Lökositlerde DNA Metilasyonunu Tespit Etmek için Multipleks Damlacık Polimeraz Zincir Reaksiyonu

DNA sitozin kalıntısı metilasyonu, lökositlerin veya beyaz kan hücrelerinin karakteristik bir özelliğidir.

Multipleks damlacık polimeraz zincir reaksiyonu veya mdPCR, lökositler içindeki çoklu metillenmiş DNA bölgelerinin aynı anda tanımlanmasına izin verir.

Reaksiyon tamponu, DNA polimeraz ve nükleaz içermeyen su içeren bir karışım hazırlayın. Her hedef bölge için özel ileri ve geri primerler ve floresan hidroliz probları ekleyin. Problar, floresan emisyonunu engellemek için söndürücülere bağlı farklı renkli florofor raportörleri içerir.

Bisülfite dönüştürülmüş DNA ekleyin, burada metillenmemiş sitozinler urasillere deamine edilirken metillenmiş sitozinler değişmeden kalır. Karışım.

Bir cam şırıngayı bir taşıyıcı yağ-yüzey aktif madde karışımı ve diğerini bir taşıyıcı yağ-PCR karışımı ile doldurun ve bunları mikroakışkan damlacık jeneratörüne bağlayın. Taşıyıcı yağ-sulu PCR karışımı, nanolitre altı boyutlu damlacıklar halinde emülsifiye olur. Yüzey aktif madde emülsiyonu stabilize eder ve damlacık birleşmesini önler.

Damlacıkları toplayın ve PCR gerçekleştirin. Her damlacık içinde, yüksek denatüre edici sıcaklık, çift sarmallı DNA'yı tek sarmallı DNA'ya denatüre eder ve polimerazı aktive eder. Reaksiyon sıcaklığı düşürülür, bu da astarların ve probların sahaya özgü tavlanmasına izin verir.

Polimeraz, DNA-primer dupleksini bağlayıp uzattıkça, urasiller timinler olarak çoğalırken, metillenmiş sitozinler sitozinler olarak çoğalır ve metillenmiş ve metillenmemiş bölgelerin ayrımına izin verir. Polimeraz ayrıca raportörü probdan ayırır ve serbest bırakır, bu da floresan emisyonuna neden olur.

PCR sonrası, damlaları mikroskop altında görselleştirin. Floresan rengi, spesifik metillenmiş DNA hedeflerinin varlığını gösterir.