Tol2 Transpozon Aracılı Zebra Balığı Transgenezi: Tol2 Sisteminin Döllenmiş Zebra Balığı Embriyolarına Koenjeksiyonunu Takiben Transgenik Zebra Balığı Oluşturma Prosedürü

Bir mikroenjeksiyon kalıbının kuyucuklarına yerleştirilmiş canlı, tek hücreli aşama zebra balığı embriyoları ile başlayın.

Tol2 transpozaz kodlayan mRNA ve transpozon donör plazmitleri içeren bir çözelti ile bir mikroenjeksiyon iğnesi yükleyin. Plazmitler, her yerde bulunan bir zebra balığı promotörü ve Tol2 transpozon kolları ile çevrili bir floresan protein kodlayan gen içerir.

Mikroenjeksiyon solüsyonunu zebra balığı embriyosunun sitoplazmasına dikkatlice enjekte edin. Hücre içinde, Tol2 transpozaz mRNA'ları Tol2 transpozaz proteinlerine dönüşür ve aktif olarak çekirdeğe taşınır.

Donör plazmidindeki Tol2 bölgeleri, raportör geni çevreleyen spesifik ters çevrilmiş terminal tekrarları veya ITR'leri içerir. ITR'ler kısa, doğrudan tekrarlarla çevrilidir. Transpozaz proteinleri, ITR bölgelerini tanır ve bunlara bağlanır, bu da yan DNA üzerinde bir saç tokası oluşturur. Transpozazlar, transpozon yapısını yan DNA'dan daha da böler, onu plazmidden serbest bırakır ve kısa, doğrudan tekrarları geride bırakır.

Transpozazlar, somatik hücre genomunda kademeli bir çift sarmallı kırılma oluşturur ve transpozon yapısını genom bölgesine yerleştirir. Kademeli uçların DNA polimeraz ile boşluk doldurulması ve ardından çentiklerin ligasyonu kısa, doğrudan tekrarlar oluşturur.

Ligasyon, somatik hücre genomuna stabil transpozon yapı entegrasyonuna neden olur ve promotör, floresan protein ekspresyonunu kolaylaştırır. Enjekte edilen embriyoları inkübe edin. Embriyonik gelişim sırasında, somatik hücreler farklı hücre tiplerine yol açar ve transgenik zebra balığı oluşturur.