siRNA Ters Transfeksiyon Tabanlı Gen Susturma In Vitro: Hedef Gen Ekspresyonunu İnaktive Etmek için Kültürlenmiş Hücrelerde Küçük Enterferans Yapan RNA Verme Prosedürü

Küçük enterferans yapan RNA'nın veya bir çift sarmallı RNA sınıfı olan siRNA'nın yapışık olmayan adipositlere veya yağ hücrelerine ters transfeksiyonu için, adipositlerde spesifik bir protein kodlayan geni hedefleyen bir siRNA süspansiyonu hazırlayın. Uygun bir katyonik lipid bazlı transfeksiyon reaktifi ekleyin. Elektrostatik etkileşimler yoluyla transfeksiyon kompleksleri oluşturmak için karışımı inkübe edin.

Karışımı çok kuyulu bir plakanın kollajen kaplı kuyucuklarına aktarın. Transfeksiyon kompleksleri, spesifik olmayan etkileşimlerle plaka kaplaması üzerinde hareketsiz hale gelir. İmmobilize transfeksiyon kompleksleri içeren kuyucuklara bir adiposit süspansiyonu pipetleyin. Adipositler, plaka kaplamasına gevşek bir şekilde yapışarak hücreler ve kompleksler arasındaki fiziksel teması arttırır.

Transfeksiyon kompleksi hücre zarına kaynaşır ve siRNA'yı sitoplazmaya iletir. mRNA'yı hedeflemek için tamamlayıcı bir diziye sahip bir antisens iplik ve bir duyu ipliği içeren siRNA, çok proteinli RNA'yı indükleyen susturma kompleksi veya RISC tarafından tanınır. siRNA, RISC'ye bağlanır ve iplikler ayrılır, antisens iplik komplekse bağlı kalır.

Aktive edilmiş siRNA-RISC kompleksi, hedef mRNA üzerindeki tamamlayıcı bölgeleri tanır ve bunlara bağlanır. Bu, RISC kompleksinin argonaute proteini tarafından mRNA'nın diziye özgü bölünmesine yol açar. Bölünmüş mRNA, hücresel mekanizma tarafından daha da bozulur, böylece hedef gen ekspresyonunu susturur.