Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Dünyada her 15 saniyede bir çocuk sıtma nedeniyle hayatını kaybediyor; burada, James laboratuvarında, sıtma parazitini taşıyamayan Fransız sivrisinekleri üretmeye çalışıyoruz. Benim adım TIUs. California Üniversitesi Irvine'de, Moleküler Biyoloji ve Biyokimya Bölümü'nde, Anthony James'in laboratuvarındayım.

Bugün size transgenik ve transgenik olmayan sivrisineklerin nasıl üretileceğini göstereceğim. Bunu, sıtma sivrisineklerini refrakter hale getirerek sıtma parazitini taşıyamayacakları şekilde düzenlemek için yapıyoruz. Şimdi, sivrisineklerin yumurtalarını bırakacakları izotonik tampon çözelti içeren bir tüp hazırladım.

Sivrisinekleri çekip bir flakona koymak için bu aspiratörü kullanacağım. Bu flakon daha sonra 30 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre girecek ve burada bir kap içerisinde yaklaşık bir saat bekletilecek. Şimdi mikroenjeksiyon iğnelerini çıkaracağız.

Bunlar kuvars malzemeden yapılmış iğnelerdir ve çok ince bir uç kullanmamız gerekmektedir. Bu nedenle, bu iğne çekicilere ihtiyaç duyarız. Suter Instruments marka bir iğne çekici ve yine Suter Instruments marka iğneler kullanmaktayız.

Şimdi sivrisinekleri çıkarıyorum ve bu yumurtaları, embriyoları enjeksiyon süresi boyunca nemli tutmak için izotonik tamponla ıslatılmış bir filtre kağıdının bulunduğu Petri kabına yerleştireceğim. Filtre kağıdı üzerindeki su miktarı kritiktir. Yumurtaların yüzmesini veya kağıdın kurumasını istemezsiniz.

Şimdi embriyoyu yumurta kağıdından, izotonik tampon çözelti içinde bekletilmiş başka bir 3 mm Whatman kağıdına aktaracağım. Mikroenjeksiyon için hizalamadan önce koriyonu uzaklaştırmak amacıyla bunu yapıyorum. Şimdi yumurtaların üzerindeki bu gümüşi yüzey olan koriyonu uzaklaştıracağım.

Bunu, fırçamla onları süpürerek yapıyorum. Böylece burada, üzerinde korionun hala bulunduğu ve gümüşümsü parlak bir kısmı olan bir embriyomuz var. Alttaki nerede?

Corian'ı çıkarmayı başardım; üstteki parça muhtemelen bir bant üzerinde kayacakken, alttaki parça yapışacaktır. Düzgün olmayan bir kenar yaptığınızda önemli olan budur. Şimdi embriyoları hizalıyorum.

Embriyolar ön uçta daha kalın veya büyüktür ve ben bu kısmı sağa gelecek şekilde yerleştiriyorum. Sol tarafta ise daha ince olan ve embriyoları enjekte edeceğim arka uç bulunmaktadır. Pozisyonlarını korumalarına yardımcı olmaları için onları birbirine destek olacak şekilde yerleştirmeye çalışıyorum.

Genellikle bir sırada yaklaşık 10 tane yapıyorum. Şimdi bir sıram, yani embriyolarım var ve bunları bir lamеle aktaracağım. Lamel üzerine.

Yapışmalarını sağlamak için peruk bandı yerleştirdim. Bunu tamamladığımda, embriyoların bulunduğu filtre kağıdını başka bir filtre kağıdıyla kurulayacağım, embriyoları lam üzerine yerleştireceğim ve yağı uygulamadan önce 30 saniye boyunca kurumaya bırakacağım. Şu anda embriyoları hizaladık ve yağ altında tuttuk.

Mikroskop tablasında, mikrop deseninin bu özel ucunu kullanarak gıda boyasıyla karıştırılmış DNA'yı enjekte edeceğiz ve bunu port iğnelerine enjekte edeceğiz. Şu an iğneyi doldurduk ve mikro enjektöre geri yerleştirdik. Artık mikro enjeksiyonları yapmaya hazırız.

Şimdi, odağı görebilmek için iğneyi keskinleştirmek üzere hareket ettiriyorum. Bu işlem tamamlandığında, ağırlık iğnesini hareket ettiriyorum, embriyoları getiriyorum ve onları da odaklıyorum. Bu işlem bittiğinde, iğneyi uygun konuma getirene kadar tekrar hareket ettiriyorum ve embriyolarıma geçiyorum.

İğne yağa girdiğinde görüntü bulanıklaşır ve yeniden ayarlama yapmanız gerekir. İşte tam olarak budur. Tam olarak, shark tick.

Ve şimdi enjeksiyonları yapmaya hazırım. İğneyle embriyoya dokunduğumu görebilirsiniz; bunu yaparak uçtaki damlacığı serbest bıraktım ve embriyoya enjekte edilecek küçük bir damlacığın çıktığını görebilirsiniz. Şimdi burada enjekte edin ve tekrar geri çekin.

Ve her embriyo arasında, iğnenin ucuna küçük bir damlacığın geldiğini her seferinde kontrol ediyorum. Ve gördüğünüz gibi, mükemmel konuma gelmek için her embriyo için yeniden ayarlama yapmam gerekiyor. Şimdi bu sızdırıyordu.

Gördüğünüz üzere, yağ içindeki ikinci enjeksiyonumu yaptığımda kabarcık çok büyüyor ve mikro enjektörün basıncını yeniden ayarlamam gerekiyor. Artık mikro enjeksiyon işlemleri tamamlandığına göre, embriyoları mikroskoptan izotonik tampon ile doldurduğumuz Petri kabına taşıyacağız. Lam üzerindeki yağı sileceğim ve lamı küçük bir parça halinde kesip Petri kabına yerleştireceğim.

Şimdi bunları gün sonuna kadar oda sıcaklığında burada bırakacağız. Ardından onları insektoryuma taşıyacağız. Bugün size, geçici dönüştürülmüş sivrisinekler elde etmek için nasıl antrifaz enjeksiyonu yapılacağını gösterdim.

Ve şimdi sadece larvaların çıkmasını, tüm larvaların çıkmasını bekleyeceğiz. Onları yetişkinliğe kadar büyüteceğiz ve ardından çiftleşecekler. Ondan sonra, refaktör olup olmadıklarına dair bir tarama başlatabilmemiz için üç haftamız olacak.