Optimum Tavlama Sıcaklığını Belirlemek için Gradyan Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Gradyan polimeraz zincir reaksiyonu, primerlerin - diziye özgü, tek sarmallı DNA - şablon DNA üzerindeki tamamlayıcı bölgelere bağlandığı tavlama sıcaklığını optimize etmek için bir tekniktir.

Uygun bir tamponda ileri ve geri primerler, dNTP'ler ve termostabil DNA polimeraz içeren bir karışım alın. Şablon DNA'yı ekleyin ve bileşenleri bir PCR plakasına aktarın.

Plakayı, özel bir ısıtma bloğuna sahip gradyan bir termal döngüleyiciye yerleştirin. Bu, 55 ° C ila 65 ° C aralığı arasında doğrusal bir tavlama sıcaklığı gradyanı oluşturur ve plaka boyunca sıcaklıkta tutarlı bir artış sağlar.

Reaksiyon, plakayı yüksek bir sıcaklıkta ısıtır, çift sarmallı DNA'yı tek sarmallara denatüre eder ve DNA polimerazı aktive eder. Daha sonra her bir kuyucukta programlanan değerlere göre sıcaklık düşürülerek astar tavlaması kolaylaştırılır.

Optimumun altındaki tavlama sıcaklığında, primerler denatüre DNA'ya spesifik olmayan bir şekilde bağlanır ve PCR reaksiyonu sırasında spesifik olmayan amplifikasyona yol açar. Optimum sıcaklığın üzerindeki sıcaklıkta, yetersiz miktarda primer DNA'ya bağlanır.

Optimum sıcaklıkta, primerler spesifik olarak hedef DNA'ya bağlanır. Daha sonra, sıcaklık hafifçe artar ve polimerazın dNTP'leri kullanarak primerleri uzatmasına izin verir. Bu tekrarlayan denatürasyon, tavlama ve uzatma döngüleri DNA amplifikasyonuna yol açar.

Ürünü her bir kuyucukta analiz edin. Optimum olmayan tavlama sıcaklıklarına sahip kuyucuklar daha az veya spesifik olmayan amplifikasyon gösterir.

Optimum bir tavlama sıcaklığı, DNA'nın maksimum spesifik amplifikasyonunu üretir.