Name: Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-04T17:32:00.000+00:00
Duration: 15 min 55 s
Description: Öğrenin, gentamisin mikroenjeksiyonu ile zebra balığı larvalarında akut böbrek hasarı modeli oluşturmayı. İmmünohistokimya ile böbrek tübü hasarını görselleştirerek nefrotoksisite mekanizmalarını araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık (NIH) hibe R01DK069403 ve P30DK079307 Enstitüleri tarafından finanse edildi.

Aşağıdaki protokol kısmı (Hentschel ve ark 2005) ve (Weinstein ve ark 1995) hafif değişiklikler rapor yayınlandı yöntemleri dayanmaktadır. Bölüm 1: Microinjections Mikroenjeksiyon için önceden ayarlayın <ul><li> Balık, 2 gün sonrası fertilizasyon (DPF) enjekte edilir. Bu nedenle, yetişkin zebrafish planlı bir deney önce 3 gece yetiştirilmektedir. Embriyolar toplayın ve 28.5 E3 su (5mM NaCl, 0.17mM KCL, 0.33mM CaCl 2 0.33mM MgSO 4) ile bir Petri kabındaki ° C Petri kabı başına 80-100 embriyolar vardır, böylece, ilk günün sonunda Petri kabı ve ayrı embriyolar ölü embriyolar kaldırmak. </li><li> Bir elektrot çektirmesi ile kılcal tüpler (4 inç uzunluğunda, 0,63 / 0,20 OD / ID milimetre (mm) R-6 Özel Cam Boru Drummond bilimsel şirketi, Broomall, PA 9-000-3000) çekerek cam iğneler hazırlayın. Ucu çapı 10-20 mikron olmalıdır. Diseksiyon mikroskobu altında (Leica S6E), kalıcı bir kalem, bir cetvel yardımı ile iğne boyunca yaklaşık 10 1mm çizgiler çizmek ve kil rampaları büyük bir Petri kabındaki iğneler saklamak. </li><li> Iç çapı kadar bir Bunsen beki alev ince duvarlı borosilikat cam kapiller tüp (152 mm, 1 / 0.75 OD / ID mm TW100-6, Dünya Precision Instruments, Inc.) Yangın lehçe ipucu: holding pipet hazırlayın ucu 0,4-0,5 mm dir. Böyle bir boyut 2 dpf'e Zebra balığı larvalarının yolk kesesi iyi tutuş sağlar. Uzun forseps kullanarak kapiller ve Bunsen beki ile kılcal zıt ucu 1-2 saniye süreyle ısı, alev ışığı mavi iç konisi, sıcak parçası üzerinde dikey yerleştirerek bir cam parçası bir ucundan tutun. bir bile erimeyen elde etmek için haddeleme. Bir sahne mikrometre (Ward 94 W 9910), birkaç kez, sonra mikroskop altında kılcal incelenmesi bu işlemi tekrarlayın. Bu önemli bir adım, larvaları işleme sırasında, birkaç holding pipetler ateş-lehçe ve daha sonra uygun bir boyutu seçmek için gerekli olabilir. Eğer dikkatli bir elinde pipet çoklu mikroenjeksiyon oturumları için sürer. </li><li> Mineral yağ üreticisi tarafından verilen talimatları izleyerek Manuel mikroenjektör Pompa (MMP, Dünya Precision Instruments, Inc.) Doldurun. Pipet tutucu bir demir plaka (Narishige IP) manyetik bir stand (Narishige, MN 151) ile bağlı bir joystick manipülatör (Narishige, MN-151), eklenir. </li></ul> Mikroenjeksiyon <ul><li> 20μl enjeksiyon karışımı hazırlayın: 2.4μl gentamisin (salin solüsyonu Sigma-Aldrich G8648, 50mg/ml) ve 10-kDa 17.6μl lucifer sarı dekstran (Invitrogen D1825, (tuzlu çözüm 1mg/ml) kontrol balık gentamisin serum fizyolojik ile değiştirilir. floresan dekstran (birçok farklı renkler kullanılabilir) enjeksiyon doğruluğunu ve larvaları nephrotoxicant enjekte edilmiştir seçmek için yeterli olacaktır. </li><li> Çözümleri buharlaşmasını önlemek için, altında enjeksiyon karışımı ve kontrol karışımı yerleştirmek için 2ml mineral yağ ile 2 30mm Petri kapları hazırlayın. </li><li> Anestezi 400 mg tricaine tozu (etil-m-aminobenzoate methanesulfonate SIGMA A-5040) 97.7 ml DD su, 2.1 ml 1M Tris (pH 9): hazırlayın. PH 7 ayarlayın. 4.2 ml hacimde, bu stok solüsyonu dondurucuda saklayın. Tricaine bir anestezik 4.2 ml, 100 ml E3 su (Westerfield 1993) tricaine stok solüsyonu sulandırmak ve oda sıcaklığında bekletin olarak kullanmak için. </li></ul> Aşağıdaki adımları diseksiyon mikroskop altında yapılmaktadır <ul><li> Elle ince forseps ile kalan herhangi bir chorions çıkartın ve oda sıcaklığında ısınmış tricaine ile bir Petri kabındaki aktardıktan zebrafish uyutmak. Zebra balığı microinjections başlamadan önce en az 15 dakika tricaine maruz olmalıdır. </li><li> Bir jilet (VWR bilimsel 55.411-050) kullanarak bir iğne ucu açın. Hafif bir açıyla eğim oluşturmak ve yaklaşık 10-20μm çaplı bir ipucu açılış elde etmek gibi ucu kesmek için bıçak tutun. </li><li> Mikroenjeksiyon cihazları (Dünya hassas aletler Inc, PV820 pnömatik picopump) güç, vakum ve hava kaynağı açın. Iğne, mikromanipülatör ve devirme tabanı (Word Precision Instruments, Inc, Model M3301R, TB-1) üzerine monte iğne tutucu içine yerleştirin. </li><li> Iğne doldurmak için, mineral yağ (Fisher Kimyasallar, 0121-1) ile dolu 30mm Petri kabındaki enjekte edilecek çözümün bir damlacık (10μl) yerleştirin. Batığın çözüm açılan iğne ucu kadar manuel mikromanipülatör açar picopump ayarlamak ("delik" PV820 vakum eşittir) "çıkmasına" yol geçiş ve çekerek iğne doldurup "havalandırma / tutun." iğne ucu ile çözüm. Çözüm çok hızlı iğne içine alırsa, birkaç dakika sürebilir.ucunun çapı çok büyük olduğu anlamına gelir ve enjeksiyonlar doğru olmayacaktır. Iğne doldurulduktan sonra, ("hold" PV820 enjekte eşittir) "tutmaya" picopump ayarlayın. </li><li> Iğne kalibre etmek için, "geçitli", menisküs işaretleyerek bir sonraki (1 seyahat etmek için gereken süreyi (saniye) iğne boşaltmak için ayak pedalına basın ve kayıt picopump "geçitli / zamanlı" anahtarı ayarlayın mm toplam mesafe). 3 kez tekrarlayın, ortalama süre (saniye) ve 30 (1 mm lineer mesafe ilgili nanoliters hacim (nl)) değeri bölmek çözüm 1 nl sunmak için gerekli milisaniye sayısını belirlemek için. Aralık dönemi topuzu bu numaraya ayarlayın ve 'zamanlı' "/ zamanlı kapılı" anahtarı taşımak. Şimdi picopump 1nl darbe bir çözüm sunmak için ayarlanır. </li><li> Mineral yağ çanağı ve pozisyon mikroskop altında larvaları ile Petri kabı çıkarın. Petri kabı ve odak merkezinde balık. </li><li> Petri kabı ucu önceden ve mikroskop odak düzlemi içine, mikroenjektör karşı tarafında manuel mikroenjektör pompa tutarak pipet (MMP, Dünya hassas aletler) yerleştirin. Holding pipetle çok uç Petri kabı alt dokunarak ve yatay yakın olduğunu, böylece, oldukça sığ bir açı ile bükün. Tepki süresi yavaş ve MMP hassas azalacağı, sistem herhangi bir hava kabarcığı değil emin olun. </li><li> Mikroskop daha yüksek bir büyütme değiştirin ve holding pipet çok yakın yumurta sarısı ile larva balık dorsal yüzü aşağı pozisyonda kolu (Ted Pella 113) ile ince kirpik kullanmak. Manuel mikroenjektör pompa kontrol mikrometre sürücü saat yönünün tersine çevirerek holding pipet içine yumurta sarısı emerek larva balık tutun. Holding pipet içine çok derin çekti sarısı patlaması gibi, çok uzak mikrometre açmak için özen gösterin. Yumurta sarısı üzerine, sadece periderm altında yatıyor ve çok yüksek bir kan akışı site oluşturarak ortak kardinal ven odaklanın. Enjeksiyon aparatları mikromanipülatör ile, gelişmekte olan ortak kardinal ven içine iğne rehberlik eder. Ortak kardinal ven çok yüzeysel olduğu gibi, genellikle iğne takıldıktan sonra biraz geri çekmek için gerekli. Ayak pedalına basarak çözüm 1nl enjekte edilir, daha sonra holding pipet larvaları serbest ve embriyo su geri. Bu, özellikle kritik bir adım, ilk kez balık konumlandırma ve teçhizat emme ve basınç kontrol uygulama belirli bir miktar gerektirir çünkü. Embriyonun yumurta sarısı düzgün tutarak pipet ile yapılan iğne girerken, rulo değil. </li><li> Mikroenjeksiyon başarısını doğrulamak için, floresan mikroskop altında zebrafish kalbinde lucifer sarı dekstran varlığı monitör. Nefrotoksik çözüm enjeksiyon 2 saat içinde çok az lucifer sarı dekstran enjeksiyon yerinde kalan göreceksiniz doğru enjekte ise dolaşım sistemi içine gondererek önce yaklaşık 20 dakika süreyle kalp lucifer sarı görünür kalır. Çözüm yolk kesesi, lucifer sarı dekstran bir nokta enjekte ise enjeksiyon yerinde kalacaktır. (Şekil 1). E3 orta balık dönün. </li><li> İki gün sonrası enjeksiyon, larvaları (Şekil 2) azalmış böbrek fonksiyonu bir sonucu olarak perikardiyal ödem geliştirmek. </li></ul> Bölüm 2: Fiksasyon ve immünofloresan Na + / K + ATPaz antikor (α-6F) <ul><li> Dpf'e 4, 10 ve 15 larva zebrafish 4ml cam şişeleri (Weathon 225.012) arasında 1ml Dent (80% MeOH% 20 DMSO) RT az 4 saat koymak ve onları düzeltmek. </li><li> Çözüm pipetleme ve (aynı flakon için yeni bir çözüm ekleyerek, kademeli bir MeOH / PBT (0.5% Tween20 ile PBS) serisi, 75:25 50:50, 25:75,% 100 PBT embriyolar rehidrate başına çözüm 1 ml flakon), her çözümün 20 dakika. Larva havaya maruz asla çözümler değiştirirken larvaları kapsayan küçük bir çözüm bırakın. </li><li> PBT çıkarın ve bir nutator 4 ° C az 3 saat engelleme solüsyonu (PBS DMSO ile% 1,% 0.5 Tween20,% 10 normal keçi serumu) 1ml yerine. </li><li> 2ml mikrofuge'ye larva transferi. Serum engelleme çıkarın ve bir nutator 4 ° C'de bir gecelik inkübasyon çözüm 300μl primer antikor (% 1 PBS ile DMSO,% 0.5 'lik Tween20,% 2 Normal keçi serum) ile değiştirin. Biz 1:25 seyreltme monoklonal Na + / K + ATPaz antikor (α-6F, süpernatant, Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası, Iowa) </li><li> Primer antikor çıkartın ve oda sıcaklığında inkübasyon solüsyonu ile 3 x 30 dakika yıkayın. </li><li> Sekonder antikoru (keçi anti-fare cy3, Jackson Immunoresearch Laboratories, Inc. 155-165-003) ile inkübe 2 saat inkübasyon çözüm 1:500 seyreltilmişRT. </li><li> PBT 3 x 30 dakika yıkayın. </li></ul> Bölüm 3: JB-4 plastik gömme <ul><li> , Adım başına 10 dakika kademeli etanol serisi (% 75;% 95% 100 x 2% 50) ile doku dehydrate. </li><li> JB-4 Gömme Çözüm 25 ml (Polysciences 0226A) ve katalizör 0.24g (Polysciences 02.618): infiltrasyon çözüm hazırlayın. Katalizör yaklaşık 20-30 dakika çözmek için bir süre alır. Çözüm 4 saklanabilir ° C 1 aya kadar. </li><li> % 100 etanol Durusu ve plastik infiltrasyon çözümü ile değiştirin. Rotator şişeleri 4 ° C yerleştirin ve infiltrasyon larvaları lavabo cam flakon altına kadar devam etmek için izin. Bu işlem genellikle yaklaşık 30 dakika sürer. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında yerleştirin plastik kalıp fincan tepsisi (Polysciences, Inc. 16643A): protokol gömülmesi. Bardak içine kapsayacak şekilde infiltrasyon çözümü ile birlikte, larva transferi. Plastik gömme medya küçük bir plastik tüp hazırlanır. Biz normalde bir seferde bir balık Her fincan için 4-5 balık gömün. Infiltrasyon çözüm her ml 5-6 ml (1.2 ml Her fincan için çözüm gömme) gömme plastik JB-4 Gömme Çözüm "B" 35 ul (Polysciences Inc. 0226B) ekleyerek hazırlayın. Infiltrasyon çözüm her ml JB-4 Gömme Çözüm "B" (Polysciences A.Ş. 0226B) 35 ul ekleyin. Plastik Pasteur pipeti birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleme, iyice karıştırın. Karışık değilse de JB-4 düzgün Polimerize olmaz, çünkü bu önemlidir. Gömme plastik 5ml hazırlandıktan sonra, Pasteur pipeti ile örnek etrafında infiltrasyon plastik çıkarın. Plastik gömme su bardağı doldurun. Örnek blok sahibi iyi eki sağlamak için plastik bardak, dışarı sızmak gerekir. Zebrafish renal tübüller tespit için, enine kesitler iyi. Bu amaçla, balık dikey gömülü, baş aşağı. Kirpik sap veya ince forseps yardımı ile plastik onların konumunu hareket etmiyor o kadar da zor hale gelene kadar, periyodik olarak, dikey balık pozisyon. Yaklaşık 20-30 dakika sürer. Daha sonra, bardak üzerinde EBH-2 Blok Tutucu (Polysciences A.Ş. 15.899) yerleştirin ve 4 tepsi ° C gecede terk. Polimerizasyon eksik, buz küpleri gibi bloklar pop. </li><li> Birden fazla larva için alternatif gömme protokolü: yarım tam JB-4 kalıpları doldurun ve polimerize izin. 15 mm kare kalıplar için yarım kalıp doldurmak için 700μl JB-4 birimini kullanır. Sonra, önceden polimerize yarı dolu kalıplara sertleştirici ile JB-4 batırılmış larvaları ekleyin. Orient kafa kalıp uzun tarafına doğru baktığından ve larvaları hizalamak larvaları gözbebekleri hattı (bir satır tek bir kalıp içinde 10 balık koyabilirsiniz). Blok polimerize sonra, blok kenarları kesebilir tarafı bıçak bakacak şekilde açın ve mikrotom uygun bir plastik "chuck" superglue. Bu yöntem ile plastik merkezli aynı blok ve kesitleri için hazır larvaların çok sayıda pozisyon olabilir. Bakım her balık eşdeğer bölümleri tek bir bölümü alınır, böylece bıçak bloğu yönlendirme alınacak. Gözüyle kesit ederken bu gerçekleştirilebilir: yani yönlendirmek blok gözleri eşdeğer bölümlerde her bir balık için alınır böylece. Sonuçta tek bir mikroskop lamı üzerine, eş zamanlı olarak pek çok balık analiz edebilirsiniz. </li></ul> Bölüm 4: Kesit <ul><li> Mikrotom mandren tutucu (biz Shandon Finesse Thermo Electro Corporation mikrotom) numune ayarlayın </li><li> 45 sıcak slayt ayarlayın ° C </li><li> Behere DI su dökün ve mikrotom yakın yerde </li><li> Kesit önce, balık mükemmel enine bölümleri elde etmek için blok gibi odaklı olduğundan emin olun. Yönelim baş ayar kolları bıçak doğru örnek kafa pozisyonu sağlayan döndürülebilir. Kalınlığında kesitler balık kafası ile kesme başlayın. Yönlendirmek blok gözüyle kesit ederken, gözleri eşdeğer bölümleri her balık için alınan böylece. Pronephric tübüller başlattığınızda pektoral yüzgeçler bölümlerde göründüğünde, yani. Bu noktadan itibaren, 4 blok 32 um bölümleri hakkında kesin. </li><li> Forseps ile bölümleri toplayın ve forseps ile su dokunmadan, onları su ile beher içine bırakalım. Su yüzeyine çarparsa bölüm yakında genişleyecektir, şimdi bir slayt toplayabilirsiniz. 45 ° açıyla suya slayt takın ve sadece bölümün sınırları dokunmadan, kulplu bir kirpik yardım bölümü yaklaşım. </li><li> Tamamen kuruyana kadar sıcak bir slayt slaytlar inkübe edin. </li><li> Epifluorescent veya konfokal mikroskopi kullanılarak bölümleri. </li></ul> Bölüm 5: Temsilcisi Results Doğru yapıldığında, enjekte balık küçük floresan dekstran, kalp ve dolaşım sistemi görünür (Lucifer Sarı bu durumda), Şekil 1 gibi görünür. Enjeksiyon çok derin ise, enjekte edilen malzeme yolk kesesi konsantre olabilir, ya da kalbin aşırı kanama neden yırtılmış olabilir. Holding pipet doğru yapılırsa, balık rulo veya hareket enjekte edildiğinde, bu daha doğru bir enjeksiyon sağlayacaktır. Ayrıca, tepki süresi yavaş ve sistemi hassas azalacağı, MMP herhangi bir hava kabarcığı değil emin olmak için önemlidir. Genellikle, gentamisin nefrotoksisite bir sonucu olarak, enjekte edilen balığın% 80 perikardiyal ödem (Şekil 2) geliştirmek. Biz belirgin perikardiyal ödem, ancak hafif ve orta eksenin eğriliği ile ciddi ödemli balık, perikardiyal ve gövdede ödem, başkaları değil, fenotipleri gözlemlenebilir orta derecede ödem ile balık fenotip temelli bir sınıflandırma sistemi kullanır. Renal tübül antikor karşı Na + / K + ATPaz (α-6F) denetimleri (Şekil 3) ile karşılaştırıldığında, hasarlı tübüller hücre polarite ve tübüler bozulma belirgin bir kayıp ile enine bölümlerde hasarlı tübüller oluşturulabiliyor . Bu desen, çok sayıda enine bölümleri ile tutarlıdır. Gömme sırasında balık doğru konumlandırmak için önemlidir renal tübüller mükemmel enine bölümleri elde etmek için. Bölümleri karşılaştırıldığında, göğüs yüzgeçleri ve proksimal dolambaçlı tübüller anatomik belirteç olarak kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 Nephrotoxin mikroenjeksiyon. Lucifer sarı, beyaz ok ortak kardinal ven soluk bir ifade ile konjuge (A) Başarılı bir 10kDa dekstran enjeksiyon,. (B), dolaşım sistemi, kırmızı ok içine dağıtmak değildir lucifer sarı konjuge 10kDa dekstran mevduat yanlış enjeksiyon sonucu. <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Gentamisin-aracılı ödem. (A) Kontrol larva zebrafish enjekte. Gentamisin ile larva Zebra balığı (B) orta veya şiddetli ödem (C) enjekte edilir. Tüm larvalar, sol anterior 4 dpf'e ve dorsal kadar. Siyah oklar, B ve C perikardiyal ödem <img src="/files/ftp_upload/2079/2079Fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 AKI immünhistokimya. kontrol Na + / K + ATPaz 48 saat sonrası gentamisin enjeksiyonu (4 dpf larvaları) (A, B) ve gentamisin enjekte (C, D) larvaları için α-6F antikor boyama. A, C bazolateral polarite ve tübül bozulması, beyaz ok, D, A ve C Not kaybı doğru Tübüllerin 3X dijital büyütmelerde B'ye göre 20X büyütme ve B ve D.

<ol><li>Hentschel, D. M., Park, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+renal+failure+in+zebrafish%3A+a+novel+system+to+study+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Majumdar, A., Lun, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+no+isthmus+reveals+a+role+for+pax2.1+in+tubule+differentiation+and+patterning+events+in+the+pronephric+primordia%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish no isthmus reveals a role for pax2.1 in tubule differentiation and patterning events in the pronephric primordia.</a> Development. 127 (10), 2089-2098 (2000).</li>
<li>Weinstein, B. M., Stemple, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gridlock%2C+a+localized+heritable+vascular+patterning+defect+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Gridlock, a localized heritable vascular patterning defect in the zebrafish.</a> Nat Med. 1 (11), 1143-1147 (1995).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%22">The Zebrafish Book</a>. , University Oregon Press. Oregon. (1993).</li>
</ol>

Bu video makalede AKI bir model için bir intravenöz mikroenjeksiyon tekniği, Zebra balığı larvaları gentamisin aracılı proksimal tübüler hasar oluşturarak gösterdi. Bu hasar, perikardiyal ve / veya ağır ödem oluşumunu sonuçları, su dengesini düzenleyen bir yetersizlik yansıtan. Ayrıca hücre polarite kaybı ve hasarlı böbreklerde proksimal tübül bir bozulma gösteren, farklılaşmış böbrek kanallarında (Majumdar ve ark 2000) işaretleri bir antikor ile bir immünhistokimya deney nitelendirdi. İntravenöz microinjections Zebra balığı larvalarının kana çözünebilir bir madde sağlamak için etkili bir yöntem temsil eder. Bu teknik, çeşitli maddelerin bir tanıtım için mükemmel bir araçtır, floresan işaretleyici üniforma enjeksiyonları yardımı ile tutarlı sonuçlar için izin defalarca tekrar edilebilir.

<table><tbody><tr><td>&amp;alpha;6F fare monoklonal antikoru</td><td>Developmental Studies Hybridoma Bank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blok Tutucu EBH-2</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>15899</td><td></td></tr><tr><td>Borosilikat Cam Kılcallar</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TW100-6</td><td></td></tr><tr><td>Kılcal tüpler R-6 Özel Cam Borular</td><td>Drummond Scientific</td><td>9-000-3000</td><td></td></tr><tr><td>Katalizör Tozu</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>02618</td><td></td></tr><tr><td>Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>155-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10k Lucifer yellow, lizin fikslenebilir</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>D1825</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Kirpik</td><td>Ted Pella, Inc.</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Gentamisin sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8648</td><td></td></tr><tr><td>Cam flakonlar 4ml</td><td>Weathon</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>Demir plaka</td><td>Narishige International</td><td>IP</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Gömme Solüsyonu A</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226A</td><td></td></tr><tr><td>JB-4 Gömme Solüsyonu B</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>0226B</td><td></td></tr><tr><td>Joystick mikro manipülatör</td><td>Narishige International</td><td>MN 151</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik stand</td><td>Narishige International</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Manuel mikro şırınga pompası</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroenjeksiyon cihazı</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipülatör</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>M3301R</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotom</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Shandon Finesse</td><td></td></tr><tr><td>Mineral yağ, hafif</td><td>Fisher Scientific</td><td>0121-1</td><td></td></tr><tr><td>Pipet çekici</td><td>Kopf Instruments</td><td>720</td><td></td></tr><tr><td>Plastik kalıplama kabı tepsisi</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>16643A</td><td></td></tr><tr><td>Jilet</td><td>VWR international</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Lam ısıtıcı</td><td>Labline Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Objektif mikrometresi</td><td>WARD&amp;rsquo;s Natural Science</td><td>94 W 9910</td><td></td></tr><tr><td>Eğilebilir taban</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>TB 1</td><td></td></tr><tr><td>Trikain tozu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td>Diseksiyon mikroskobu</td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td>Floresan mikroskop</td></tr></tbody></table>

akut böbrek sakatlık eğitim zebra balığı larva İntravenöz microinjections

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

Bu video makalede nephrotoxicant olarak gentamisin kullanarak AKI zebrafish modeli açıklanmaktadır. Tekniği 2 dpf&#39;e zebrafish intravenöz microinjections oluşur. Bu teknik, saatte 15-20 balık enjeksiyon için izin, Zebra balığı larvalarının kana çözünen maddeler sunmak için etkin ve hızlı bir yöntem temsil eder. AKI çalışmaları yanı sıra, bu mikroenjeksiyon tekniği da, anjiyografi gibi deneysel çalışmalar, diğer türleri için kullanılabilir. Biz, azalmış böbrek fonksiyonu görsel önlemler için gerekli ekipman tekniğin ayrıntılı bir protokol sağlar. Buna ek olarak, aynı zamanda bir böbrek tübül marker, plastik gömme ve larva zebrafish kesit fiksasyon, tüm montaj immünohistokimya sürecini göstermektedir. Ödem, proksimal tübüler epitel hücreleri hücre polarite kaybı ve tübül morfolojik bozulması: gentamisin ile enjekte Zebra balığı larvaları tutarlı AKI ile morfolojik özellikleri göstermektedir.

2 gün sonrası fetilization (dpf) akut böbrek hasarı (AKI) ikna etmek için Zebra balığı larvaları aminoglikozid, gentamisin, microinjecting bir teknik açıklar. Ayrıca bütün montaj immünohistokimya için bir yöntem tarif, plastik gömme ve kesit AKI aracılı hasar görselleştirmek Zebra balığı larvalarının.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

Bu video makalesinde, nefrotoksik ajan olarak gentamisin kullanılan bir AKİ zebra balığı modelini tanımlıyoruz. Teknik, intravenöz mikroenjeksiyonlardan oluşmaktadır...

Bu prosedürün genel amacı, nefrotoksin olarak AMG Glikozid Gentamisin kullanarak zebra balıklarında akut böbrek hasarı modeli oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle döllenmeden sonraki ikinci gündeki zebra balığı larvalarının ortak kardinal venine gentamisin enjekte edilerek gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, döllenmeden sonraki dördüncü gündeki enjekte edilmiş larvalarda emus fenotiplerinin skorlanmasıdır.Prosedürün üçüncü adımı, döllenmeden sonraki dördüncü gündeki zebrafish'lerin, böbrek tübül epiteli am antikoru ile immünohistokimyasal boyama için işlenmesidir. Prosedürün son adımı, zebrafish larvalarının kesitlerinin alınması ve hücre polaritesinin kaybı ile tübül yapısının bozulması nedeniyle hasar görmüş tübüllerin görselleştirilmesidir. Sonuç olarak, böbrek epiteli antikoru ile yapılan immünohistokimya aracılığıyla hasarlı renal tübül segmentlerini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Gelişimsel Biyoloji Bölümü'ndeki Neil Hari Laboratuvarı'ndan Carala San Cosentino. Bugün size, fertilizasyondan sonraki ikinci günündeki zebra balığı larvalarına aminoglikozid Gentamisin mikroenjeksiyonu yapma prosedürünü göstereceğiz. Laboratuvarımızda bu prosedürü, zebra balığı larvalarında akut böbrek hasarı oluşturmak için kullanıyoruz.Öyleyse başlayalım. Planlanan deneyden üç gece önce yetişkin zebra balıklarının çiftleştirilmesiyle başlayın. Döllenmeden iki gün sonraki embriyoları evrelemek için beş milimolar sodyum klorür, 0,17 milimolar potasyum klorür, 0,33 milimolar kalsiyum klorür ve 0,33 milimolar magnezyum sülfat kullanarak E3 medyumu hazırlayın, embriyoları toplayın ve 28,5 °C'deki bir inkübatörde, ısıtılmış E3 suyu içeren bir Petri kabına yerleştirin.İlk günün sonunda Petri kabındaki ölü embriyoları uzaklaştırın. Embriyoları her Petri kabında 80 ila 100 embriyo olacak şekilde ayırın. Bir elektrot çekici kullanarak kapiler tüpleri yaklaşık 10 ila 20 mikron nihai çapa kadar çekip cam enjeksiyon iğnelerini hazırlayın.Çektikten sonra, kapiları bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin ve kalıcı bir kalem kullanarak iğne boyunca yaklaşık on adet bir milimetrelik çizgi işaretleyin. İğneleri, kil rampalar üzerinde büyük bir Petri kabında saklayın. Ardından, tutma pipetini ateşle hazırlayın.İnce duvarlı borosilikat cam bir kılcal borunun ucunun cilalanması. Cam kılcal boruyu uzun penslerle tutun ve kılcal borunun ucunu, alevin açık mavi iç konisinin üzerine dikey olarak bir ila iki saniye boyunca yerleştirerek ısıtın. Eşit bir erime elde etmek için kılcal boruyu döndürün.Bu işlemi birkaç kez tekrarlayın, ardından kılcal boruyu bir sahne mikrometresi altında inceleyin. Kılcal borunun çapı 0,4 ile 0,5 milimetre arasında olmalıdır. Kılcal boruları ve tutucuları hazırladıktan sonra, manuel mikro şırınga pompasını üretici tarafından verilen talimatları izleyerek mineral yağ ile doldurun.Pipet tutucusunu, manyetik bir stand ile demir plakaya bağlanmış bir joystick manipülatörüne yerleştirin. 20 µL nefrotoksin enjeksiyon karışımı hazırlayın. Kontrol rva için 2,4 nL Gentamicin ve 17,6 nL Lucifer yellow dextran kullanın.Gentamisin, salin solüsyonu ile değiştirilir. Enjeksiyon mikroskobunun yanına, enjeksiyondan önce nefrotoksik ve kontrol karışımlarını damlatmak için iki mililitre mineral yağı içeren iki adet 30 milimetrelik Petri kabı hazırlayın. 400 miligram trica tozunu 97,7 mililitre çift distile su ve 2,1 mililitre bir molar triss içinde çözerek ve pH değerini yediye ayarlayarak anestezik solüsyonu hazırlayın.Bu stok çözeltiyi, 4,2 mililitrelik Eloqua içeren dondurucuda saklayın. Tricaine'i anestezik olarak kullanmak için, 4,2 mililitrelik trica stok çözeltisini 100 mililitre E3 içinde seyrelterek oda sıcaklığında bırakın; ardından larvaları bir diseksiyon mikroskobu altında enjeksiyon için hazırlamak amacıyla koryonları ince penslerle manuel olarak temizleyin. Zebrafish larvalarını, oda sıcaklığında ısıtılmış trica içeren bir Petri kabına aktararak anesteziye alın.Zebra balığı larvaları en az 15 dakika boyunca trica'ya maruz bırakılmalıdır. Mikroenjeksiyonlara başlamadan önce, enjeksiyon iğnesinin ucunu bir jilet yardımıyla açın. Eğimli bir uç oluşturmak için jileti hafif bir açıyla tutun ve uç açıklığı çapı yaklaşık 10 ila 20 mikron olacak şekilde ucu kesin.Mikroenjeksiyon düzeneğinin güç ve hava kaynağını açın. İğneyi iğne tutucuya yerleştirin. Yağ dolu Petri kabına 10 µL enjeksiyon çözeltisi damlatarak iğneyi doldurun.Mikroskop altında, manuel piko pompayı açın ve iğnenin ucunu hafifçe yıkayın. Damlacık içinde, iğneyi doldurmak için piko pompayı tahliye moduna getirin. Bu işlem birkaç dakika sürecektir.Çözelti iğneye çok hızlı ilerliyorsa, uç çapı çok geniştir ve enjeksiyonlar hassas olmayacaktır. İğne doldurulduktan sonra, iğneyi kalibre etmek için pico pompayı bekleme (hold) konumuna getirin ve pico pompa anahtarını kapılı (gated) konumuna ayarlayın. İğneyi boşaltmak için ayak pedalına basın ve menisküsün bir milimetrelik işaretlemeden bir sonrakine geçmesinin kaç saniye sürdüğünü kaydedin; bu işlemi üç kez tekrarlayın ve ortalama süreyi, bir milimetrelik doğrusal mesafeye karşılık gelen nanolitre cinsinden hacim olan 30'a bölerek bir nanolitre çözelti iletmek için gereken milisaniye değerini elde edin.Aralık dönemi düğmesini bu sayıya ayarlayın ve kapılı zaman anahtarını zamanlanmış konumuna getirin. Artık pedal pompa, bir nanolitre çözelti darbesi verecek şekilde ayarlanmıştır. Ardından, larva içeren Petri kabını mikroskobun altına yerleştirin.Larvaları Petri kabının merkezinde gruplandırın ve mikroskobu odaklayın. Tutucu pipeti, mikro enjektörün karşı tarafındaki manuel mikro şırınga pompasına yerleştirin ve ucunu Petri kabının içine, mikroskobun odak düzlemine doğru ilerletin. Tutucu pipetin tam ucunun Petri kabının tabanına değmesi ve yatay konuma yakın olması için pipeti oldukça dar bir açıyla eğin.Mikroskopta daha yüksek bir büyütmeye geçin ve saplı, süper ince bir kirpik teli kullanın. Zebra balığı larvasını, vitellus kısmı tutma pipetine çok yakın olacak şekilde sırt üstü konumlandırın. Vitellusu tutma pipetine çekerek zebra balığı larvasını sabitlemek için, manuel mikro şırınga pompasını kontrol eden mikrometre sürücüsünü saat yönünün tersine çevirin.Sarısı patlayabileceği için mikrometreyle çok fazla ilerletmemeye dikkat edin. Eğer tutma pipetinin içine çok derin çekilirse, peridermin hemen altında sarının üzerinde bulunan ve kan akışının yüksek olduğu bir bölge olan oluşmaya başlayan common cardinal vein'e odaklanın. Enjeksiyon düzeneğinin mikro manipülatörünü kullanarak.İğneyi gelişmekte olan ortak kardinal vene yönlendirin. Ortak kardinal ven çok yüzeysel olduğu için yerleştirmeden sonra iğneyi biraz geri çekmek genellikle gereklidir. Larvanın boyun kısmı tutma pipetiyle düzgünce tutulursa, iğne girerken larva dönmeyecektir.Ayak pedalına basarak bir nanolitre çözelti enjekte edin. Ardından larvaları tutucu pipetten salın ve pipeti larva suyuna geri yerleştirin. Mikroenjeksiyonun başarısını doğrulamak için, zebrafish larvalarının kalbindeki Lucifer yellow dextre varlığını gözlemleyin.Floresan mikroskop altında, Lucifer yellow dolaşım sisteminde yaklaşık 20 dakika boyunca görünür kalır; dölleme sonrası dördüncü günde larvaları taze E3 medium'a geri aktarın. 10 ila 15 arası zebra balığı larvasını 4 mL'lik cam şişelere yerleştirin ve oda sıcaklığında, 1 mL'lik dents içerisinde dört saat boyunca sabitleyin. Larvaları; çözeltiyi pipetleyerek boşaltıp aynı şişeye yeni çözelti ekleyerek 0,5% PBT içeren, 25'ten 75'e, 50'den 50'ye, 25'ten 75'e ve %100 PBT'ye kadar dereceli bir metanol P-B-T-P-B-S serisinde rehidrate edin.Flakon başına bir mililitre çözelti. Her bir çözeltide 20 dakika. Larvalar asla havaya maruz bırakılmamalıdır.Larvaların üzerini her zaman bir miktar solüsyonla kapalı tutun. Solüsyonları değiştirirken, PBT'yi uzaklaştırın ve yerine mutatör üzerinde dört derece Celsius'ta üç saat boyunca %1DMSO ve %0,5-%10 normal keçi serumu içeren bir mililitre PBS bloklama solüsyonu ekleyin. Larvaları iki mililitrelik bir eph'ye aktarın.Bloke edici serumu uzaklaştırın ve yerine 300 µL primer antikor ekleyin. Bir monoclonal sodium potassium at TPS 1/25 dilüsyonunda alpha six F supernat ve 300 µL inkübasyon çözeltisi (%1 DMSO, %0,5 tween 22, % normal keçi serumu içeren PBS) ile 4 °C'de bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca inkübe edin. Primer antikoru uzaklaştırın ve oda sıcaklığında, her yıkama için çalkalayıcıya yerleştirerek, birer mL inkübasyon çözeltisi ile 30 dakika boyunca üç kez yıkayın.Ardından, inkübasyon çözeltisi içinde 1/500 oranında seyreltilmiş sekonder antikor ile oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin. Bu işlemin ardından, her biri 30 dakika sürecek şekilde PBT ile üç kez yıkayın ve larvaları, her adımda 10 dakika bekleterek dereceli etanol serisi ileyye dehidre edin. 25 mililitre JB four gömme çözeltisi A ve 0,24 gram katalizörü 20 ila 30 dakika boyunca çözerek infiltrasyon çözeltisini hazırlayın. Çözelti, 4 °C'de bir aya kadar saklanabilir.%100 etanolü uzaklaştırın ve yerine plastik infiltrasyon çözeltisi ekleyin. Tüpleri dört derece santigrat sıcaklıkta bir rotatora yerleştirin ve larvalar tüpün dibine çökene kadar infiltrasyonun yaklaşık 30 dakika boyunca gerçekleşmesini sağlayın. Larvaları gömmek için, plastik kalıp kap tepsisini bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirin.Larvaları, onları örtecek kadar infiltrasyon solüsyonuyla birlikte kaplara aktarın. Plastik gömme ortamı küçük bir plastik tüpte hazırlanır. Normalde, her kap için bir larva kullanacak şekilde bir seferde dört ila beş larvayı gömeriz ve beş mililitre gömme plastiği hazırlarız.Her 1 mililitre infiltrasyon çözeltisi için 35 µL JB-4 gömme çözeltisi B ekleyin. JB-4'ün düzgün şekilde polimerize olmasını sağlamak için plastik bir pastör pipeti veya pipetle birkaç kez aşağı yukarı çekerek iyice karıştırın. Beş mililitre gömme plastiği hazırlandıktan sonra, yuvarlak numunelerdeki infiltrasyon plastiğini bir pastör pipeti ile uzaklaştırın. Kabı gömme plastiği ile doldurun; blok tutucunun numuneye iyi yapışmasını sağlamak için plastiğin kaptan dışarı taşması gerekir.Zebra balığı böbrek tübüllerini tespit etmek için en uygun yöntem transvers kesitlerdir. Larvalar, saplı bir kirpik fırçası veya ince penset yardımıyla baş aşağı gelecek şekilde dikey olarak gömülmelidir.Plastik, larvaların konumlarından kaymayacağı kadar sertleşene kadar larvaları periyodik olarak dikey konuma getirin. Bu işlem yaklaşık 20 ila 30 dakika sürer. Ardından EVH iki blok tutucuyu kapların üzerine yerleştirin ve polimerizasyon tamamlanana kadar tepsiyi gece boyunca dört derece Celsius sıcaklıkta bırakın.Numuneyi mikrotomun pens tutucusuna yerleştirin ve lam ısıtıcısını 45 °C'ye ayarlayın. Bir behere deiyonize su doldurun ve kesim işleminden önce beheri mikrotoma yakın bir yere yerleştirin. Larvaların kusursuz transvers kesitlerini elde edebilecek şekilde bloğun yönlendirildiğinden emin olun.Oryantasyon başlığı ayar kolları döndürülebilir ve arka ışık örneğin konumlandırılmasında yardımcı olur. Baş kısmından kalın kesitler alın. Gözlerin eşdeğer kesitlerinin her larva için alındığından emin olacak şekilde blokları yönlendirin.Göğüs yüzgeçleri kesitlerde göründüğünde, prone tübüller başladığı andır. Bu noktadan itibaren, bloklardan yaklaşık 32 adet 4 mikron kalınlığında kesit alın. Kesitleri pensle toplayın ve penslerin suya değmesine izin vermeden su dolu behere bırakın.Kesit, suyun yüzeyine değer değmez genişleyecektir. Artık kesiti bir lam üzerine alabilirsiniz. Lamı suya 45 derecelik bir açıyla yerleştirin ve saplı bir kirpik fırçası yardımıyla, sadece kesitin kenarlarına dokunarak kesite yaklaşın; lamları tamamen kuruyana kadar lam ısıtıcıda bekletin ve kesitleri epi-floresan veya konfokal mikroskopi kullanarak görüntüleyin.Doğru şekilde gerçekleştirildiğinde, enjekte edilmiş bir larva, üstteki görüntüde gösterildiği gibi vasküler sisteminde floresan lusiferaz sarı dekstran ile görünür. Eğer enjeksiyon, alttaki görüntüde olduğu gibi çok derine yapılırsa, enjekte edilen materyal vitellüs kesesinde görülebilir veya kalp delinerek aşırı kanamaya neden olabilir. Larvalar, burada görüldüğü üzere gentamisin nefrotoksisitesinin bir sonucu olarak perikardiyal ödem geliştirmiştir.Üstteki kontrol larvalarında perikardiyal ödem görülmemektedir. Ancak, gentamycin enjekte edildiğinde, orta ve alt panellerdeki oklarla belirtildiği üzere, zebrafish larvalarının %80'inde orta veya şiddetli ödem görülmektedir. Orta derecede ödemi olan larvaların belirgin perikardiyal ödem gösterdiği, ancak başka gözlemlenebilir fenotiplerin bulunmadığı fenotip tabanlı bir sınıflandırma sistemi kullanıyoruz.Sodyum potasyum atpa ace'ye karşı böbrek tübülü antikoru kullanıldığında, şiddetli ödemli larvalar perikardiyal ve gövde ödemi, gövde sirkülasyonu eksikliği ve hafif ila orta derecede aks eğriliği göstermektedir. Hasarlı tübüller, panel C ve D'de belirgin hücre polaritesi kaybı ve panel A ve B'deki kontrollere kıyasla hasarlı tübüllerde tübüler bozulma ile transvers kesitlerde görselleştirilmiştir. Bu patern, kesitler karşılaştırıldığında birden fazla transvers kesit boyunca tutarlıdır. Faktöriyel yüzgeçler ve proksimal kıvrımlı tübüller anatomik markerlar olarak kullanılmıştır.Larval zebrafishlerde akut böbrek hasarının nasıl indükleneceğini göstermiş olduk. Bu prosedürü gerçekleştirirken 10-20 mikrometre çapındaki enjeksiyon iğnelerinin kullanılmasının önemli olduğunu unutmayın. Uygun boyutları elde etmek için birkaç tutma pipetini ateşle cilalamak (fire polish) gerekebilir; ancak bir kez elde ettiğinizde, birkaç enjeksiyon seansı boyunca dayanabildiği için onu kullanmaya devam edebilirsiniz.Ayrıca, micro series JA aparatında hava kabarcığı kalmadığından emin olmak önemlidir; çünkü bu durum sistemin konumlandırmasını olumsuz etkiler. Son olarak, renal tübüllerin mükemmel bir transvers kesitini elde etmek için gömme işlemi sırasında balığı dikey olarak konumlandırın. İşte bu kadar.İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dileriz.

intravenous-microinjections-zebrafish-larvae-to-study-acute-kidney

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Insanlarda akut böbrek hasarı (AKI), böbrek nefron oluşturan epitel hücrelerin zarar görmesine neden olduğu yaygın bir klinik sorundur ve AKI, yüksek ölüm oranları% 50-70 ile...

Zebra balığı Pronephros Lazer Ablasyon Böbrek Epitel Rejenerasyon Eğitim

Bu video, böbrek fonksiyonu üzerindeki kimyasal etkilerini incelemek için nefrotoksinlerin bir zebra balığı embriyosunun kuyruk damarına intravenöz mikroenjeksiyonunu göstermektedir.

Nefrotoksinlerin Zebra Balığı Embriyosuna İntravenöz Mikroenjeksiyonu: Nefrotoksik Ajanları Zebra Balığı Embriyosunun Kan Dolaşımına Verme Tekniği

Zebra balığı yetişkin böbrek böbrek yenilenmesi ve hastalık çalışmalar için mükemmel bir sistemdir. Böyle bir araştırmanın önemli bir yönü nefron yapısı ve fonksiyonu değerlendirmesidir. Bu protokol nefron borucuk kompozisyonunun ve böbrek geri emiliminin değerlendirilmesi için uygulanabilecek çeşitli yöntemler anlatılmaktadır.

Yetişkin Zebra balığı Böbrek Nefron Kompozisyon ve Fonksiyon Analizi

Burada, gentamisin enjeksiyonu ile akut böbrek hasarını indükleyerek erişkin böbrek rejenerasyonunu incelemek için güvenilir bir yöntem sunuyoruz. Yaralanmanın gentamisin dozajına ve çevre sıcaklığına bağlı olduğunu, lhx1a+'yı etiketlemek için yerinde hibridizasyon kullanarak, yeni nefronlar geliştirdiğini gösterdik.

Gentamisin Kaynaklı Sakatlık tarafından Yetişkin Zebra balığı Böbrek Rejenerasyon

kemoterapötik antibiyotik arasında değişen ilaçlar yer alır nephrotoxins, kaynaklanacak böbrek yaralanmaları, kimin patogenezi tam olarak anlaşılamamıştır karmaşık bozuklukları oluşabilir. Bu protokol, zebra balığı böbrek koruyucu önlemlerin tanımlanması için uygulanabilir, bu koşullar, hastalık modelleme için nasıl kullanılabileceğini göstermektedir.

Zebra balığı Nephrotoxin Mikroenjeksiyon Akut Böbrek Yaralanması Model

Bu çalışma, böbrek GFP transgenik zebra balığı kullanılarak segmental böbrek hasarının yeni bir in vivo modeli sunmaktadır. Model böbrek epitel hücrelerinin hedeflenen ablasyonunun indüksiyonuna izin vererek nefron hasarının ve onarımının hücresel mekanizmalarını gösterir.

Zebra balığı Gelişen Akut Böbrek Hasarının Modellenmesi İçin Hassas Hücresel Ablasyon Yaklaşımı

Bu makalede, floresan microparticles hızlı, minimal invaziv enjeksiyon circulatory system küçük balıklar ve balık kan microparticles in vivo görselleştirme içine prensipleri gösterilir.

Basit ve etkili yönetim ve küçük balıklar böbrek enjeksiyon kullanarak dolaşım sistemi içinde Microparticles görselleştirme

Bu protokol, cisplatin'i nefrotoksik ajan olarak kullanarak yetişkin zebra balıklarında Akut Böbrek Yaralanmasına (AKI) neden olacak prosedürleri açıklar. Renal dokuda inflamasyon ve hücre ölümünü analiz etmek için tekniğin tekrarlanabilirliğini ve iki tekniği değerlendirme adımlarını, akış sitometrisini ve TUNEL'i ayrıntılı olarak detaylandırdık.

Yetişkin Zebra Balıklarında Cisplatin tarafından İndüklenen Akut Böbrek Yaralanması Modeli

Yetişkin zebra balıklarında yeni bir intraperitoneal (IP) enjeksiyon yöntemi tanımlanmıştır. Doksorubisin gibi toksik bileşiklerle çalışırken, bu prosedür daha önce bildirilen iki IP yönteminden daha etkilidir. Teknik, zebra balığı modelinde sınırlı deneyime sahip araştırmacılar tarafından kolayca benimsenecek şekilde tasarlanmıştır.

Yetişkin Zebra Balıklarında Vücut Hasarını ve İlişkili Mortaliteyi En Aza İndiren Bir İntraperitoneal Enjeksiyon Tekniği

Burada, yetişkin zebra balıklarına hücrelerin veya farmakolojik ajanların intravenöz enjeksiyonu için optimize edilmiş ve etkili bir protokol sunuyoruz, bu da hücre aşılamasının artmasına ve tedavi edilen zebra balığının hayatta kalma oranlarının artmasına neden oluyor.

Yetişkin Zebra Balıklarında Optimize Edilmiş İntravenöz Enjeksiyon

Genetik olarak hassas organizmalarda inflamatuar sinyallerin nörogelişimi nasıl etkilediğini modellemek için, zebrafish larvalarının Cuvier (ortak kardinal damar) kanalına IL-6 mikroenjeksiyonu için bir protokol sunuyoruz; bu protokol iltihabın kontrollü indüklenmesini ve tüberoz skleroz kompleksi (TSC) bağlamında gelişimsel etkisinin değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.

TSC zebrafish larvalarının kanına interleukin-6'nın mikroenjeksiyonu ve nöropsikiyatrik bozukluk benzeri davranışların incelenmesi

Öğrenin, gentamisin mikroenjeksiyonu ile zebra balığı larvalarında akut böbrek hasarı modeli oluşturmayı. İmmünohistokimya ile böbrek tübü hasarını görselleştirerek nefrotoksisite mekanizmalarını araştırın.

Akut Böbrek Sakatlık Eğitim Zebra balığı Larva İntravenöz Microinjections

Daha fazla video keşfet