Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme
15 Ekim 2010
Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor. Drosophila Görüntüleme amacıyla mikrotübül parça GFP etiketli aksonal vezikül hareketi larvaları.
Alzheimer hastalığı veya Huntington hastalığı gibi nörolojik hastalıklarda uzun mesafeli aksonal taşıma kusurlarının mevcut olup olmadığını incelemek için. Taşıma veziküllerinin aksonal taşıması canlı özofageal lavada görüntülenir. Burada merak edilen konudur.
A GFP etiketli sical proteini eksprese eden üçüncü evre yıldız larvaları bir jel küp üzerinde diseke edilir, ardından in vivo görüntüleme için mikroskoba aktarılır. Akson içindeki sical transportunu takip etmek için floresan mikroskopi kullanılır. Bu tekniği mevcut yöntemlere tercih etmenin temel avantajı, sinaptik veziküllerin ve larval aksonların canlı ve bozulmamış hareketini görselleştirebilmektir.
Aşağıdaki malzemelerin ve reaktiflerin hazır olduğundan emin olarak diseksiyon işlemine hazırlanın. Diseksiyon tamponu. Bir lam üzerine yerleştirilmiş, bir inç genişliğinde, bir inç uzunluğunda ve bir santimetre yüksekliğinde kesilmiş bir Sill guard küpü.
Ekstra kısa diseksiyon iğneleri. Manum iğnelerinin keskin alt kısmı diseksiyonda en iyi sonucu verir. Daha uzun iğnelerin jelin içine yerleştirilmesi ve iğnenin dışarıda kalan kısmının kesilmesiyle uygun uzunluk elde edilebilir.
Ayrıca bir çift keskin mikrodissection yaylı makasa ve iki set ince uçlu pensete ihtiyacınız olacaktır. GFP etiketli SLE proteini eksprese eden gezen üçüncü evre yıldız larvalarını bir Petri kabına aktarmak için küçük bir metal spatula kullanın.
Ardından, tüm yemden kurtulmak için Petri kabındaki larvaların üzerine deiyonize su uygulayın. Daha sonra, canlı diseksiyonu gerçekleştirmek için pens kullanarak larvaları bir diseksiyon jel küpüne aktarın. Bir larvayı diseksiyon jel küpüne aktarmak için pens kullanın.
Bir lam üzerine, lamı daldıracak miktarda diseksiyon tamponu ekleyin. Ardından, lavı dorsal tarafı yukarı bakacak şekilde ön ve arka uçlarından iğneleyin. Mikrodiseksiyon makası kullanarak, arka uca yakın orta hat üzerinde küçük bir kesi yapın.
Bu kesiden başlayarak antere doğru bir kesi daha yapın. Bağırsaklar ve yağ cisimcikleri dışarı çıkacaktır; bunları iki adet iğne kullanarak sabitleyin. Kesilen kütikülün yan kenarlarını sil koruma küpüne sabitleyin.
Bir pipet kullanarak bir damla diseksiyon tamponu ekleyin. Ardından, pens yardımıyla bağırsakları ve yağ cisimlerini dikkatlice çıkarın. Bir yandan pipetle taze diseksiyon tamponu eklerken, diğer yandan larva üzerindeki tamponu temizlemek için bir kim wipe uygulayın.
Lava asla kurumamalıdır. Lavadaki mitokondriyal veya lizozomal yapıları işaretlemek için, diseksiyon tamponunu mito tracker veya lyo tracker içeren diseksiyon tamponu ile değiştirin. Diseksiyon küpünü kare şeklinde nemlendirilmiş bir hazneye yerleştirin ve üzerini alüminyum folyo ile kapatın.
Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. In vivo markör inkübasyonundan sonra, larvaların etrafındaki diseksiyon tamponunu tekrarlayan şekilde çekip alın ve bir pipet yardımıyla yeni diseksiyon tamponu ekleyin. Kalan tüm markörü temizlemek için bu işlemi beş kez tekrarlayın.
Son yıkama işleminin ardından, pinleri S koruyucusunun içine tamamen itin ve larvaların hareketini önlemek için derhal bir lam kullanın. Larva, diseke edilmiş lavanın canlı görüntülemesi için artık gözleme hazırdır. İşaretli vezikülleri görüntülemek için numuneyi ters bir mikroskobun tablasına yerleştirin.
Larval segment sinirleri içerisinde. Görüntülemeyi 100 kat objektif lens kullanarak gerçekleştirin. Ventral ganglion görüntüsündeki hücre gövdelerinde güçlü GFP boyanması gözlemlenirse, C-F-P-Y-F-P veya R-F-P-Y-F-P filtrelerine sahip çift görünüm sistemi ve bölünmüş görünüm yazılımı kullanılarak segment sinirlerindeki iki in vivo etiketli protein aynı anda görüntülenebilir.
Bu zaman atlamalı seride, bir larva segmental siniri içindeki birçok aksonal yol üzerinde çok sayıda aksonal vezikül görülmektedir. Aksonal birikimleri temsil eden GFP'ye ve veziküllerin çift yönlü hareketine dikkat edin. Burada, bir larva segmental siniri içindeki tek bir yol üzerindeki aksonal veziküllerin hareketi görülmektedir.
Not: Bu yapıların çift yönlü hareketi saniyede ortalama bir mikrondur. Bu videoyu izledikten sonra, GFP etiketli veziküllerin ve larval aksonların in vivo görüntülenmesi için temiz bir diseksiyonun nasıl tamamlanacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, mikrotübül yolları üzerindeki GFP etiketli aksonal veziküllerin hareketinin görüntülenmesi için Drosophila larvalarının canlı diseksiyonunu ele almaktadır. Bu teknik, larval aksonlar içindeki sinaptik veziküllerin canlı ve kesintiye uğramamış hareketinin görselleştirilmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Hücre Biyolojisi
- Görüntüleme Teknikleri
Arka Plan
- Aksonal transport, nöronal fonksiyon için kritik öneme sahiptir.
- Aksonal transporttaki kusurlar, nörolojik hastalıklarla ilişkilendirilmektedir.
- Drosophila larvaları, bu süreçlerin incelenmesi için bir model organizma görevi görür.
- Floresan mikroskopi, vezikül hareketinin gerçek zamanlı gözlemlenmesini sağlar.
Çalışmanın Amacı
- Uzun mesafeli aksonal taşıma kusurlarını incelemek.
- Bu kusurların nörolojik hastalıklardaki etkilerini anlamak.
- Geliştirilmiş gözlem için canlı görüntüleme tekniklerinden yararlanmak.
Kullanılan Yöntemler
- GFP etiketli proteinler eksprese eden Drosophila larvalarının diseksiyonu.
- Diseksiyonu yapılmış larvaların stabilite için bir jel kübe aktarılması.
- Floresan mikroskopi kullanılarak in vivo görüntüleme.
- Aksonlar içindeki vezikül transportunun takibi.
Ana Sonuçlar
- Canlı larvalarda aksonal transportun başarılı şekilde görselleştirilmesi.
- GFP etiketli veziküllerin hareketinin gösterilmesi.
- Sinaptik vezikül transportu dinamiklerine dair içgörüler.
- Mevcut yöntemlerle yapılan karşılaştırma, bu yaklaşımın avantajlarını ortaya koymaktadır.
Sonuçlar
- Bu protokol, aksonal transportun incelenmesi için değerli bir araç sunmaktadır.
- Canlı görüntüleme, nöronal fonksiyonlar hakkında kritik bilgiler sağlamaktadır.
- Bu yöntem, çeşitli nörolojik durumların araştırılmasına uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama Uygunluğu
Vezikül taşınmasındaki kusurların Alzheimer, Huntington ve ALS ile mekanistik olarak bağlantılı olması nedeniyle, aksonal taşıma dinamiklerini anlamak nörodejeneratif hastalık hedeflerindeki risklerin azaltılması açısından kritik öneme sahiptir. Bu Drosophila larva akson modeli, sinaptik vezikül hareketinin gerçek zamanlı olarak görüntülenmesine olanak tanıyarak, erken hedef doğrulaması ve mekanistik içgörü için öngörülebilir ve hastalıkla ilgili bir sistem sunar. Çift yönlü vezikül akışını ve taşıma hızlarını nicelleştiren bu yöntem, aksonal bütünlüğe odaklanan preklinik programlarda karar verme süreçlerini destekler.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Canlı aksonlarda GFP etiketli APP veya sinaptotagmin vezikül transportunu görselleştirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Genetik olarak işlenebilir bir sistemde vezikül dinamiklerinin doğrudan gözlemi yoluyla fonksiyonel hedef doğrulamasını sağlar.
- Öngörücü Değer: Hastalık modellerinde transport kusurlarını nöronal disfonksiyonla ilişkilendirerek mekanistik risk azaltmayı destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Fizyolojik koşullar altında temel vezikül hareketliliğini belirleyerek, bileşik taramaları için valide edilmiş aksonal sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Analiz standardizasyonu için vezikül hareketliliğine dair kantitatif ve tekrarlanabilir çıktılar (örneğin, 1 µm/s çift yönlü akış) sağlar.
- Stratejik Değer: Bileşiklerin aksonal transport üzerindeki etkilerini değerlendirmek için ölçeklenebilir ve platformla uyumlu görüntüleme iş akışlarına olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: İnsan nörodejeneratif durumlarında gözlemlenen transport kusurlarını modelleyerek hastalıkla ilgili sistemlerle uyum sağlar.
- Operasyonel Değer: Bozulmamış larval sinirlerdeki vezikül transportunun canlı görüntülemesi aracılığıyla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar süreklilik sağlar.
- Risk Azaltma: Aday modülatörlerin transportu iyileştirme veya kötüleştirme düzeylerini nicelleştirerek ilerleme kararlarına veri sağlar.
Boru Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Bu yöntem, keşiften preklinik aşamaya kadar olan sürekliliğe uygun olup; erken keşif aşamasındaki hipotez testlerini, tarama aşamasındaki analiz hazırlıklarını ve preklinik aşamalardaki mekanistik doğrulamaları desteklemektedir.
- Keşif Biyolojisi: Genetik veya farmakolojik pertürbasyonlara yanıt olarak vezikül transportunu görselleştirerek yolak açıklığa kavuşturulmasını ve biyolojik risklerin azaltılmasını destekler.
- Tarama: Tutarlı vezikül hareketliliği metrikleri sağlayan standartlaştırılmış diseksiyon, boyama ve görüntüleme protokolleri aracılığıyla assay hazırlığına olanak tanır.
- Analizler: Deneysel koşullar arasında karşılaştırma yapmaya izin veren kantitatif bağımlı değişken ölçümleri (hız, yönelim, akış) üretir.
- Translasyonel Araştırma: İnsan nörolojik hastalıklarıyla ilgili aksonal transport kusurlarını modelleyerek preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Birden fazla hedef sınıfında aksonal bütünlüğün boylamsal çalışmaları için yeniden kullanılabilir bir görüntüleme platformu oluşturur.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Sinaptik vezikül dinamiklerinin doğrudan görselleştirilmesi yoluyla hedef doğrulamada öngörüsel güven.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış diseksiyon tamponu koşulları ve görüntüleme parametreleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik.
- Stratejik Değer: Aksonal taşıma hipotezlerindeki mekanistik belirsizlikleri azaltarak iyileştirilmiş go/no-go (devam/durdur) kararları.
- Portföy Etkisi: Hastalıkla ilgili modellerde taşıma kurtarma etkinliğine dayalı, riske göre ayarlanmış hedef önceliklendirme.
Uygulama Hususları
- Drosophila kullanımı, mikrodissection ve floresan mikroskobisi konularında uzmanlık gerektirir.
- 100x objektifli ters mikroskoba, çift görüntüleme sistemine ve GFP ile diğer floroforlar için uygun filtre setlerine bağımlıdır.
- Dissection tamponunun, larval evrelemenin ve çevresel kontrollerin (nemlendirilmiş oda, sıcaklık) standardize edilmesini gerektirir.
- Adaptasyon değerlendirmeleri, nöronal GAL4 sürücüleri aracılığıyla farklı GFP etiketli kargoların (örneğin mitokondriler, lizozomlar) eksprese edilmesini içerir.
- Pratik kısıtlamalar arasında larval hazırlık süresi ve dissection sonrası güçlü vezikül transportu için mevcut olan 2–3 saatlik zaman penceresi yer alır.
