Name: Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-15T16:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: Öğrenin Drosophila larvalarında sinaptik veziküllerin canlı görüntülenmesi yöntemini. Bu teknik, aksonal taşıma bozukluklarını ve nörolojik hastalıklardaki etkilerini incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

SG, Buffalo New York Devlet Üniversitesi ve John R. Oishei Vakfı fonları tarafından desteklenmektedir. MK UB CURCA tarafından Öğrenci Araştırma Ödülü ile desteklenmiştir.

1. Reaktiflerin hazırlanması <ol><li> Diseksiyonu tampon hazırlama, 7.2 ve sterilize 128 mM NaCl, 1mm EGTA, 4 mM MgCl 2, 2mm KCl, 5mM Hepes ve 1000 ml, PH 36 mM Sakkaroz: Aşağıdaki bileşikleri ekleyerek hazırlayın . </li></ol> 2. Diseksiyon için hazırlanması <ol><li> Siligard küp jel yaklaşık bir inç genişliğinde, 1 inç uzunluğunda ve yüksekliği yaklaşık 1cm kesilir. Jel küp Diseksiyon sırasında bir bardak slayt yerleştirilir. Küpleri birden fazla kez kullanılabilir. </li><li> Pimler: diseksiyon için kullanılan Pins kısa ekstra gerekir. Minutien pimleri keskin alt kısmında diseksiyonu en iyi çalışır. </li><li> Bir keskin mikrodiseksiyon bahar makas ihtiyacınız var. </li><li> Iki ince uçlu forseps ihtiyacınız var. </li></ol> 3. Larva, Toplanması <ol><li> 3. instar larvaları GFP etiketli vezikül proteini ifade Wandering petri üzerine toplanır. </li><li> Larva tüm gıda kurtulmak için deiyonize su ile yıkanır. </li></ol> 4. Larvaların Canlı diseksiyon <ol><li> Bir larva, bir bardak slayt diseksiyonu jel küp aktarılır. Larva diseksiyonu tampon batırılır. </li><li> Larva ön ve arka dorsal yüzü iki güzel iğne kullanarak pined. </li><li> Mikrodiseksiyon makas kullanarak, arka sonuna yakın, orta hatta küçük bir kesi yapılır. Bu kesiden ön kesme ile yapılır. Iki iğne kullanarak, yan kenarları kesme manikür pin. </li><li> Tampon diseksiyon bir damla ekleyin. Gut, bağırsak ve yağ organları forseps ile dikkatlice çıkartın. Bu dokuların çoğu normalde dorsal kesim sırasında sızmak. </li><li> Taze diseksiyon tampon tampona değiştirin. Larva kuru olması asla ve sürekli tampon diseksiyon olmalıdır. </li><li> In vivo belirteçlerinin MitoTracker veya LysoTracker kullanarak inkübatörü diseksiyonu tampon in vivo marker seyreltilmesi, şu anda yapılır. In vivo işaretleyicisinde inkübasyondan sonra disseke larva taze diseksiyon tampon kullanarak birkaç kez (5 hızlı yıkama) yıkayın. </li><li> Değiştirdikten sonra son yıkama syligard ve hemen lamel pimleri itin. Larvaları artık gözlem için hazır. </li></ol> 5. Disseke larvaları Canlı görüntüleme <ol><li> Ters bir mikroskop kullanılarak mikroskop sahne ve görüntü üzerine lamel ve jel yerleştirin. </li><li> Biz larva segmental sinirler içinde görüntü etiketli veziküller 100x bir objektif kullanın. GFP ifade ventral ganglion hücre organları segmental sinirler görüntülü önce ilk olarak değerlendirilir. Ventral ganglion hücre gövdeleri sağlam GFP boyama görülürse, sinirleri sonra görüntülü ve değerlendirme için kullanılır. </li><li> CFP / YFP veya RFP / YFP filtreleri ve in vivo olarak biz aynı anda görüntü iki etiketli protein split görünümü yazılımı ile ikili bir görüş sistemi kullanma. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: bir larva segmental sinir içinde birçok aksonal pistlerde birçok aksonal veziküller gösteren temsili resim aksonal birikimleri temsil eden, GFP lekeler unutmayın . <img src="/files/ftp_upload/2151/2151fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: bir larva segmental sinir içinde birçok aksonal veziküller ile tek bir akson parça gösteren temsili resim.

<ol><li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118, 401-415 (1993).</li>
<li>Hurd, D. D., Saxton, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin+mutations+cause+motor+neuron+disease+phenotypes+by+disrupting+fast+axonal+transport+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Kinesin mutations cause motor neuron disease phenotypes by disrupting fast axonal transport in Drosophila.</a> Genetics. 144, 1075-1085 (1996).</li>
<li>Gunawardena, S., Her, L. S., Brusch, R. G., Laymon, R. A., Niesman, I. R., Gordesky-Gold, B., Sintasath, L., Bonini, N. M., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+axonal+transport+by+loss+of+huntingtin+or+expression+of+pathogenic+polyQ+proteins+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Disruption of axonal transport by loss of huntingtin or expression of pathogenic polyQ proteins in Drosophila.</a> Neuron. 40, 25-40 (2003).</li>
</ol>

Drosophila larva segmental sinirler içinde sinaptik vezikül taşıma in vivo görüntüleme aksonal taşıma mekanizmaları çalışmak için güçlü bir araçtır. Daha önce larva sinirler içinde tekrarlar genişleme vezikül taşımacılığı 3 dinamiklerini nasıl etkilediğini aydınlatmak için genişletilmiş polyQ tekrarlar ifade taşıma dinamikleri değerlendirmek için bu protokolü kullandık. Bu protokolü kullanarak vezikül hareketinin hızı, video akışı bir kymograph dönüştürerek tespit edilebilir. Genetik kullana...

<table><tbody><tr><td>1 Çift Mikro Diseksiyon Makası</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Yaylı makas &amp;#8211; 6mm bıçak. 0.125 mm uç çapı</td></tr><tr><td>2 Çift Pens</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Fisherbrand Diseksiyon Mikro-Adson tırtıklı uçlu pens</td></tr><tr><td>Diseksiyon İğnesi Kutusu</td><td>Fine Science Tools</td><td></td><td>Minutien İğneler 0.1mm çap</td></tr></tbody></table>

drosophila larvaların segmental aksonlar içinde sinaptik veziküller in vivo görselleştirme

In vivo Visualization of Synaptic Vesicles Within Drosophila Larval Segmental Axons

Aksonal taşıma mekanizmaları nedenlerine açıklık uzun mesafe taşımacılığı hatalarına farklı nörolojik hastalıklar nasıl etkilediğini belirlemede çok önemli olduğunu göstermiştir. Bu temel süreç Hataları nöronal işleyişi ve gelişimi üzerinde zararlı etkileri olabilir. Biz, ortaya çıkarmak için tasarlanmış bir diseksiyon protokol geliştirdiler<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva segmental sinirler gerçek zamanlı olarak aksonal taşıma görüntülemek için. Biz Hurd ve larva segmental sinirler immunolocalizatin için kullanılan Saxton (1996) tarafından yayınlanan bir canlı görüntüleme için bu protokol adapte var. Dikkatli diseksiyon ve uygun tampon koşulları disseke larvaların ömrünü maksimize etmek için kritik öneme sahiptir. Düzgün yapılmazsa, disseke larvaları fizyolojik şartlar altında 2-3 saat için sağlam vezikül taşıma göstermiştir. Biz UAS GAL4 yöntemi kullanın<sup&gt; 1</sup&gt; Ifade GFP-etiketli farklı nöronal GAL4 sürücülerini kullanarak, tek bir larva segmental sinirler akson veya birçok aksonlar içinde APP veya synaptotagmin vezikül. Diğer floresan etiketli işaretleyicileri, örneğin mitochrondria (MitoTracker) veya lizozomlar (LysoTracker), görüntülemeden önce larva uygulanan olabilir. GFP-vezikül hareket ve parçacık hareketi ayrı dalga boylarını kullanan eş zamanlı olarak görülebilir.

Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.<em&gt; Drosophila</em&gt; Görüntüleme amacıyla mikrotübül parça GFP etiketli aksonal vezikül hareketi larvaları.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Aksonal transport mekanizmalarının aydınlatılmasının, uzun mesafeli transporttaki kusurların farklı ... etkilediğinin belirlenmesinde çok önemli olduğu gösterilmiştir.

Alzheimer hastalığı veya Huntington hastalığı gibi nörolojik hastalıklarda uzun mesafeli aksonal taşıma kusurlarının mevcut olup olmadığını incelemek için. Taşıma veziküllerinin aksonal taşıması canlı özofageal lavada görüntülenir. Burada merak edilen konudur.A GFP etiketli sical proteini eksprese eden üçüncü evre yıldız larvaları bir jel küp üzerinde diseke edilir, ardından in vivo görüntüleme için mikroskoba aktarılır. Akson içindeki sical transportunu takip etmek için floresan mikroskopi kullanılır. Bu tekniği mevcut yöntemlere tercih etmenin temel avantajı, sinaptik veziküllerin ve larval aksonların canlı ve bozulmamış hareketini görselleştirebilmektir.Aşağıdaki malzemelerin ve reaktiflerin hazır olduğundan emin olarak diseksiyon işlemine hazırlanın. Diseksiyon tamponu. Bir lam üzerine yerleştirilmiş, bir inç genişliğinde, bir inç uzunluğunda ve bir santimetre yüksekliğinde kesilmiş bir Sill guard küpü.Ekstra kısa diseksiyon iğneleri. Manum iğnelerinin keskin alt kısmı diseksiyonda en iyi sonucu verir. Daha uzun iğnelerin jelin içine yerleştirilmesi ve iğnenin dışarıda kalan kısmının kesilmesiyle uygun uzunluk elde edilebilir.Ayrıca bir çift keskin mikrodissection yaylı makasa ve iki set ince uçlu pensete ihtiyacınız olacaktır. GFP etiketli SLE proteini eksprese eden gezen üçüncü evre yıldız larvalarını bir Petri kabına aktarmak için küçük bir metal spatula kullanın.Ardından, tüm yemden kurtulmak için Petri kabındaki larvaların üzerine deiyonize su uygulayın. Daha sonra, canlı diseksiyonu gerçekleştirmek için pens kullanarak larvaları bir diseksiyon jel küpüne aktarın. Bir larvayı diseksiyon jel küpüne aktarmak için pens kullanın.Bir lam üzerine, lamı daldıracak miktarda diseksiyon tamponu ekleyin. Ardından, lavı dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde ön ve arka uçlarından iğneleyin. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, arka uca yakın orta hat üzerinde küçük bir kesi yapın.Bu kesiden başlayarak antere doğru bir kesi daha yapın. Bağırsaklar ve yağ cisimcikleri dışarı çıkacaktır; bunları iki adet iğne kullanarak sabitleyin. Kesilen kütikülün yan kenarlarını sil koruma küpüne sabitleyin.Bir pipet kullanarak bir damla diseksiyon tamponu ekleyin. Ardından, pens yardımıyla bağırsakları ve yağ cisimlerini dikkatlice çıkarın. Bir yandan pipetle taze diseksiyon tamponu eklerken, diğer yandan larva üzerindeki tamponu temizlemek için bir kim wipe uygulayın.Lava asla kurumamalıdır. Lavadaki mitokondriyal veya lizozomal yapıları işaretlemek için, diseksiyon tamponunu mito tracker veya lyo tracker içeren diseksiyon tamponu ile değiştirin. Diseksiyon küpünü kare şeklinde nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirin ve üzerini alüminyum folyo ile kapatın.Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. In vivo markör inkübasyonundan sonra, larvaların etrafındaki diseksiyon tamponunu tekrarlayan şekilde çekip alın ve bir pipet yardımıyla yeni diseksiyon tamponu ekleyin. Kalan tüm markörü temizlemek için bu işlemi beş kez tekrarlayın.Son yıkama işleminin ardından, pinleri S koruyucusunun içine tamamen itin ve larvaların hareketini önlemek için derhal bir lam kullanın. Larva, diseke edilmiş lavanın canlı görüntülemesi için artık gözleme hazırdır. İşaretli vezikülleri görüntülemek için numuneyi ters bir mikroskobun tablasına yerleştirin.Larval segment sinirleri içerisinde. Görüntülemeyi 100 kat objektif lens kullanarak gerçekleştirin. Ventral ganglion görüntüsündeki hücre gövdelerinde güçlü GFP boyanması gözlemlenirse, C-F-P-Y-F-P veya R-F-P-Y-F-P filtrelerine sahip çift görünüm sistemi ve bölünmüş görünüm yazılımı kullanılarak segment sinirlerindeki iki in vivo etiketli protein aynı anda görüntülenebilir.Bu zaman atlamalı seride, bir larva segmental siniri içindeki birçok aksonal yol üzerinde çok sayıda aksonal vezikül görülmektedir. Aksonal birikimleri temsil eden GFP'ye ve veziküllerin çift yönlü hareketine dikkat edin. Burada, bir larva segmental siniri içindeki tek bir yol üzerindeki aksonal veziküllerin hareketi görülmektedir.Not: Bu yapıların çift yönlü hareketi saniyede ortalama bir mikrondur. Bu videoyu izledikten sonra, GFP etiketli veziküllerin ve larval aksonların in vivo görüntülenmesi için temiz bir diseksiyonun nasıl tamamlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

in-vivo-visualization-synaptic-vesicles-within-drosophila-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Biz sinek larvaları konfokal mikroskobu ile floresan boyalar kullanarak canlı bir roman Tersyüz doku hazırlanması Glia nöromüsküler sinapsların yapısal özellikleri nitelendirdi. Biz HRP için flüoresan primer antikor ile canlı nöron terminalleri etiketli ve floresan Dextrans perisynaptic alan görüntülendi.

Canlı görselleştirme Drosophila</emFloresan Boyalar> Glial nöromüsküler Kavşağı

Drosophila melanogaster larvaları larva segmental sinirler içinde aksonal taşıma mekanizmalarının araştırılması için ideal bir model sistem sağlar. Bu yordamı kullanarak, 3. instar larvaları çeşitli mutasyonları taşıyan vahşi tip larva mukayese edilebilir.

3 Larvaların segmental sinirler Görselleştirme Rd Instar Drosophila Larvaların Hazırlıkları

Biz sahnelenen hazırlamak için prosedürü...

Tüm montaj Embriyonik Sinir Sistemi Görselleştirme Drosophila Embriyolar

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem...

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Aktif Bölgeleri Diseksiyon ve Görüntüleme Drosophila Nöromüsküler Junction

Bu video, bir floresan boya kullanarak channelrhodopsin eksprese eden Drosophila larvalarındaki nöromüsküler kavşaklarda sinaptik vezikül geri dönüşümünü incelemek için bir protokolü göstermektedir. Mavi ışık, channelrhodopsinleri aktive ederek kalsiyum akışına ve sinaptik vezikül ekzositozuna neden olur. Boya, nöronal membranlara entegre olur ve endositoz sırasında içselleştirilir, bu da floresanın artmasına neden olur. Daha fazla mavi ışık stimülasyonu, azaltılmış floresan ile gösterilen...

Drosophila Larvalarında Sinaptik Vezikül Geri Dönüşümü ve Floresan Boya Alımının Analizi

Kaynak: Jeong, S. Drosophila'da embriyonik motor nöronların aksonal projeksiyon modelinin görselleştirilmesi. J. Vis. Uzm.  (2017)Bu video, Drosophila embriyolarında aksonal projeksiyonların görselleştirilmesini göstermektedir. Motor nöronların immünoetiketlenmesi, nöronal yapıları ortaya çıkarmak için hassas diseksiyon ve diferansiyel girişim kontrast mikroskobu toplu olarak ayrıntılı nöronal mimariyi ortaya çıkararak aksonal projeksiyon paternlerini vurgular.

Drosophila'da Embriyonik Motor Nöronların Aksonal Projeksiyon Modellerinin Görselleştirilmesi

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu çalışma, geç evre-16 Drosophila melanogaster embriyolarının motor nöron projeksiyonlarını görselleştirmek için standart bir immünohistokimya yöntemini ayrıntılarıyla anlatıyor . FasII antikoru ile lekelenmiş sabit embriyoların filleted hazırlığı, motor akson yol bulma ve sinirsel gelişim sırasında hedef tanıma için gerekli genlerin karakterize edilmesi için güçlü bir araç sağlar.

Embriyonik Motor Nöronlarının Aksonal Projeksiyon Paterninin Görselleştirilmesi<em&gt; Drosophila</em

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Öğrenin Drosophila larvalarında sinaptik veziküllerin canlı görüntülenmesi yöntemini. Bu teknik, aksonal taşıma bozukluklarını ve nörolojik hastalıklardaki etkilerini incelemek için kullanılır.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Daha fazla video keşfet