklığı çapı yaklaşık 10 ila 20 mikron olacak şekilde ucu kesin.

Mikroenjeksiyon düzeneğinin güç ve hava kaynağını açın. İğneyi iğne tutucuya yerleştirin. Yağ dolu Petri kabına 10 µL enjeksiyon çözeltisi damlatarak iğneyi doldurun.

Mikroskop altında, manuel piko pompayı açın ve iğnenin ucunu hafifçe yıkayın. Damlacık içinde, iğneyi doldurmak için piko pompayı tahliye moduna getirin. Bu işlem birkaç dakika sürecektir.

Çözelti iğneye çok hızlı ilerliyorsa, uç çapı çok geniştir ve enjeksiyonlar hassas olmayacaktır. İğne doldurulduktan sonra, iğneyi kalibre etmek için pico pompayı bekleme (hold) konumuna getirin ve pico pompa anahtarını kapılı (gated) konumuna ayarlayın. İğneyi boşaltmak için ayak pedalına basın ve menisküsün bir milimetrelik işaretlemeden bir sonrakine geçmesinin kaç saniye sürdüğünü kaydedin; bu işlemi üç kez tekrarlayın ve ortalama süreyi, bir milimetrelik doğrusal mesafeye karşılık gelen nanolitre cinsinden hacim olan 30'a bölerek bir nanolitre çözelti iletmek için gereken milisaniye değerini elde edin.

Aralık dönemi düğmesini bu sayıya ayarlayın ve kapılı zaman anahtarını zamanlanmış konumuna getirin. Artık pedal pompa, bir nanolitre çözelti darbesi verecek şekilde ayarlanmıştır. Ardından, larva içeren Petri kabını mikroskobun altına yerleştirin.

Larvaları Petri kabının merkezinde gruplandırın ve mikroskobu odaklayın. Tutucu pipeti, mikro enjektörün karşı tarafındaki manuel mikro şırınga pompasına yerleştirin ve ucunu Petri kabının içine, mikroskobun odak düzlemine doğru ilerletin. Tutucu pipetin tam ucunun Petri kabının tabanına değmesi ve yatay konuma yakın olması için pipeti oldukça dar bir açıyla eğin.

Mikroskopta daha yüksek bir büyütmeye geçin ve saplı, süper ince bir kirpik teli kullanın. Zebra balığı larvasını, vitellus kısmı tutma pipetine çok yakın olacak şekilde sırt üstü konumlandırın. Vitellusu tutma pipetine çekerek zebra balığı larvasını sabitlemek için, manuel mikro şırınga pompasını kontrol eden mikrometre sürücüsünü saat yönünün tersine çevirin.

Sarısı patlayabileceği için mikrometreyle çok fazla ilerletmemeye dikkat edin. Eğer tutma pipetinin içine çok derin çekilirse, peridermin hemen altında sarının üzerinde bulunan ve kan akışının yüksek olduğu bir bölge olan oluşmaya başlayan common cardinal vein'e odaklanın. Enjeksiyon düzeneğinin mikro manipülatörünü kullanarak.

İğneyi gelişmekte olan ortak kardinal vene yönlendirin. Ortak kardinal ven çok yüzeysel olduğu için yerleştirmeden sonra iğneyi biraz geri çekmek genellikle gereklidir. Larvanın boyun kısmı tutma pipetiyle düzgünce tutulursa, iğne girerken larva dönmeyecektir.

Ayak pedalına basarak bir nanolitre çözelti enjekte edin. Ardından larvaları tutucu pipetten salın ve pipeti larva suyuna geri yerleştirin. Mikroenjeksiyonun başarısını doğrulamak için, zebrafish larvalarının kalbindeki Lucifer yellow dextre varlığını gözlemleyin.

Floresan mikroskop altında, Lucifer yellow dolaşım sisteminde yaklaşık 20 dakika boyunca görünür kalır; dölleme sonrası dördüncü günde larvaları taze E3 medium'a geri aktarın. 10 ila 15 arası zebra balığı larvasını 4 mL'lik cam şişelere yerleştirin ve oda sıcaklığında, 1 mL'lik dents içerisinde dört saat boyunca sabitleyin. Larvaları; çözeltiyi pipetleyerek boşaltıp aynı şişeye yeni çözelti ekleyerek 0,5% PBT içeren, 25'ten 75'e, 50'den 50'ye, 25'ten 75'e ve %100 PBT'ye kadar dereceli bir metanol P-B-T-P-B-S serisinde rehidrate edin.

Flakon başına bir mililitre çözelti. Her bir çözeltide 20 dakika. Larvalar asla havaya maruz bırakılmamalıdır.

Larvaların üzerini her zaman bir miktar solüsyonla kapalı tutun. Solüsyonları değiştirirken, PBT'yi uzaklaştırın ve yerine mutatör üzerinde dört derece Celsius'ta üç saat boyunca %1DMSO ve %0,5-%10 normal keçi serumu içeren bir mililitre PBS bloklama solüsyonu ekleyin. Larvaları iki mililitrelik bir eph'ye aktarın.

Bloke edici serumu uzaklaştırın ve yerine 300 µL primer antikor ekleyin. Bir monoclonal sodium potassium at TPS 1/25 dilüsyonunda alpha six F supernat ve 300 µL inkübasyon çözeltisi (%1 DMSO, %0,5 tween 22, % normal keçi serumu içeren PBS) ile 4 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin. Primer antikoru uzaklaştırın ve oda sıcaklığında, her yıkama için çalkalayıcıya yerleştirerek, birer mL inkübasyon çözeltisi ile 30 dakika boyunca üç kez yıkayın.

Ardından, inkübasyon çözeltisi içinde 1/500 oranında seyreltilmiş sekonder antikor ile oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Bu işlemin ardından, her biri 30 dakika sürecek şekilde PBT ile üç kez yıkayın ve larvaları, her adımda 10 dakika bekleterek dereceli etanol serisi ileyye dehidre edin. 25 mililitre JB four gömme çözeltisi A ve 0,24 gram katalizörü 20 ila 30 dakika boyunca çözerek infiltrasyon çözeltisini hazırlayın. Çözelti, 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.

%100 etanolü uzaklaştırın ve yerine plastik infiltrasyon çözeltisi ekleyin. Tüpleri dört derece santigrat sıcaklıkta bir rotatora yerleştirin ve larvalar tüpün dibine çökene kadar infiltrasyonun yaklaşık 30 dakika boyunca gerçekleşmesini sağlayın. Larvaları gömmek için, plastik kalıp kap tepsisini bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.

Larvaları, onları örtecek kadar infiltrasyon solüsyonuyla birlikte kaplara aktarın. Plastik gömme ortamı küçük bir plastik tüpte hazırlanır. Normalde, her kap için bir larva kullanacak şekilde bir seferde dört ila beş larvayı gömeriz ve beş mililitre gömme plastiği hazırlarız.

Her 1 mililitre infiltrasyon çözeltisi için 35 µL JB-4 gömme çözeltisi B ekleyin. JB-4'ün düzgün şekilde polimerize olmasını sağlamak için plastik bir pastör pipeti veya pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekerek iyice karıştırın. Beş mililitre gömme plastiği hazırlandıktan sonra, yuvarlak numunelerdeki infiltrasyon plastiğini bir pastör pipeti ile uzaklaştırın. Kabı gömme plastiği ile doldurun; blok tutucunun numuneye iyi yapışmasını sağlamak için plastiğin kaptan dışarı taşması gerekir.

Zebra balığı böbrek tübüllerini tespit etmek için en uygun yöntem transvers kesitlerdir. Larvalar, saplı bir kirpik fırçası veya ince penset yardımıyla baş aşağı gelecek şekilde dikey olarak gömülmelidir.

Plastik, larvaların konumlarından kaymayacağı kadar sertleşene kadar larvaları periyodik olarak dikey konuma getirin. Bu işlem yaklaşık 20 ila 30 dakika sürer. Ardından EVH iki blok tutucuyu kapların üzerine yerleştirin ve polimerizasyon tamamlanana kadar tepsiyi gece boyunca dört derece Celsius sıcaklıkta bırakın.

Numuneyi mikrotomun pens tutucusuna yerleştirin ve lam ısıtıcısını 45 °C'ye ayarlayın. Bir behere deiyonize su doldurun ve kesim işleminden önce beheri mikrotoma yakın bir yere yerleştirin. Larvaların kusursuz transvers kesitlerini elde edebilecek şekilde bloğun yönlendirildiğinden emin olun.

Oryantasyon başlığı ayar kolları döndürülebilir ve arka ışık örneğin konumlandırılmasında yardımcı olur. Baş kısmından kalın kesitler alın. Gözlerin eşdeğer kesitlerinin her larva için alındığından emin olacak şekilde blokları yönlendirin.

Göğüs yüzgeçleri kesitlerde göründüğünde, prone tübüller başladığı andır. Bu noktadan itibaren, bloklardan yaklaşık 32 adet 4 mikron kalınlığında kesit alın. Kesitleri pensle toplayın ve penslerin suya değmesine izin vermeden su dolu behere bırakın.

Kesit, suyun yüzeyine değer değmez genişleyecektir. Artık kesiti bir lam üzerine alabilirsiniz. Lamı suya 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve saplı bir kirpik fırçası yardımıyla, sadece kesitin kenarlarına dokunarak kesite yaklaşın; lamları tamamen kuruyana kadar lam ısıtıcıda bekletin ve kesitleri epi-floresan veya konfokal mikroskopi kullanarak görüntüleyin.

Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, enjekte edilmiş bir larva, üstteki görüntüde gösterildiği gibi vasküler sisteminde floresan lusiferaz sarı dekstran ile görünür. Eğer enjeksiyon, alttaki görüntüde olduğu gibi çok derine yapılırsa, enjekte edilen materyal vitellüs kesesinde görülebilir veya kalp delinerek aşırı kanamaya neden olabilir. Larvalar, burada görüldüğü üzere gentamisin nefrotoksisitesinin bir sonucu olarak perikardiyal ödem geliştirmiştir.

Üstteki kontrol larvalarında perikardiyal ödem görülmemektedir. Ancak, gentamycin enjekte edildiğinde, orta ve alt panellerdeki oklarla belirtildiği üzere, zebrafish larvalarının %80'inde orta veya şiddetli ödem görülmektedir. Orta derecede ödemi olan larvaların belirgin perikardiyal ödem gösterdiği, ancak başka gözlemlenebilir fenotiplerin bulunmadığı fenotip tabanlı bir sınıflandırma sistemi kullanıyoruz.

Sodyum potasyum atpa ace'ye karşı böbrek tübülü antikoru kullanıldığında, şiddetli ödemli larvalar perikardiyal ve gövde ödemi, gövde sirkülasyonu eksikliği ve hafif ila orta derecede aks eğriliği göstermektedir. Hasarlı tübüller, panel C ve D'de belirgin hücre polaritesi kaybı ve panel A ve B'deki kontrollere kıyasla hasarlı tübüllerde tübüler bozulma ile transvers kesitlerde görselleştirilmiştir. Bu patern, kesitler karşılaştırıldığında birden fazla transvers kesit boyunca tutarlıdır. Faktöriyel yüzgeçler ve proksimal kıvrımlı tübüller anatomik markerlar olarak kullanılmıştır.

Larval zebrafishlerde akut böbrek hasarının nasıl indükleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken 10-20 mikrometre çapındaki enjeksiyon iğnelerinin kullanılmasının önemli olduğunu unutmayın. Uygun boyutları elde etmek için birkaç tutma pipetini ateşle cilalamak (fire polish) gerekebilir; ancak bir kez elde ettiğinizde, birkaç enjeksiyon seansı boyunca dayanabildiği için onu kullanmaya devam edebilirsiniz.

Ayrıca, micro series JA aparatında hava kabarcığı kalmadığından emin olmak önemlidir; çünkü bu durum sistemin konumlandırmasını olumsuz etkiler. Son olarak, renal tübüllerin mükemmel bir transvers kesitini elde etmek için gömme işlemi sırasında balığı dikey olarak konumlandırın. İşte bu kadar.

İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.