Name: Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-08-23T17:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Öğrenin, C. elegans'ta transgenik solucan üretimi için biyolistik bombardıman yöntemini. DNA kaplı altın partiküller kullanarak gen düzenlemesi çalışmalarını kolaylaştıran bu protokol, mikroenjeksiyona etkili bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Pittsburgh NIH hibe AG028977 Üniversitesi ALF tohum fonları tarafından desteklenen

Genel bakış Geleneksel olarak transgenik solucanlar C. transgen DNA microinjecting tarafından oluşturulan elegans germline 1,2,3,4. Başarılı olsa da, bu yaklaşım, özel ekipman ve solucan anatomi ve mikroenjeksiyon tekniği ile deneyim geliştirilmesi gerekli. Daha yakın zamanlarda Biyolistik bombardımanı germline 5,6 içine yabancı DNA tanıtmak için DNA kaplı altın parçacıkları kullanan bir alternatif yaklaşım olarak geliştirilmiştir. Bu yaklaşım, uygulama açısından başarılı olmak için daha az zaman yatırım gerektirir. C. Biyolistik bombardımanı transgenik solucanlar oluşturmak için elegans başarı hayvanların büyük bir miktar gerektirir böylece, bireysel solucanın düzeyde, düşük verimlilik vardır. Bu çeşitli yollarla yetiştirilen, ancak ilgili plakaların çalışma ve sayısını azaltmak için yumurta plakları kullanmayın olabilir. Bizim protokol yumurta plakaları ve solucanlar hazırlanması ile başlar ve daha sonra Bio-Rad PDS-1000/He yedi Sistemi kullanarak bombardımanı protokol üzerinde duruluyor. Biz Berezikov ve ark 7 iş kısmen bizim protokol uyarladı. Bombardımanı ile, unc-119 gen genellikle transgenik hayvanlar için bir belirteç olarak kullanılır. Bu mutasyonu taşıyan Worm suşları ciddi koordinasyonsuz ve zorlukla hareket, görünüm dumpy ve Dauer larva formu 8 için mümkün değildir. Dauer olumsuz koşullar altında üreme yetişkin gelişimini geciktirmek için kullanılan bir alternatif larva aşamasında olup, birden fazla genin 9 Dauer girmesinden tarafından düzenlenir. Unc-119 geni taşıyan birçok suşları C. edinilebilir. elegans Genetik Merkezi (CGC, Minneapolis, MN). Orijinal DP38 suşu (unc-119 (ED3)) ayrıca mansap deneyler etkileyebilecek alakasız bir Dauer oluşum bünye (Daf-c) mutasyon taşıyor. Çeşitli laboratuvarları bu mutasyon outcrossed ve HT1593 gerginlik CGC edinilebilir. Transgenik hayvanlar DP38 suşu ile biraz daha kolay belirlenir ve bu gerginlik transgenik hayvanlar oluşturmak için kullanma eğiliminde. Gerekli olduğunda, daf-c mutasyon kaldırmak için transgenik solucanlar outcross HT1593 kullanın. Transgenlerin hazırlarken büyüyen plakalarının stok tutmak için DP38 solucanlar büyümeye protokolde yavaş adımları biridir. İfade ilgi gen ile birlikte unc-119 marker normal motilite ve vücut büyüklüğü 5 kurtarma dayalı transgen ifade hayvanların kolay tanımlama sağlar. Unc-119 gen, küçük bir C için çeşitli kaynaklardan ve vektörler unc-119 genomik DNA kullanarak unc-119 organizatörü ve cDNA ve genomik DNA elde edilebilir briggsiae gen 8,10 kullanılır. Biz son zamanlarda bir unc-119 kaset homolog rekombinasyon 11 ve Cre-lox rekombinasyon unc-119 geni taşıyan transgenik hayvanlar üretmek için 12 solucan fosmids değiştirmek için bir yöntem ampisilin direnç geninin içeren herhangi bir plazmid eklemek için basit bir protokol nitelendirdi . Plazmid Addgene A.Ş. (Cambridge, MA) mevcuttur. Tek bir bombardıman gerçekleştiren yer çaba önemli ama yönetilebilir olmasına rağmen, tek bir günde birden fazla bombardımanları yer alan ek iş az. Sonuç olarak, rutin olarak her getirici iş azaltmak için, transgenik solucanlar üretim küme. 1. Yumurta Plaka Hazırlık Unc-119 mutant solucanlar, çünkü bir tabak parçaları plaka diğer bölgelerinde hala yiyecek içeren süre açlıktan eğilimindedir engelli hareketlilik ile standart NGM plakalar üzerinde büyümek zor. Yumurta plakalar üzerinde kalın gıda tabakası unc-119 solucanlar daha kolay tarama ve tüm plaka 7 devralmaya izin Yumurta plakaları bu sorunu çözebilir. Yumurta plakaları da, solucanlar çok sayıda az plakaları 13 ihtiyaç vardır böylece büyümeyi destekleyen yararı var . Genellikle 5 yumurta plakaları, bir bombardıman için solucanlar büyümek için yeterli. Aşağıda tarif yaklaşık 50 plaka yapar ama, istenirse daha az yapmak için yarıya olabilir. Plakalar, antibiyotik ve antifungal ilaçlar kullanın ve sadece tabak tohumlama için hipoklorit tarafından üretilen yumurta kullanın, böylece yumurta plakaları kolayca kontamine olabilirler. 1. Gün: <ol><li> 500ml şişe LB (400 mL) hazırlayın. Otoklav için 20 dk. </li><li> ~ 50% 2 agar ile 1 litre NGA kullanarak 10 cm NGA plakaları dökün. 200 mg / ml 13 litre ve streptomisin başına nistatin 10 ml ekleyin. </li><li> 200 mg / ml streptomisin, LB OP50-1 40 ml gecede kültür büyütün. Bu gerginlik, streptomisin dirençli ve CGC edinilebilir. </li><li> 500ml şişe OtoklavErtesi gün. </li></ol> 2. Gün: <ol><li> Ayrı steril şişeye 10 tavuk yumurtası sarısında bulunur. Biz bir yumurta sarısı ayırıcı (Hedef de dahil olmak üzere ev mağazalar, mevcuttur) kullanın. Çalkalayınız. </li><li> LB ile 400ml hacim kazandırın. Sallamak </li><li> 1 saat 60 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Oda sıcaklığında soğutun. </li><li> OP50-1, 40ml ekleyin. Sallamak </li><li> Plaka başına 5-8 ml karışımı dağıtın. </li><li> Plakalar gece boyunca oda sıcaklığında yerleşmek için izin verin. </li></ol> 3. Gün: <ol><li> Plakaları kalan sıvı yavaşça dökün. Gece boyunca oda sıcaklığında kapakları ile kurumasını bekleyin. </li></ol> 4. Gün: <ol><li> Gerekli ° C kadar bir kutu ya da plastik torba ve mağaza, 4 tabak koyun. Bu plakalar, 1-2 ay kullanmak için Tamam gibi görünüyor. </li></ol> 2. Yumurta Tabaklar Seeding <ol><li> Konsantre OP50 son açlıktan plakaları ekleyerek 6 cm NGA plakalar üzerinde DP38 solucanlar genişletin. Tek bir bombardıman için, tohum 5 yumurta plaka ~ 6 küçük tabak kullanın. Birden fazla bombardımanları için, biz, yumurta plakaları ekim önce yerine tohum 2 zenginleştirilmiş pepton plakalar için küçük tabak kullanın. </li><li> DP38 solucanlar 13,14 hipoklorit kullanımı ile yumurta Yalıtmak. Steril S-bazal veya M9 tamponlar 13,14 yumurta tekrar </li><li> Yumurta plakaların uygun sayıda yumurta (plaka başına 10.000) ekleyin. Bombardımanı kullanmak için 7-10 gün boyunca 20 ° C&#39;de yumurta plakalar üzerinde solucanlar büyütün. Plakalar, solucanlar, yemek tabakları temizlemek için bir kez başladıktan sonra kullanıma hazır olacaktır. Bu plakalar, açlıktan ve daha uzun süreler için büyüyen solucan verimi artıracak gerçekten zor. </li></ol> Bombardıman Önümüzde zaman altın stoku hazırlamak ve 4 ° C kullanılmak üzere saklanır tutmak. Ayrıca gerekli lekesiz ve 10 cm NGA tabak fark vardır. Lekesiz plakaları önceden iyi dökülür ve iyice kurumasını solucanlar ile eklenen sıvı emilimini kolaylaştırmak için izin verilmesi gerekir. DNA kaplı altın parçacıkları, ilk önce hazırlamaya başlamadan bombardıman gününde, solucanlar yıkayın. Biz lekesiz NGA plakaları sonra solucanlar ve altın parçacıkları yıkama ve macrocarriers aktararak bitirmek. Altın parçacık hazırlanması: <ol><li> 1.7mL bir tüp içinde altın parçacıkları 60 mg tartılır ve 15 dakika için% 70 etanol içinde bekletin. Spin altın parçacıkları çöktürmek için kısaca. </li><li> 3 kez steril su ile yıkayın ve altın toplamak için kısaca her zaman döndürün. </li><li> % 50 steril gliserol 1mL altın süspanse edin. Bu stok altın parçacık çözümü ve 4 ay süreyle saklanabilir ° C </li></ol> Worms: <ol><li> S-bazal veya M9 tamponu ile yumurta plakaları kapalı DP38 solucanlar Float ve 50ml konik tüp aktarabilirsiniz. </li><li> Tüpler, solucanlar alt kadar bankta tutun. Sonra tampon aspirat ve taze S-bazal veya M9 ekleyin. Tampon enkaz nispeten netleşene kadar, 2 veya 3 kere yıkayın. DNA kaplama işlemi tamamlanıncaya kadar, bu aşamada solucanlar tutun. </li><li> Aspire edin ve yaklaşık 2-3 ml bombardımanı ortalama tamponunda solucanlar bırakın. Buz üzerinde 10 cm lekesiz NGA plaka transfer. NGA plaka bombardımanı önce tamamen kuru olarak transfer hacmi en aza indirmek önemlidir. Solucanlar plakanın tüm yüzeyini kapsayacak şekilde emin olun. </li><li> Plaka buz üzerinde kurumasına izin verin. Buz kurutma sırasında topaklanma solucanlar önleyecektir. </li></ol> Bu adım önemlidir: tabak kuru olmalıdır ve solucanlar NGA plaka üzerinde eşit dağılmış. Solucanlar buz üzerinde tutulması, plaka üzerinde hareket eden ve yığınları içine bir araya engeller. DNA hazırlığı (bir bombardıman için): <ol><li> 1.7mL bir tüp içinde karıştırın: <ul><li> 50μl altın parçacıkları. Eklemeden önce iyice süspanse edin. </li><li> 50μl DNA (10-15ug). Biz dairesel veya doğrusal DNA arasında çok az fark görüyoruz. Genellikle (Qiagen Inc, Valencia, CA) DNA saflaştırılması için Qiagen midiprep kartuşlarını kullanın. </li><li> 50μl 2.5M CaCl 2. Bu çözüm, oda sıcaklığında birkaç hafta boyunca stabildir. </li><li> 20μl 0.1M spermidin. Spermidin sulu çözeltide kararsız. -20 ° C&#39;de 70μl spermidin alikotları ve mağaza olun Daha sonra bir 0.1M çözüm elde etmek için sağa kullanımdan önce su 1 ml ekleyin. Bu çözüm, her bombardımanı için taze hazırlanmış olmalıdır. Vorteks Biz genellikle vorteks sonra düşük bir hızda 1.7mL bir tüp içinde altın parçacıkları ve CaCl 2, DNA ve spermidin / protamin damla damla ekleyin. Kalsiyum fosfat ile transfekte olan insanlar için bu tekniği tanıdık. Biz çok iyi sonuçlar 15 ile yerine spermidin protamin da kullanılır. Biz su taze bir çözüm (1mg/ml) hazırlayacak ve bizee 50μl yerine spermidin 20μl. Eğer protamin kullanımı, genellikle buz üzerinde yerleştirme yerine 10 dakika boyunca karışımı oda sıcaklığında inkübe edin. Protamin dondurulmuş tutulmalıdır gerekmez ve bir toz bir sıvı yerine. </li></ul></li><li> 30 dakika için buz karışımı inkübe ve süspansiyon altın parçacıkları tutmak için periyodik olarak karıştırın. Daha sonra kısaca spin ve süpernatant aspire. </li><li> 300μl% 70 etanol ile yıkayın. Kısaca Spin. </li><li> 1 ml% 100 etanol ile yıkayın. Kısaca Spin. </li><li> 170μl% 100 etanol içinde süspanse edin. </li></ol> Macrocarriers, hazırlanması: <ol><li> 2-propanol içinde 7 macrocarriers (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) durulayın. Kağıt mendil koyun ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın. </li><li> Her macrocarrier merkezinde DNA / altın karışımı 20μl ekleyin. Süspansiyon altın tutmak için pipetleme önce vorteks sağ emin olun. </li><li> Buharlaşması etanol edelim. </li></ol> 3. Bombardıman Deney sistemi yoluyla helyum temizlemek için önce boş bir bombardıman gerçekleştirmek için emin olun. <ol><li> , Vakum pompası ve yakın vakum pompası kapanı açın. Biz yağsız vakum pompası kullanın. </li><li> Helyum tankı açın. Basıncı ≥ 2200psi kontrol edin. </li><li> 2-propanol içinde Islak rüptürü disk (1350 psi), yedi adaptör için istinat kap yerleştirerek. </li><li> PDS-1000 sistemi içine adaptörü Vida ve verilen tork anahtarı ile sıkın. </li><li> 7 sahibi ve koltuk onlara sağlanan bir aracı haline macrocarriers yerleştirin. Sonra sahibine yedi stop ekran ve alt koydu. Üst ikinci raf üzerinde yer tutucu ve çevirin. Macrocarriers altın benekli tarafı bu noktada aşağı bakacak şekilde olmalıdır. </li><li> Yedi adaptör çıkışları ile macrocarrier sahibinin üst deliklerini. </li><li> Bombardıman odasında en düşük raf solucanlar (kapak kapalı) ile kaplı NGA plaka koyun. </li><li> Tamamen PDS-1000 vakum debi topuzu açın. Vac düğmesine basın odası Hg olarak 26 ulaşana kadar. Sonra vakum korumak için konumda tutun geçmek. </li><li> Disk rüptürlerinin kadar yangın düğmesine basın ve basılı tutun. Basınç 1350psi ulaştığında bu olur. Bazen bu meydana 5-20 saniye sürer. Düğmesini bırakın. </li><li> Vakum odası (havalandırma pozisyon) bırakın ve plakasını çıkarın. </li><li> Vakum ve helyum kapalı açın. </li><li> Yangın hattı helyum (helyum göstergesi 0 psi işaretlemeniz gerekir) içermez kadar birkaç kez. </li><li> PDS-1000 sistemi kapatın. </li></ol> Bombardımanından sonra Worm kurtarma: <ol><li> 20 ° C&#39;de 20 dakika boyunca bombardımana plaka bırakın. </li><li> 10 ml S-bazal veya M9 tampon plaka solucanlar Float. </li><li> 20 - 10 cm benekli NGA plakaları 0.5mL solucanlar koyun. </li><li> Yaklaşık 2 hafta ° C ya da oda sıcaklığında (22-24 ° C) kurtarıldı solucanlar için kontrol etmeden önce 20 bırakın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu ile unc-119 (+) fenotipi ile solucanlar için ekran. Kurtarıldı solucanlar kurtarıldı olmayan solucanlar üzerinde sağkalım avantajı beri plakaları açlıktan sonra tarama için en uygun zaman. </li><li> Kurtarıldı solucanlar bulunan her 10 cm plaka tek bir hat oluşturun. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Transgenik hayvanlar elde etmek için ilgili protokolün başarısı özellikle transgen bağlıdır. Organizatörü: GFP muhabiri transgenlerin 20 satır kadar almış. Daha tipik bir sonucu 3-10 satır. Transgenik hatların% 30 entegre çizgiler, ancak bu rastgele ve entegre bir çizgi özellikle isteniyorsa, biz tek bir günde birden fazla bombardımanları gerçekleştirecek.

<ol><li>Evans, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aEvans%2C+TC+%22Wormbook%22">Wormbook</a>. , 1-15 (2006).</li>
<li>Berkowitz, L. A., Knight, A. L., Caldwell, G. A., Caldwell, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stable+transgenic+C.+elegans+using+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Generation of stable transgenic C. elegans using microinjection.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Mello, C. C., Kramer, J. M., Stinchcomb, D., Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+gene+transfer+in+C.elegans%3A+extrachromosomal+maintenance+and+integration+of+transforming+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Efficient gene transfer in C.elegans: extrachromosomal maintenance and integration of transforming sequences.</a> EMBO J. 10, 3959-3970 (1991).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Wilm, T., Demel, P., Koop, H. U., Schnabel, H., Schnabel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ballistic+transformation+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Ballistic transformation of Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 229, 31-35 (1999).</li>
<li>Berezikov, E., Bargmann, C. I., Plasterk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+gene+targeting+in+Caenorhabditis+elegans+by+biolistic+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Homologous gene targeting in Caenorhabditis elegans by biolistic transformation.</a> Nucleic Acids Res. 32, e40-e40 (2004).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
<li>Riddle, D. L., Swanson, M. M., Albert, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interacting+genes+in+nematode+dauer+larva+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interacting genes in nematode dauer larva formation.</a> Nature. 290, 668-671 (1981).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+function+and+expression+of+unc-119+from+two+Caenorhabditis+species+despite+divergence+of+non-coding+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Conservation of function and expression of unc-119 from two Caenorhabditis species despite divergence of non-coding DNA.</a> Gene. 183, 77-85 (1996).</li>
<li>Ferguson, A. A., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrofitting+ampicillin+resistant+vectors+by+recombination+for+use+in+generating+C.+elegans+transgenic+animals+by+bombardment%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Retrofitting ampicillin resistant vectors by recombination for use in generating C. elegans transgenic animals by bombardment.</a> Plasmid. 62, 140-145 (2009).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Basic culture methods.</a> Methods Cell Biol. 48, 3-30 (1995).</li>
<li>Sulston, J. E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSulston%2C+JE+%22The+nematode%2C+Caenorhabditis+elegans%22">The nematode, Caenorhabditis elegans</a>. Wood, W. B. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 587-606 (1988).</li>
<li>Sivamani, E., DeLong, R. K., Qu, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protamine-mediated+DNA+coating+remarkably+improves+bombardment+transformation+efficiency+in+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Protamine-mediated DNA coating remarkably improves bombardment transformation efficiency in plant cells.</a> Plant Cell Rep. 28, 213-221 (2009).</li>
<li>Johnston, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transformation%3A+microbes+to+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Biolistic transformation: microbes to mice.</a> Nature. 346, 776-777 (1990).</li>
</ol>

Biyolistik bombardımanı C. dahil olmak üzere, birçok organizma içine yabancı DNA tanıtmak için basit bir yöntem elegans 1,5,6,7,16. CaCl 2 varlığı DNA ile bir kompleks oluşturan altın parçacıkları dayanmaktadır. Katyonik poliaminler, böyle bir spermidin olarak, in vivo nükleaz bozulması DNA korur. Spermidin labil bir molekül olduğu için, küçük alikotları -20 ° C&#39;de saklayın ve sağ bombardımanı gerçekleştirmeden önce çözüm için önemlidir. Protamin bombardımanı protokolü de açık...

The volume for a solution in, <a href="http://www.jove.com/video/2090">Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation</a>, was incorrect.

Erratum: Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

<table><tbody><tr><td>Altın partikülleri</td><td>Inbio gold</td><td>BD021</td><td>1micron</td></tr><tr><td>Midiprep kiti</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4139</td><td></td></tr><tr><td>Protamin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4505</td><td></td></tr><tr><td>Makrotaşıyıcılar</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2335</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He Hepta Sistemi</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>Patlama diski</td><td>Bio-Rad</td><td>165-2330</td><td></td></tr><tr><td>Nistatin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1638</td><td></td></tr><tr><td>Streptomisin</td><td>MP Biomedicals</td><td>100556</td><td></td></tr></tbody></table>

transgenik, Üretimi c. elegans biyolistik dönüşüm

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Serbest yaşayan nematod C. kullanarak laboratuvarların sayısı elegans hızla büyüyor. Bu biyolojik model popülerlik hızlı bir nesil zaman ve kısa ömrü, kolay ve ucuz bakım, tam sıralı genom ve RNAi kaynaklarını ve mutant hayvanlar dizisi atfedilir. Ayrıca C, analiz elegans genom, solucan, araştırma yapılan çalışmalarda tüm fareler veya kültür hücreleri için önemli bir yardımcı olabileceğini düşündürmektedir solucanlar ve yüksek omurgalılar arasında büyük bir benzerlik ortaya koymuştur . Güçlü bir solucan araştırma ve önemli bir kısmı gen yerelleştirme ve fonksiyon çalışma transgenik hayvanlar kullanma yeteneği. Transgenik hayvanlar ya solucan germline mikroenjeksiyon yoluyla veya Biyolistik bombardımanı kullanmak suretiyle oluşturulabilir. Bombardıman yeni bir tekniktir ve laboratuarları bir dizi daha tanıdık geliyor. Burada Biyolistik Bio-Rad PDS-1000 sistemi kullanarak altın parçacıkları ile bombardımanı ile transgenik solucanlar oluşturmak için basit bir protokol açıklar. Hermafrodit germline içine DNA mikroenjeksiyon ile karşılaştırıldığında, bu protokol solucan anatomisi tanımlanması veya mikroenjeksiyon performans açısından operatör özel beceri gerektiren bir avantaja sahiptir. Ayrıca birden fazla transgenik hatları genellikle tek bir bombardıman elde edilir. Ayrıca mikroenjeksiyon aksine, Biyolistik bombardıman ekstrakromozomal diziler ve entegre transgenlerin ile transgenik hayvanlar üretir. Entegre transgenik çizgiler elde etme yeteneği, yabancı DNA&#39;nın entegre mutajenik protokollerin kullanımını önlemek. Sonuç olarak, özellikle mikroenjeksiyon az becerikli olmak için gerekli olan zaman ve çaba yatırım ilgilenen araştırmacılar için Biyolistik bombardımanı, transgenik hayvan üretimi için cazip bir yöntem olabilir.

Transgenik solucanlar yaygın olarak kullanılır<em&gt; C. elegans</em&gt; Araştırma. Açıklanan DNA kaplı altın parçacıkları ile Biyolistik bombardımanı kullanarak solucanlar transgenlerin tanıtmak için, basit ama etkili bir protokoldür. Transgenik hayvan üretimi için mikroenjeksiyon ile ilgili çaba ve bombardıman sonuçları olumlu karşılaştırın.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

Serbest yaşayan nematod C. elegans'ı kullanan laboratuvarların sayısı hızla artmaktadır. Bu biyolojik modelin popülerliği, hızlı bir...

Bu prosedürün genel amacı, biyotik veya gen tabancası transfeksiyonu yoluyla transgenik solucanlar üretmektir. İlk olarak büyük miktarlarda solucan yetiştirilir, ardından altın partiküller DNA ile kaplanır ve solucanlar bombardımana tutulur; daha sonra transgenik yavrular izole edilip kurtarılır ve yeni transgenik hatlar oluşturulur. Merhaba, ben Pittsburgh Üniversitesi Tıp Bölümü'ndeki Dr. Alfred Fisher'ın laboratuvarından Daniel Owa.Bugün sizlere transgenik solucanlar üretme prosedürünü göstereceğiz. Bu prosedürü, transkripsiyon faktörleri tarafından gerçekleştirilen gen düzenlemesini incelemek için kullanıyoruz. Hadi başlayalım.Yumurta plakası hazırlığı, Nystatin ve strepsomisin ile desteklenmiş NGA besiyerinde %2 agar karışımının dökülmesiyle başlar. 10 ila 50 santimetrelik plakaların oda sıcaklığında kurumasına izin verin. Ardından, 500 mililitrelik bir şişedeki 400 mililitre LB besiyerini ve 250 mililitrelik bir erlendeki 40 mililitre LB besiyerini otoklavlayın.Ayrıca boş bir 500 mililitrelik şişeyi 20 dakika boyunca otoklavlayın. Otoklavlama işlemi bittikten sonra, 40 mililitre LB besiyerine final konsantrasyonu 200 mikrogram/mililitre olacak şekilde streptomisin ekleyin. Ardından e coli suşu ile inoküle edin.OP 50 bir. Kültürün 37 °C'de gece boyunca büyümesine izin verin. Ertesi gün, 10 tavuk yumurtasının sarılarını steril 500 mL'lik şişeye yerleştirin.Hacmi LB besiyeri ile 400 mililitreye tamamlayın ve homojen bir çözelti oluşturmak için çalkalayın. Çözeltiyi 60 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. LB karışımı oda sıcaklığına soğuduğunda, şişeye 40 mililitre ELI kültürü ekleyin ve çalkalayın.Ardından, hazırlanan NGA plaklarının üzerine beş ila sekiz mililitre kültür pipetleyin. Bunların oda sıcaklığında gece boyunca kurumasına izin verin. Ertesi gün kalan sıvıyı dökün ve oda sıcaklığında bir gece daha kurutun.Bu aşamada plakalar, dört °C'de bir ila iki ay boyunca saklanabilir veya hemen solucanlar ekilebilir. Bir DP 38 CL popülasyonunu genişletmek için, yeni aç bırakılmış DP 38 solucanları içeren altı santimetrelik NGA plakalarına konsantre e coli OP 50 ekleyin ve inkübe edin. DP 38 solucanlarından yumurtaları izole etmek için alkali hipoklorit çözeltisi kullanın.Prosedür ekteki protokolde açıklanmıştır. Yumurtalar izole edildikten sonra, onları S basil veya M nine tamponlarına süspanse edin. Hazırlanan her bir 10 santimetrelik yumurta plakasına 10.000'den fazla yumurta ekleyin ve solucanların 20 °C'de yedi ila 10 gün boyunca büyümesine izin verin.Solucanlar yemi tüketmeye başladığında, plaklar bombardımana hazır hale gelmiş olur. Bombardıman için altın partiküllerini DNA ile kaplamak amacıyla, 1,7 mililitrelik bir tüpe 60 miligram altın partikülü ekleyin. Ardından %70 etanol ekleyin ve altının 15 dakika boyunca emmesini sağlayın.Altın partiküllerini çöktürmek için tüpü kısa süreliğine santrifüjleyin. Etanolü dökün. Ardından, altın partiküllerini steril su ile üç kez yıkayın.Altını bir mililitre %50 steril gliserol içinde yeniden süspande edin. Altın partikül stok çözeltisi, dört derece Celsius'ta aylarca saklanabilir. Ardından, solucanları s basil veya M line tamponları kullanarak yumurta plakalarından yüzdürme yöntemiyle toplayın.Ardından bunları 50 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Solucanların tüpün dibine çökmesini bekleyin. Daha sonra, kalan tampon çözeltiyi kullanarak tüpteki tamponun iki ila üç mililitresi hariç tamamını aspire edin.Solucanları, buz üzerinde eşit şekilde soğutulmuş 10 santimetrelik beneksiz bir NGA plakasına aktarın. Solucanları plakanın tamamına dağıtın. Ardından plakanın buz üzerinde tamamen kurumasına izin verin.Bu işlem, kurutma sırasında solucanların kümelenmesini önleyecektir. Bombardıman prosedüründen önce solucanların eşit şekilde dağılmış olması ve plağın tamamen kurumuş olması önemlidir. DNA kaplı altın partikülleri hazırlamak için, 1,7 mililitrelik bir tüpe 50 µL resüspande edilmiş altın partikülü ekleyin.Altın partikülleri santrifüjle çöktürün ve süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, ilgi duyulan saflaştırılmış, dairesel veya lineerleştirilmiş DNA'dan 10 ila 15 µg ile taze hazırlanmış 0,1 M spermin karışımının 20 µL'sini ekleyin. Son olarak, tüpü hafifçe vortekslerken 50 µL 2,5 M kalsiyum klorür ekleyin ve altın partiküllerini süspansiyon halinde tutmak için karışımı, periyodik olarak karıştırarak 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.30 dakika sonra, altın partikül karışımını santrifüjleyin. Süpernatantı kısaca aspire edin ve önce 300 µL %70 etanol ile, ardından 1 mL %100 etanol ile yıkayın; son olarak DNA kaplı altın partiküllerini 170 µL %100 etanol içinde yeniden süspande edin. Her bombardıman için, altın partikülleri tutacak olan yedi makro taşıyıcıyı propanol ile durulayın ve ardından oda sıcaklığında kurumaya bırakın.DNA altın karışımını vorteksleyin. Ardından, her bir makro taşıyıcının merkezine 20 µL pipetleyin. Etanolün buharlaşmasını bekleyin.Ruptür diskini Hector adaptörüne yerleştirin ve adaptörü bombardıman düzeneğine sabitleyin. Ardından yedi makro taşıyıcıyı tutucuya yerleştirin ve onları oturtmak için verilen aracı kullanın. Son olarak, bir Hector durdurma ekranını ve alt tabanı tutucunun üzerine yerleştirin.Makro taşıyıcıların altın benekli tarafı aşağıya bakacak şekilde tutucuyu ters çevirin. Ardından, tutucuyu üstten ikinci rafa yerleştirin. Makro taşıyıcı tutucusunun üst kısmındaki delikleri Hector adaptörünün çıkışlarıyla hizalayın.Solucan kaplı NGA plakasının kapağını çıkarın ve bombardıman odasındaki en alt rafa yerleştirin. Vakum akış hızı düğmesini tamamen açın ve oda 26 inç cıvaya ulaşana kadar vac düğmesine basılı tutun. Ardından hold konumuna geçin; vakumu korumak için disk patlayana kadar fire düğmesine basılı tutun.Bu işlem, basınç 1, 350 PSI'ye ulaştığında gerçekleşir ve beş ila 20 saniye sürebilir. Düğmeyi bırakın, vent konumuna geçerek odağındaki vakumu tahliye edin ve plakayı çıkarın. Helyumdaki vakumu kapatın.Ardından, helyum hattı temizlenene ve helyum göstergesi 0 PSI değerini gösterene kadar birkaç kez ateşleme düğmesine basın. Son olarak PDS 1000 sistemini kapatın. Solucanlar transforme edildiğine göre, bombardıman sonrası geri kazanılabilir ve inkübe edilebilirler.Plakayı 20 °C'de 20 dakika bekletin. Ardından 10 mL S basil veya M nine tamponu ile solucanları plaktan yüzdürerek toplayın ve 20 adet 10 cm'lik benekli NGA plakasına, tampon içindeki solucanlardan 0,5 mL olacak şekilde inoküle edin. Daha sonra plakaları yaklaşık iki hafta boyunca oda sıcaklığında bırakın.Transgen tarafından UNC-19 fenotipinin kurtarılıp kurtarılmadığını tarayın ve kurtarılmış solucanlar içeren her 10 cm'lik plakadan birer bireysel hat oluşturun. Transgenik hayvanlar elde etme konusunda protokolün başarısı, kullanılan özel transgene bağlıdır. Promotör GFP raporcu transgenleri ile 20 hatta kadar sonuç elde ettik.Daha tipik bir sonuç üç ila 10 hattır. Transgenik hatların %30'una kadarı entegre hatlardır, ancak bu durum rastgeledir ve özellikle entegre bir hat isteniyorsa tek bir günde birden fazla bombardıman gerçekleştirilir. Görselde, transgen bombardımanı ile kurtarılan 19 mutant solucanın bulunduğu temsili bir 10 santimetrelik plaka gösterilmektedir.Kurtarılan solucanlar, transformasyon yapılmamış olanlara kıyasla daha büyük boyutları ve çok daha gelişmiş hareket kabiliyetleri ile tanımlanabilir. Bir tanesinde 19 mutant bulunmaktadır. far-1 GFP transgeni ile transforme edilmiş kurtarılan solucanların izolasyonu, GFP ekspresyonu ile sonuçlanır.Bu transgen, transgenik solucanların bağırsak ve hipodermisinde güçlü bir şekilde GFP eksprese eder. Bu özel transgen solucan kromozomuna entegre edilmiştir ve dölün %100'ü transgeni eksprese eder. Bu prosedürü gerçekleştirirken C. elegans'a nasıl biyolistik bombardıman yapılacağını az önce gösterdik.Yeterli miktarda solucan yetiştirmek ve taze izinler kullanmak önemlidir. Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler ve deneylerinizde başarılar dileriz.

generation-of-transgenic-c-elegans-by-biolistic-transformation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video transgenik hayvanlar oluşturmak için C. elegans gonad içine mikroenjeksiyon tekniği göstermektedir.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Üretimi C. elegans Recombineering yoluyla transgenlerin GalK Seçilebilir Marker

Bu video, C. elegans'ta RNAi tedavisinin arkasındaki prensipleri açıklar ve bir transgenik solucan suşunda lin-35'i nakavt etmek için bir protokol gösterir.

C. elegans Beslemesi için RNAi Kaplama: E. coli'de Hedef dsRNA Ekspresyonunu İndüklemek İçin Bir Teknik

Bu protokol, ultraviyole (UV) ışınlaması kullanılarak transgenik ekstrakromozomal dizilerin Caenorhabditis elegans genomuna entegrasyonu için hızlı ve düşük malzeme tüketen bir prosedürü tanımlar. Ayrıca, bu protokol özellikle ekstrakromozomal dizileri yüksek oranda ileten transgenik hatlar için çok uygundur.

Yüksek İletim Hızına Sahip Ekstrakromozomal Dizileri C. elegans Genomuna Entegre Etmek İçin Hızlı Bir Protokol

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Kültürleme Caenorhabditis elegans Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

Bu iletişim kuralı, hücresel Caenorhabditis elegans içinde vivohücre kaderi dönüşüm sırasında çalışma açıklar. Transjenik hayvanlar, ısı-şok organizatörü tahrik overexpression nöron kader-inducing transkripsiyon faktörü CHE-1 ve Kromatin düzenleyen faktör LIN-53 mikrop nöron yeniden programlama için hücre RNAi aracılı tükenmesi izin kullanarak gözlenen vivo.<br...

Uygulama için yeniden programlamak Germ hücreleri için C. elegans nöronlarda RNAi ve transkripsiyon faktörü ifade ısı şok bağlı

Burada, CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ve homoloji bağımlı onarım şablonları kullanarak C. elegans genom mühendisi bir yöntem mevcut.

Bir hızlı ve genomik noktası mutantlar C. elegans kullanarak CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins üreten Facile boru hattı

Parazitik nematodlar Strongyloides stercoralis ve Strongyloides ratti için fonksiyonel genomik araç seti transgenez, CRISPR / Cas9 aracılı mutagenez ve RNAi'yi içerir. Bu protokol, transgenleri ve CRISPR bileşenlerini S. stercoralis ve S . ratti'ye tanıtmak için intragonadal mikroenjeksiyonun nasıl kullanılacağını gösterecektir.

Strongyloides Türlerinde Mikroenjeksiyon ile Transgenik ve Nakavt Üretimi

Bu çalışma, zebra balığı embriyolarına transgenik yapılar oluşturmak ve enjekte etmek için ağ geçidi tabanlı bir klonlama yöntemi olan modüler Tol2 transgenez sistemi için bir protokolü açıklamaktadır.

Zebra Balığı Tol2 Sistemi: Modüler ve Esnek Ağ Geçidi Tabanlı Transgenez Yaklaşımı

Bu protokol, C. elegans'ta RNAi kaynaklı susturma ve ilişkili kromatin modifikasyonlarının epigenetik kalıtımını incelemek için bir RNA girişimini ve ChIP testini açıklar.

Nesiller Arası Epigenetik Kalıtımın Analizi C. elegans Floresan Raportör ve Kromatin İmmünopresipitasyon (ChIP) Kullanılarak

Caenorhabditis elegans germ hattında endogen floresan etiketleme için CRISPR/Cas9 mikroenjeksiyon iş akışı, in vivo protein lokalizasyon analizi için homozigot knock-in çizgileri elde etmek.

Caenorhabditis elegans'ta CRISPR/Cas9 aracılı Endojen Floresan Etiketleme Germline-Spesifik Genlerin

Öğrenin, C. elegans'ta transgenik solucan üretimi için biyolistik bombardıman yöntemini. DNA kaplı altın partiküller kullanarak gen düzenlemesi çalışmalarını kolaylaştıran bu protokol, mikroenjeksiyona etkili bir alternatif sunar.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

Daha fazla video keşfet