Name: Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-07-04T00:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Öğrenin, Anopheles stephensi embriyolarına mikroenjeksiyon yaparak sıtma dirençli sivrisinekler nasıl oluşturulur. Bu yöntem, genetik modifikasyon ve vektör biyolojisi araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Mikroenjeksiyon, önceden hazırlanması: <ol><li> Kan linki sivrisinek: Pazartesi - Çarşamba önceki Cuma günü linki kadın enjeksiyon için. Aynı hafta Pazartesi, Perşembe ve Cuma günleri, yem kadın enjekte etmek. </li><li> Kuvars iğne programı 2 ve izotonik tampon (Malzeme) kullanarak hazırlayın. </li><li> Embriyolar &quot;tüp Döşeme&quot; düzenli Drosophila kültür flakon. Kapsayan filtre kağıdı ıslak bir disk ile alt Islak pamuk. </li><li> Bir ucunda çift taraflı bant yapıştırma, plastik kapak kayma hazırlayın. Trim kaset kapağı için, kapak kayma kenarında biter, böylece kayma. </li><li> Kuruma petrol hazırlayın. </li><li> Petri kabı, kuluçka için embriyo transferine izotonik tamponu ile hazırlayın. </li></ol> Zorla döşeme ayarlayın: <ol><li> Toplayın ve bir aspiratör ile 6-10 kan beslenen kadınlarda, pamuk ve izotonik tampon ıslak filtre kağıdı ile Drosophila kültür flakon aktarabilirsiniz . </li><li> Sivrisinek sonra karanlıkta insectery koşullar içine geri koyun ve 1 saat ve 15 dakika için yumurtalarını bırakmak için izin. </li><li> Yetişkin kafes içine sinek ve embriyolar ile filtre kağıdı diski çıkarın. </li><li> Yumurta kadar satır için, diseksiyon kapsamında bunu. (Sable, No 0000) ince bir fırça ile yumurta demet toplayın ve hazırlanmış bir kare izotonik tampon ile ıslatılmış 3MM whatman kağıt transfer. Tüm zamanların ıslak kağıt tutun. Yumurta kurutulmuş almak izin vermeyin. Exochorion fırça ile kaldırın, daha iyi bant yumurta sopa yardımcı olur. </li><li> Ince forsepsle No 5 ya da ince bir fırça kullanarak, koyu gri embriyolar pick up ve izotonik tampon ile ıslak 3MM whatman kare doğrultusunda düzenlemek. 20-30 embriyolardan Hattı. Enjeksiyon arka kutupta yer gibi tüm embriyolar aynı yönde olmalıdır. Embriyoların ön arka biraz daha geniş. Sonra 3MM whatman kağıt şeritleri kullanarak, yumurta, yumurta hattının her iki tarafında sert basarak, yumurta dokunmadan dizilmiş filtre kurulayın. </li><li> Yumurta transfer etmek için, çift taraflı bant (Tıp) içeren slayt, invert ve yumurta karşı hafifçe basın. Yumurta arka ucunda çift taraflı bant kenarına çok yakın olması. Yapışmaz çok ıslak ise kağıt ıslaklık, bunun için kritik öneme sahiptir. 5-10 saniyelik embriyoların kuruma, ancak kuruma süresi mikroenjeksiyon oda nemli ve sıcaklık bağlıdır. </li><li> Biraz çok ve embriyolar yumurtadan olmaz: Kuruma yumurta için çok önemlidir. Kuruma DNA olmadan embriyo girecek değildir. </li><li> Kurutulmuş embriyolar daha fazla kuruma önlemek için Halokarbon yağ ile kaplayın. </li></ol> Embriyoların Mikroenjeksiyon: En önemli özelliği iyi bir enjeksiyon (Not bakınız) iğne kalitesidir. <ol><li> Microloader (Eppendorf # 5242 956,003) kullanarak enjekte edilecek DNA çözümü ile bir iğne doldurun. Çok az enjeksiyon soliution, 1 - 2 ml gereklidir. </li><li> Iğne, enjeksiyon süresi ve basınç kontrolleri Eppendorf Transjector, yanı sıra backpressure bağlayın. Mikroenjeksiyon x 10 büyütme ve mikromanipülatör (Leica) hareketli bir sahne (Leica) bir mikroskop kullanılarak yapılır. Gerekirse, yükseltilmiş bir mikroskop aşamada 4-5 mikroskop lamı istifleme tarafından hazırlanmış olabilir. Yükseltilmiş sahneye taşıyan embriyolar kapak kayma yerleştirin. Embriyolar 150 ° açıyla enjekte edilir; penetrasyon arka kutupta olmalıdır. Enjeksiyon için iğne sabit tutmak ve mikroskop aşamasına taşımak. Iğne ucu kapalı ve genellikle ilk enjeksiyondan tatili. Ben her zaman, her enjeksiyon arasında DNA&#39;nın küçük bir damla petrol sınırdışı için gerekli olan basınç çalışır. </li><li> Ben 0.2 enjeksiyon süresi 0.9 saniye ve 1000 hPa iğne yeni. Kadar küçük bir damlacık yağın içine iğne çıkan basınç ve zaman değişir. Backpressure yaklaşık 100 ayarlanması gerekir. Iğne ucu aşınmış alır gibi, enjeksiyon basıncı, enjeksiyon hacmi düşük tutmak için (yaklaşık 300 hPa) azaltılmalıdır. Bundan sonra, iğne ucu çok büyük ve embriyoların çoğu öldürüyor. </li><li> Enjeksiyondan sonra, kağıt mendil ile petrol çıkarmak ve embriyo ve izotonik tampon Petri kabında yer slayt kapağı. Insectory yemekleri yerleştirin ve embriyoların yumurtadan kadar orada bırakın. Bunlar 2-6 gün sonra yumurtadan çıkar başlar. Tutam toprak balık yemi ile distile su larva transferi. </li></ol> Notlar Enjeksiyon için DNA: enjeksiyon için Plazmid DNA çözüm EndoFree plazmid kiti kullanılarak izole edilmiştir.Plazmid Construct ve doğru konsantrasyon birlikte Yardımcısı plazmid karışımı, isopropanol hızlandırdı. Pelet enjeksiyon tampon resuspending önce% 70 etanol ile yıkandı. Enjeksiyon, önce Millex-GV sütun kullanarak temiz DNA. Izotonic tampon: <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 1.68 M NaCl - 88.3 ml 1.68 M NaCl - 2.9 m 1 M -10.7 ml HEPES 1.12 M CaCl 2 - 2,2 ml dH 2 O - 896 ml </td><td> VEYA </td><td> 5 M NaCl - 29,67 ml 1 M KCI - 4.87 ml 1 M HEPES - 10.7 ml 1.12 M CaCl 2 - 2,2 ml dH 2 O - 952,56 ml </td></tr></tbody></table> PH 7.2 &#39;ye ayarlayın

<table><tbody><tr><td>Enjeksiyon kuvars iğneleri</td><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td></td><td>D.Ç.- 1.0 mm, İ.Ç.-0.70, 10 cm uzunluk; kılcal boruların bir mikropipet çekicisi ile yaklaşık 100-300 mm'lik bir gövde üzerinde 3-8 µm'lik ince bir uca çekilmesiyle hazırlanır.</td></tr><tr><td>Kuvars çekici</td><td>Araç</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td>Kurulum: Heat-275, Fil-3, Vel-38, Del-250, Pull-141</td></tr><tr><td>EndoFree plazmit kiti</td><td></td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İzopropanol</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Millex-GV kolonu</td><td></td><td></td><td>SLGV RO4 NL</td><td>DNA temizliği için</td></tr><tr><td>Konstrükt DNA</td><td></td><td></td><td></td><td>0.5 mg/ml</td></tr><tr><td>Yardımcı plazmit</td><td></td><td></td><td></td><td>0.3 mg/ml</td></tr><tr><td>Enjeksiyon solüsyonu</td><td>Tampon</td><td></td><td></td><td>1x solüsyon: 5mM KCl, 0.1mM sodyum fosfat, pH 6.8</td></tr><tr><td>İzotonik tampon</td><td></td><td></td><td></td><td>reçete için protokol bölümüne bakınız</td></tr><tr><td>Desikasyon yağı</td><td></td><td></td><td></td><td>Halocarbon oil 700:Halocarbon oil 27(1:1). İyice karıştırın. Mikroenjeksiyondan önce hazırlayın.</td></tr><tr><td>Kan</td><td></td><td></td><td></td><td>sivrisinekleri beslemek için</td></tr><tr><td>Anopheles stephensi</td><td>Hayvan</td><td></td><td></td><td>Sivrisinekler, erkek ve dişi.</td></tr><tr><td>Drosophila kültür tüpü</td><td></td><td></td><td></td><td>yumurtlama için</td></tr><tr><td>Petri kapları</td><td></td><td></td><td></td><td>izotonik tampon ile, embriyo çıkışı için</td></tr><tr><td>İnce resim fırçası</td><td></td><td></td><td></td><td>Sable # 0000</td></tr><tr><td>3MM Whatman kağıdı</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pens #5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>çift taraflı bant</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikro yükleyici</td><td></td><td>Eppendorf</td><td>5242 956.003</td><td></td></tr><tr><td>Transjektör</td><td></td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td></td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>hareketli tabla ve mikromanipülatör ile, 10x büyütmeye ayarlı</td></tr></tbody></table>

bir, enjeksiyon. stephensi embriyolar sıtma dayanıklı sivrisinekler oluşturun

Injection of An. stephensi Embryos to Generate Malaria-resistant Mosquitoes

Sivrisinek genomların ekzojen genlerin giriş, özel ilgi türü için hazırlanmış mikroenjeksiyon teknikleri gerektirir. Bu video protokol dönüştürülmüş sivrisineklerin nesil için Anofel stephensi embriyolar DNA yapıları microinject James laboratuvar tarafından kullanılan bir yöntem gösteriyor. Teknikleri, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması, toplanması ve hazırlanması embriyolar ve mikroenjeksiyon işlemi için gösterilmiştir.

Anofel stephensi sivrisinekler, sıtma yaşayan Hindistan ve Asya&#39;da vektörleri. Bu video bu türün sivrisinek sıtma karşı direnç kazandırırlar transgenlerin microinjections gerçekleştirmek için teknik göstermektedir. Bu video gösterdi metodoloji diğer sivrisinek türlerinin mikroenjeksiyon teknikleri uygulanabilir.

Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Ekzojen genlerin sivrisinek genomlarına aktarılması, ilgili türe özgü olarak uyarlanmış mikroenjeksiyon teknikleri gerektirir. Bu ...

Dünyada her 15 saniyede bir çocuk sıtma nedeniyle hayatını kaybediyor; burada, James laboratuvarında, sıtma parazitini taşıyamayan Fransız sivrisinekleri üretmeye çalışıyoruz. Benim adım TIUs. California Üniversitesi Irvine'de, Moleküler Biyoloji ve Biyokimya Bölümü'nde, Anthony James'in laboratuvarındayım.Bugün size transgenik ve transgenik olmayan sivrisineklerin nasıl üretileceğini göstereceğim. Bunu, sıtma sivrisineklerini refrakter hale getirerek sıtma parazitini taşıyamayacakları şekilde düzenlemek için yapıyoruz. Şimdi, sivrisineklerin yumurtalarını bırakacakları izotonik tampon çözelti içeren bir tüp hazırladım.Sivrisinekleri çekip bir flakona koymak için bu aspiratörü kullanacağım. Bu flakon daha sonra 30 °C'ye ayarlanmış bir inkübatöre girecek ve burada bir kap içerisinde yaklaşık bir saat bekletilecek. Şimdi mikroenjeksiyon iğnelerini çıkaracağız.Bunlar kuvars malzemeden yapılmış iğnelerdir ve çok ince bir uç kullanmamız gerekmektedir. Bu nedenle, bu iğne çekicilere ihtiyaç duyarız. Suter Instruments marka bir iğne çekici ve yine Suter Instruments marka iğneler kullanmaktayız.Şimdi sivrisinekleri çıkarıyorum ve bu yumurtaları, embriyoları enjeksiyon süresi boyunca nemli

injection-an-stephensi-embryos-to-generate-malaria-resistant

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Ters genetik yaklaşımlar sivrisinek vektör patojenler için hangi genlerin altta ya direncini belirlemek için son derece yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Bu video protokolü James laboratuar tarafından dsRNA kadın dang virüs limanı A. aegypti sivrisinek, içine enjekte etmek için kullanılan bir yöntem gösteriyor. , Enjeksiyon iğneleri kalibre, enjeksiyon kurulum manipüle ve toraks içine enjekte dsRNA tekniği gösterilmiştir.

Bayan A. aegypti Sivrisinek içine dsRNA enjeksiyon

Bu video, Nijole Jasinskiene Dang humması için vektörler transgenik Aedes aegypti sivrisinek, üretmek için kullanılan yöntem gösteriyor. Doğru, mikroenjeksiyon iğneler hazırlanması embriyolar dessicating ve mikroenjeksiyon teknikleri gösterilmektedir.

Transgenik Sivrisinekler Edinme A. aegypti Embriyolar Mikroenjeksiyon

Bu röportajda, George Dimopoulos sivrisinekler tarafından Plasmodium falciparum ve dang virüs enfeksiyonları ile mücadele için kullanılan fizyolojik mekanizmaları üzerinde odaklanmaktadır. Açıklama ne kadar önemli refrakter genler için verilen, bu genlerin, vektör patojenlere karşı direnç göstermesini sağlayan sivrisinek tanımlanır ve bu bilgiyi nasıl sıtma paraziti veya dang virüs gerçekleştiremiyor transgenik sivrisinek oluşturmak için kullanılan olabilir.

Bina daha iyi Sivrisinek: Sıtma ve Dang Ateşi Direnç A. gambiae ve A. aegypti Sivrisinekler etkinleştirilmesi Genler belirlenmesi

Kemirgen sıtma parazitleri Genetik haçlar sivrisineklerin genetik olarak iki farklı parazitler besleyerek yapılmaktadır. Rekombinant döl sivrisinek enfekte farelerde ısırık izin sonra fare kandan klonlanmış. Bu video genetik haçlar üretmek nasıl...

Kemirgen Sıtma Parazitler Genetik Haç üretimi için protokol

Bu videoda, mikroenjeksiyon yoluyla Anopheles embriyosunda phiC31 aracılı bölgeye özgü transgen entegrasyonunu gösteriyoruz. Bu yöntem, istenen genlerin araştırma ve endüstriyel uygulamalar için bir konak sisteme sokulmasına yardımcı olur.

phiC31-İntegraz Aracılı Bölgeye Yönelik Transgen Entegrasyonu: Bir Anofel Vektörüne Bölgeye Özgü Transgen Entegrasyonu için Bir Mikroenjeksiyon Tekniği

Bu videoda, embriyo mikroenjeksiyon tekniği ile Anopheles gambiae sivrisineğinin embriyosuna gen sürücü yapısının verilmesini gösteriyoruz. Bu prosedür, homolog rekombinasyon yoluyla iletilen DNA yapısının, dönüştürülmüş sivrisinek popülasyonu oluşturmak için germ hattı hücrelerine entegrasyonuna izin verir.

Sivrisinek Embriyo Mikroenjeksiyonu: Germ Hattı Mutasyonları Oluşturmak için Anopheles Gambiae'nin Embriyo Sarısına Ekzojen DNA Verme Tekniği

CRISPR/Cas9, model olmayan organizmalarda gen fonksiyonunu karakterize etmek için giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu protokol, enjeksiyon karışımlarının hazırlanmasından sivrisinek embriyolarının elde ve enjektesine kadar Culex pipiens'innakavt hatlarının nasıl oluşturulacağını ve enjekte edilen sivrisineklerin ve bunların istenen mutasyonlar için soylarının nasıl arka, çapraz ve taramadan geçeceğini açıklar.

CRISPR/Cas9 Kullanarak Boş Mutasyonlar Oluşturmak için Culex Sivrisineklerinin Embriyolarının Hazırlanması ve EnjekteSi

Protokol, φC31 sistemini kullanarak Anopheles sıtma sivrisineklerinin genomunda bölgeye yönelik değişikliklerin nasıl eldeılacağını açıklar. Açıklanan değişiklikler, attP taşıyan yerleştirme hatlarının genomunda transgenik kasetlerin hem entegrasyonunu hem de değişimini içerir.

Sıtma Anopheles Vektörlerinde SiteYe Yönelik φC31 Aracılı Entegrasyon ve Kaset Değişimi

Mikroenjeksiyon teknikleri, sivrisineklerin genomlarına eksojen genleri sokmak için gereklidir. Bu protokol, James laboratuvarı tarafından DNA yapılarını dönüştürülmüş sivrisinekler üretmek için Anopheles gambiae embriyolarına mikroenjeze etmek için kullanılan bir yöntemi açıklar.

Anopheles gambiae Embriyoları için Mikroenjeksiyon Yöntemi

Sıtma, enfekte sivrisinekler tarafından Plasmodium'un sporozoit aşamasının aşılanması yoluyla bulaşır. Transgenik Plazmodyum , sıtmanın biyolojisini daha iyi anlamamızı sağladı ve sıtma aşısı geliştirme çabalarına doğrudan katkıda bulundu. Burada, transgenik Plasmodium berghei sporozoitleri üretmek için aerodinamik bir metodolojiyi açıklıyoruz.

Genetiği Değiştirilmiş Plasmodium berghei Sporozoitlerinin Üretilmesi

Burada, CRISPR-Cas9 teknolojisini kullanarak sivrisinek A. aegypti'de embriyonik mikroenjeksiyon yoluyla genom düzenleme için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz.

Sarı Humma Sivrisineği Aedes aegypti'de CRISPR-Cas9 Kullanılarak Genom Düzenleme

Öğrenin, Anopheles stephensi embriyolarına mikroenjeksiyon yaparak sıtma dirençli sivrisinekler nasıl oluşturulur. Bu yöntem, genetik modifikasyon ve vektör biyolojisi araştırmalarında kullanılır.

Bir, Enjeksiyon. stephensi Embriyolar Sıtma dayanıklı Sivrisinekler oluşturun

Daha fazla video keşfet