Name: Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-24T18:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Öğrenin hücresel lizatlardan multiprotein komplekslerini BN-PAGE ile karakterize etme yöntemini. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerini koruyarak kompleks bileşenlerinin analizini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Michael Reth, Hermann Schägger ve Margarita Camacho-Carvajal bilimsel destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma, Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BIOS&#39;ları Bundesministerium für Bildung ve Forschung (BMBF) FORSYS tarafından finanse edilen ve Alman Federal ve Eyalet Hükümetleri Mükemmellik Girişimi (GSC-4, Spemann Enstitüsü tarafından desteklenen .)

<ol><li>Arnold, I., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+mitochondrial+F1F0-ATP+synthase+exists+as+a+dimer%3A+identification+of+three+dimer-specific+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Yeast mitochondrial F1F0-ATP synthase exists as a dimer: identification of three dimer-specific subunits.</a> EMBO J. 17 (24), 7170-7178 (1998).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol. Cell. Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Heiss, K., Junkes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subproteomic+analysis+of+metal-interacting+proteins+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Subproteomic analysis of metal-interacting proteins in human B cells.</a> Proteomics. 5 (14), 3614-3622 (2005).</li>
<li>Sali, A., Glaeser, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+words+to+literature+in+structural+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422, 216-225 (2003).</li>
<li>Schägger, H., Cramer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schägger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J Immunol Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li>
<li>Schamel, W. W., Arechaga, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexistence+of+multivalent+and+monovalent+TCRs+explains+high+sensitivity+and+wide+range+of+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Coexistence of multivalent and monovalent TCRs explains high sensitivity and wide range of response.</a> J. Exp. Med. 202, 493-503 (2005).</li>
<li>Schamel, W. W., Reth, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monomeric+and+oligomeric+complexes+of+the+B+cell+antigen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Monomeric and oligomeric complexes of the B cell antigen receptor.</a> Immunity. 13 (1), 5-14 (2000).</li>
<li>Swamy, M., Minguet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+native+antibody-based+mobility-shift+technique+%28NAMOS-assay%29+to+determine+the+stoichiometry+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A native antibody-based mobility-shift technique (NAMOS-assay) to determine the stoichiometry of multiprotein complexes.</a> J Immunol Methods. 324 (1-2), 74-83 (2007).</li>
<li>Swamy, M., Siegers, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+the+identification+and+analysis+of+multiprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for the identification and analysis of multiprotein complexes.</a> Sci STKE. 2006 (345), 4-4 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8, 3974-3990 (2008).</li>
</ol>

Bu çalışmada, biz MPCs BN-PAGE ile analizi açıklanmaktadır. 2D bir yaklaşım doğal koşullar altında ilk ayrı MPCs kullanılır ve daha sonra ikinci bir boyut SDS-PAGE ile onları kendi içerisinde münferit bileşenlerine ait bölümlere ayrılması için. Örnekleri hücre lizatları hazırlanmıştır. Birçok MPCs çözünürleştirme için, uygun bir deterjan protein komplekslerinin yapısını korur ihtiyaç vardır. Burada,% 0.1 Triton X-100 kullanın. Ancak, en iyi deterjan ve uygun konsantrasyonda her MPC için deneysel olarak belirlenmelidir. Durumunda Triton X-100, örneğin, düşük deterjan konsantrasyonları F 1 dimerik formu kimlik izin verdiği rapor edilmiştir F 0-ATPaz kompleksi (Arnold, Pfeiffer ve ark 1998). Yüksek Triton X-100 konsantrasyonları Ancak, dimer ayrışma ve monomerik F 1 F 0-ATPaz kompleksi karşılık gelen bir artış yol. Yüksek konsantrasyon veya başka bir deterjan kullanımı digitonin sonuçları denilen oysa bizim eski çalışmalar doğrultusunda, düşük konsantrasyonlarda Brij 96 ile ekstrakte multivalent T-hücre reseptör kompleksi (TCR) korunmuş olduğunu gösterir edildi monomerik TCR çıkarımı (Schamel, Arechaga ve ark 2005). Yaygın olarak kullanılan deterjan test edilebilir digitonin (% 0.5 ila% 1), Triton X-100 (% 0.1 ila% 0,5), Brij 96 (% 0.1 ila% 0,5), ya da dodecylmaltoside (% 0.1 ila% 0,5) içermektedir. Bu reaktifler, noniyonik deterjan, MPC istikrar için en iyi olma eğilimindedir. SDS ve diğer güçlü deterjanlar ile temas (Camacho Carvajal, Wollscheid ve ark 2004) kaçınılması gerektiğini farkında olun. Diyaliz lizatları BN-jel MPC ayırma (Camacho-Carvajal, Wollscheid ve ark 2004) ulaşmak için gerekli; (Heiss, Junkes ve ark 2005). Bu, tuz konsantrasyonu veya düşük molekül ağırlıklı kirliliklerin kaldırılması ayar yüksek çözünürlük için çok önemli olduğunu görünüyor. Immunopurified ve daha sonra antikor yıkandı, membran hazırlıklar ve MPCs, BN-PAGE için uygundur (Swamy, Siegers ve ark 2006) dikkat çekicidir. Her iki durumda da, örnekler membran lizis veya elüsyon BN-lizis tamponu yürütülen ise, BN-PAGE ayrılması için diyalize zorunda değilsiniz. BN-PAGE ile protein ayırma için, boya Coomassie mavi unspecifically proteinlerine bağlanır ve onları olumsuz ücretleri kapsayan ihtiyaç vardır. Böylece, Coomassie mavi nötr pH (Schägger ve von Jagow 1991) katot doğru proteinlerin elektroforetik mobilite sağlar; (Schägger, Cramer ve ark 1994). Ayrıca, Coomassie mavi yığın jel elektroforez sırasında protein agregasyonunu önler. BN-PAGE, Coomassie G250 Coomassie mavi R250 veya kolloidal Coomassie mavi yerine kullanılmalıdır. BN-jel çalıştırmadan önce, jel yüzde PPK faiz beklenen boyutuna uygun olduğundan emin olmak için gereklidir. BN-jeller Prekast farklı gradyanlar ve uygun tamponlar Invitrogen (NativePAGE Novex Bis-Tris Jel Sistemi) temin edebilirsiniz. Ancak, BN-jeller de bir persistaltic pompa ile birlikte bir degrade mikser kullanılarak hazırlanmış olabilir. Sağlam bir degrade garanti etmek için, sıvı dökme ve kabarcıkları kaçınmak olmalıdır sırasında sürekli akmalıdır. Aşırı yükleme elektroforez işlemi sırasında protein yağış yol açabilir, çünkü jel üzerine farklı numune dilüsyonları yükleme tavsiye ederiz. Buna ek olarak, BN-jeller 4 çalıştırmak olmalıdır ° C proteini bozulmasını önlemek için ve MPCs sağlam tutmak için. MPCs BN-PAGE, görselleştirme Coomassie parlak mavi boyama, gümüş boyama veya immunoblotting elde edilebilir sonra. Coomassie veya gümüş boyama ile görüntülendi protein bantları kütle spektrometresi (Camacho Carvajal, Wollscheid ve ark 2004) tarafından daha fazla analiz için uygundur. Immunoblotting durumunda, ilgi MPCs için en iyi transferi koşulları deneysel olarak belirlenmelidir. Coomassie mavi BN-jel blot sırasında da transfer olduğunu farkında olun. Bu nedenle, membran mavi bir renk uygulamayın ise jel, başarılı transferinden sonra renksiz olacak. Ayrıca, SDS-PAGE sonra tespiti için çalışan her primer antikor, BN-PAGE üzerine immunoblotting için geçerli olduğunu söylemek çok önemlidir. Bu onların epitop proteinlerin doğal yapısındaki gizli olduğu için antikorlar ilgi MPC görmezsek bu gerçekleşebilir. Bu sorunu aşmak için, BN-jel içinde transfer etmek için önce kısa bir süre jel 1x SDS numune tamponu kaynatarak proteinler denatüre mümkündür. Bizim örneğimizde, protein bantları tespit doğrudan BN-jel tabi değildi. Bunun yerine, daha ikinci bir dimensi BN-PAGE ayrılmış lizat bölünmüşSDS-PAGE. Monomerik proteinler SDS-jel ikinci boyutu, ikinci boyut (Camacho Carvajal, Wollscheid ve ark, 2004) ilk ve doğrusal jel gradient jel nedeniyle bir hiperbolik çapraz içinde göç ederler. Bu hiperbolik çapraz altında lokalize olduğundan bu MPCs kolay kimlik sağlar. İkinci boyut SDS-PAGE bir dikey çizgi biri ayrı bir MPC Alt Bileşenleri ayrılır. Birkaç dinstinct MPCs bileşenleri Bileşenleri MPC büyüklüğüne göre yatay bir çizgi üzerinde tespit edilebilir. Ancak, tek bir dikey çizgi görünen birçok protein noktalar da BN-SAYFA aynı pozisyonda göç eden ayrı bir kompleksleri parçası olabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. Aynı MPC mevcut olduğunu son kanıtı, antikor bazlı bir jel vardiya yöntemi ile elde edilebilir. Bu testte, hücresel lizat biri BN-SAYFA önce belirlenen noktalar tarafından temsil edilen bir protein karşı bir antikor ile inkübe edilir. Bu sonuçlar ilk boyut daha yüksek bir moleküler kütlesi doğru bu protein içeren tüm MPCs bir kayma. Bu MPCs bir parçası olan diğer proteinleri bu karmaşık özel bir değişime ve bu nedenle ikinci boyut SDS-jel tanımlamak daha kolay olacaktır. Sadece MPCs bileşimi BN-PAGE ile analiz aynı zamanda kendi stokiyometri belirlenmesi mümkündür (Schamel ve Reth 2000) olabilir; (Schamel 2001), (Swamy, Minguet ve ark 2007). Bu amaçla, bir NAMOS assay (yerli antikor bazlı hareketlilik kayma yöntemi) yapılabilir. Antikor bazlı jel kayma yöntemi olduğu gibi, hücresel lizatları altbirim-spesifik monoklonal antikorlar ile inkübe edilir. Bu MPCs stokiyometri vardiya ölçüde çıkarım izin BN-jel elektroforetik immunoshifts indüksiyonu yol açar Conlusion, BN-PAGE boyutu, kompozisyonu, gibi göreceli bolluk MPCs tanımlanması ve belirlenmesi için uygundur. NAMOS tahlil olarak yapılır, o da belirli bir MPC stokiyometri belirlemek için imkanı sunar. Genel uygulanabilirliği göz önüne alındığında, bu tekniğin MPCs karakterizasyonu (Dekker, Müller ve ark 1996) için çok yararlı bir araç, (2008 Wittig ve Schagger) (Wagner, Rehling ve ark 2009); (Wittig ve Schägger 2009) .

hücresel lizatları multiprotein kompleksleri analizi mavi native poliakrilamid jel elektroforez (bn-page)

Blue Native Polyacrylamide Gel Electrophoresis (BN-PAGE) for Analysis of Multiprotein Complexes from Cellular Lysates

En proteinleri diğer proteinler ile fonksiyonel veya düzenleyici kompleksleri (Sali, Glaeser ve ark 2003) bulunabilir Multiprotein kompleksleri (MPCs), hücre sinyal çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, protein-protein etkileşim ağlarının çalışma, protein düzenleme fonksiyonu ve entegre bir anlayış kazanmak için MPCs detaylı karakterizasyonu gerektirir. Tanımlanması ve analizi için, MPCs yerli koşullar altında ayrılmalıdır. Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) MPCs analizi açıklanmaktadır. BN-PAGE jel filtrasyon veya sakkaroz yoğunluğu Ultrasantrifügasyon tarafından sunulan daha yüksek bir çözünürlüğe sahip bir doğal yapısındaki MPCs ayrılması sağlar ve MPC boyutu, kompozisyon ve göreceli bolluk (Schägger ve von Jagow 1991) belirlemek için bu nedenle yararlı bir tekniktir. (Schägger, Cramer ve ark 1994). Bu yöntemle, proteinler, hidrodinamik bir poliakrilamid matris boyutu ve şekli göre ayrılır. Burada, lizat diyaliz BN-PAGE bu biyolojik örnekler için geçerli hale getirmek için önemli bir adım olduğuna işaret ederek, toplam hücresel lizatları MPCs analiz göstermektedir. Birinci boyut, BN ve ikinci boyut SDS-PAGE bir kombinasyonunu kullanarak, BN-PAGE ile ayrılmış MPCs SDS-PAGE ile daha fazla bireysel bileşenlerinin içine alt edilebilir olduğunu göstermektedir. Jel ayrılması üzerine MPC bileşenleri Görselleştirme standart immunoblotting tarafından yapılır. PPK BN-PAGE ile analiz için bir örnek olarak, iyi karakterize ökaryotik 19S, 20S, ve 26S protozomları seçti.

Bu video, mavi yerli poliakrilamid jel elektroforezi (BN-PAGE) multiprotein kompleksler (MPCs) karakterizasyonu açıklar. Birinci boyut, diyaliz hücresel lizatları bireysel MPCs tanımlamak için BN-PAGE ile ayrılır. Ikinci bir boyut SDS-PAGE, faiz MPCs daha immün bileşenleri analiz alt gruba ayrılır.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Multiprotein kompleksleri (MPK'lar), çoğu proteinin diğer proteinlerle birlikte fonksiyonel veya düzenleyici kompleksler halinde bulunabilmesi nedeniyle hücre sinyalizasyonunda kritik bir rol oynar...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, SDS-PAGE'in aksine proteinlerin doğal koşullar altında ayrılmasına ve protein-protein etkileşimlerinin korunmasına olanak tanıyan mavi doğal poliakrilamid jel elektroforezi kullanarak, hücresel lizatlardan bir MultiPro kompleksini karakterize etmektir. Bu, ikinci bir adım olarak numuneyi mavi doğal PAGE ile ayrıştırmaya uygun hale getirmek için fazla tuzların uzaklaştırılması amacıyla hücresel lizatın diyaliz edilmesiyle gerçekleştirilir. Lizat, protein komplekslerini doğal koşullar altında boyutlarına ve şekillerine göre ayıran birinci boyut mavi doğal PAGE'e uygulanır.Ardından, ikinci bir boyut uygulanır. Kompleksleri bireysel bileşenlerine ayırmak için denatüre SDS-PAGE gerçekleştirilir. Proteinler, gümüş veya Coomassie boyama ya da western blotting ile görselleştirilebilir.Buradaki gösterimde ayrıştırılmış proteinler gümüş boyama ile tespit edilmiştir, ancak gerçek uygulamada western blotting kullanılacaktır. Merhaba, ben Almanya'daki Max Plank İmmünobiyoloji Enstitüsü'nün Moleküler İmmünoloji Bölümü'nde Wolfgang Sharmel'in laboratuvarından Brita Bloom. Merhaba, ben Dina Fiala.Ben de Sham Lab'danım. Bugün size hücresel lizatlardan MultiPro komplekslerinin analizi için bir prosedür göstereceğiz. Çok alt birimli membran reseptörlerinin kompozisyonunu incelemek için laboratuvarımızda bu prosedürü kullanıyoruz.Ancak, bu videoda örnek olarak tic proteazomunu kullanacağız. Öyleyse başlayalım. Bu prosedüre başlamadan önce, tüm tampon çözeltileri yazılı protokolde açıklandığı şekilde hazırlayın ve dört degrees Celsius'ta saklayın.10 milyon HEC 2 9 3 hücresini toplayın ve 4 °C'de, 350 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyerek çöktürün. Ardından, hücre peletlerini 1 mL buz gibi soğuk PBS ile yıkayın ve yıkanmış hücreleri çöktürmek için santrifüj kullanın. Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın, ardından yıkanmış hücre peletini 250 µL buz içerisinde yeniden süspande edin.Soğuk mavi, doğal lizis tamponu ekleyin ve süspansiyonu buz üzerinde 15 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, çözünmeyen materyalleri uzaklaştırmak için canlı hücreleri 4 °C'de 15 dakika boyunca 13.000 ×g'de santrifüjleyin. Bu sırada, bir pastör pipetinin ısıtılmış geniş çaplı ucunu kullanarak 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün kapağında bir delik açın.Ardından, tüpü dört santigrat dereceye kadar soğutmak için buza yerleştirin. Santrifüj işlemi tamamlandığında, lizatı diyaliz yoluyla tuz giderme işlemi yapılacak olan tüpe aktarın. Açık tüpün üzerine 10 kilodalton kesim limitli bir diyaliz membranı yerleştirin.Kapağı kapatın ve dışarı taşan fazla diyaliz membranını kesin. Ardından kapağın kenarını parafilm ile dikkatlice mühürleyin; mühürleme işlemi tamamlandıktan sonra tüpü ters çevirin ve 50 mililitrelik konik bir tüpün içine baş aşağı yerleştirin. Numuneyi mümkün olan en düşük hızda 10 saniye boyunca santrifüjleyin.Bir hücre kültürü santrifüjünde, 100 mikrolitre numune başına en az 10 mililitre blue native diyaliz tamponu kullanarak, soğuk blue native diyaliz tamponu ve manyetik karıştırıcı içeren 100 mililitrelik bir beher hazırlayın. Ardından, ters çevrilmiş tüpü cımbız yardımıyla konik tüpten çıkarın. Tüpün düz konuma getirilmesinden kaçının.Tüpü beher içerisinde ters duracak şekilde bantla sabitleyin ve kapağın altındaki delikte bulunan hava kabarcıklarını giderin. Eğik uçlu bir pastur pipeti kullanarak manyetik karıştırıcıyı çalıştırın ve örneği diyaliz için soğuk odada altı saat veya gece boyunca bekletin. Karıştırma işleminin diyaliz membranında hava kabarcıkları oluşturup oluşturmadığını kontrol etmek için örneği ara ara gözden geçirin.İnkübasyonun ardından,leleyle edilen hücre lizatını yeni ve soğutulmuş bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve jel gradyanı yüklemesine kadar buz üzerinde bekletin. Jel dökümü, bir gradyan karıştırıcı ile oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Gradyan karıştırıcıyı bir manyetik karıştırıcı üzerine yerleştirin ve esnek bir hortum parçasına bağlayın.Gradyan karıştırıcının kanalını valf kullanarak kapatın ve hortumu bir klemple sıkıştırın. Hortuma bağlı silindirin içine manyetik bir karıştırıcı yerleştirin. Ardından, esnek hortumu bir peristaltik pompaya geçirin ve ucuna bir şırınga iğnesi takın.Ardından iğneyi jel düzeneğinin üst kısmındaki iki cam plaka arasına yerleştirin. Birleşik hacimleri, ayırıcı jel hacmine eşit olacak şekilde %4 ve %15'lik ayırıcı jel çözeltileri hazırlayın. Hemen öncesinde PS ve TM ekleyin.Jel çözeltilerini gradyan karıştırıcının ilgili silindirlerine doldurun. Ardından cihazı açın ve valfi çevirin. İki jel rezervuarını birbirine bağlayan kanalın içindeki hava kabarcığını dışarı itmek için sol silindirin üzerine bastırın.Pompayı dakikada beş mililitre hızında çalıştırın. Klempi çıkarın ve jelin cam plakalar arasında yavaşça akmasını sağlayın. Jel duraksarken, iğnenin her zaman sıvının üzerinde olduğundan emin olarak iğneyi yavaşça yukarı kaldırın.Tüm sıvının jel düzeneğine girmesini sağlayın. Ardından sıvının üzerini nazikçe izopropanol ile kaplayın ve düzeneği distile su ile durulayın. Jelin oda sıcaklığında en az 30 dakika boyunca polimerize olmasını bekleyin.Ardından, kullanımdan hemen önce PS ve TM ekleyerek %3,2'lik bir istifleme jeli hazırlayın. İstifleme jelini ayırma jelinin üzerine dökün ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek tarağı cam plakalar arasına yerleştirin. İstifleme jeli polimerize olduktan sonra, örnek yüklemeden hemen önce jeli 4 °C'ye kadar soğutun.Tarağı, jel düzlemine açılı bir şekilde yavaşça çekerek çıkarın. Bu işlem, hava boşluklara hızla girerek kuyucukların kalitesini artırır. Diyalize edilmiş hücre lizatını blue native page ile ayırmak için kuru kuyucuklara 20 µL ferritin markeri ve 40 µL diyalize lizat yükleyin. 4 °C'de, boş şeritleri eşit hacimlerde diyaliz tamponu ile doldurun. Ardından, her kuyucuktaki örneklerin üzerini soğuk katot tamponu ile kaplayın.İç hazneyi soğuk katot tamponu ile, alsa haznesini ise soğuk anot tamponu ile doldurun. İşlemleri dört °C'de gerçekleştirin ve örnekler ayırma jelinin içine girene kadar 100 volt uygulayın. Ardından voltajı 180 volta yükseltin ve boya sınırı jelin sonuna ulaşana kadar jeli çalıştırın.Çalışma üç ila dört saat sürer. İkinci boyut SDS page için, tek bir geniş şerit içeren standart %10 SDS jel hazırlayın. Moleküler ağırlık belirteci için bir şerit ve SDS örnek tamponu ile karıştırılıp 95 °C'de beş dakika kaynatılmış diyalizli lizat kontrolünün bir alikotu için bir şerit ayırın; plakalardaki blue native page jelini elektroforez cihazından çıkarın ve plakalardan birini nazikçe kaldırın.Yığma jeli çıkarın ve mavi doğal sayfa jelinin ilgili proteinleri içeren şeridini kesin. Mavi doğal sayfa jeli dilimini SDS örnek tamponuna yerleştirin ve inkübasyon sonrası bir çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Jel dilimini mikrodalga fırında kısa süre kaynatın, ardından 15 dakika daha inkübe edin.Çalkalayıcı üzerindeki SDS örnek tamponunda, SDS jelinin tarağını çıkarın ve kuyucukların içine bir miktar SDS tamponu doldurun; ardından mavi doğal (blue native) PAGE jel dilimini SDS jelinin büyük kuyucuğuna, hava kabarcığı oluşmamasına dikkat ederek yerleştirin. Jel diliminin tam olarak istifleme (stacking) jeli üzerine oturması gerektiğinden, işlem sırasında bir cımbızdan yardım alabilirsiniz.Kesitin üzerini SDS örnek tamponu ile kaplayın, ardından markörü ve lizat kontrolünü yükleyin. Standart protokollere uygun olarak elektroforez ve protein transferini gerçekleştirin. Sonuçları yorumlamak için, ikinci boyut mavi doğal SDS sayfasındaki bir proteinin konumunun, proteinin bir MultiPro kompleksinin parçası olup olmadığına dair kanıt sağladığını bilmek önemlidir.Monomerik proteinler, birinci boyuttaki gradyan jel nedeniyle hiperbolik bir diyagonal boyunca göç edecek ve ikinci boyuttaki lineer jelde ise lineer olarak hareket edecektir; MultiPro komplekslerinin alt birimleri, diyagonalin altında dikey bir hat oluşturacak şekilde bulunacaktır. Eğer belirli bir protein farklı komplekslerin parçasıysa, yatay bir hat üzerinde birkaç leke saptanır. Özetle, iki boyutlu blue native page SDS page yaklaşımı, MultiPro kompleks kompozisyonunun, boyutunun ve bağıl bolluğunun belirlenmesine olanak tanır.Bu gösterimde, birkaç proteazom veya alt birimi western blotting ile tespit edilmiştir. Beta iki ve MCP 21 alt birimleri, aynı komplekslerin bir parçası olduklarını gösteren dikey olarak düzenlenmiş ayrı noktalar şeklinde tespit edilebilmiştir. PA 28, beta iki ve CP 21 ile aynı dikey hat üzerinde bulunmuştur ve dolayısıyla aynı kompleksin bir parçasıdır.Yatay çizgilere bakıldığında, beta iki ve MCP 21'in üç farklı kompleksin parçası olduğu görülebilir. PA 28 ise bu komplekslerden yalnızca birinde bulunur. Bu nedenle, söz konusu MultiPro kompleksleri 20 s proteazom olarak tanımlanabilir.P 28 ve tek başına 20 S proteazom ile birlikte, mavi doğal sayfa elektroforezi (blue native page) kullanarak hücresel lizattan doğal MultiPro komplekslerinin nasıl ayrıştırılacağını ve karakterize edileceğini size gösterdik. Bu prosedürü uygularken, örneğin dikkatlice diyaliz edilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. SDS ile temastan kaçınmak ve her zaman dört derecede çalışmak için, hem motor protein komplekslerinin bütünlüğünü korumak hem de en iyi çözünürlüğü sağlamak amacıyla hücresel liz için farklı deterjanları karşılaştırmanızı öneririz.Hepsi bu kadar. İzlediğiniz için teşekkürler, deneylerinizde başarılar dilerim. Görüşmek üzere.

blue-native-polyacrylamide-gel-electrophoresis-bn-page-for-analysis

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu teknik makale Invitrogen gelen ticari olarak kullanılabilir NuPAGE elektroforez Mini Jel sistemi kullanarak standart bir western-blot prosedürü açıklamaktadır.

Batı Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels kullanarak Blot

Bu video, proteinler için denatüre edici bir poliakrilamid bazlı ayırma tekniğini göstermektedir. Bu teknik, proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ön tanımlanmasına yardımcı olur.

Protein Analizi için Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Moleküler Ağırlığa Göre Proteinleri Ayırmak ve Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu videoda, mitokondriyal solunum protein komplekslerinin doğal olarak katlanmış ve işlevsel olarak aktif durumlarında analizi için mavi yerel PAGE adı verilen bir elektroforetik tekniği gösteriyoruz. Anyonik Coomassie mavisi boyası, protein komplekslerinin negatif yüklü hale gelmesine neden olarak boyut ve yapıya göre ayırmaya izin verir.

Mavi Doğal Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Bozulmamış Mitokondriyal Solunum Zinciri Komplekslerinin Analizi için Denatüre Olmayan Bir Ayırma Tekniği

Bu videoda, doğal protein komplekslerini doku homojenatlarından ayırmak için multimerik PAGE açıklanmaktadır. Teknik, mavi yerel PAGE ve SDS-PAGE tekniklerinin bir karışımıdır. Ayrılan kompleksler, hücre işleyişindeki rolleri için karakterize edilebilir ve incelenebilir.

Doğal protein komplekslerini ayırmak için Multimer-PAGE: bozulmamış multimerik proteinleri doku lizatından ayırmak için Blue Native-PAGE ve SDS-PAGE'den oluşan hibrit bir ayırma tekniği

Bu videoda, insan fonksiyonel olmayan hipofiz adenomunun (NFPA) tümör dokularından elde edilen karmaşık bir protein karışımından tek tek proteinleri ayıran iki boyutlu bir jel elektroforezi yöntemi gösteriyoruz. Proteinler, birinci boyutta elektrik yüklerine göre ayrılır ve ikinci boyutta moleküler ağırlıklara göre daha da ayrılır.

İki Boyutlu Poliakrilamid Jel Elektroforezi: Yük ve Moleküler Ağırlığa Dayalı Kompleks Protein Karışımındaki Proteinlerin Analizi İçin Bir Ayırma Tekniği

Bu protokol, çeşitli alt akış protein analiz teknikleriyle uyumlu, heterojen numunelerden kovalent olmayan biyomoleküler düzenekler ve proteinler için doğal bir ayırma tekniği olan berrak doğal jel salınımlı sıvı fraksiyon tuzak elektroforezinin (CN-GELFrEE) nasıl hazırlanacağını ve gerçekleştirileceğini açıklar.

CN-GELFrEE - net yerli jel-elüt sıvı kısmı Tuzak Elektroforez

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Burada bir etiket bilgilerini kantitatif kütle spektrometresi kullanılarak protein korelasyon profil ardından afinite protein komplekslerinin saflaştırılması ve mavi doğal PAGE ile onların ayrılması için protokoller, mevcut. Bu yöntem, farklı protein kompleksleri halinde interactomes çözmek için yararlıdır.

Mavi Yerli PAGE ve Protein İlişkisi Profil Yöntemi ile Affinity Saf protein Kompleksler çözümleniyor

Burada büyük yerli protein: protein ve protein protein bileşimi çözümlemek için bir protokol mevcut: yağlı tohum tecavüzünün nükleik asit kompleksleri (B. napus) mavi birleştiren 3D polyacrylamide Jel Elektroforez (sayfa) yaklaşımı kullanılarak, phloem çıktı yerli (BN) tarafından kitle spektrometrik kimlik ardından iki tane denaturing sayfa.

Phloem Sap örnekleme gelen Brassica napus 3D-sayfa Protein ve Ribonükleoprotein kompleksleri için

Bir iletişim kuralı bitki aydınlatma için thylakoid protein kompleksi organizasyon ve mavi yerel polyacrylamide ile kompozisyon jel elektroforez (BN-sayfa) ve 2D-SDS-sayfa açıklanmıştır. Protokol Arabidopsis thalianaiçin optimize edilmiş ama küçük değişiklikler ile diğer bitki türleri için kullanılabilir.

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Yüksek çözünürlüklü complexome profilleme için mikrotom kullanan çok yönlü bir kriyoliking BN-MS protokolü sunulur.

BN-MS Analizi Cryoslicing tarafından Yüksek Çözünürlüklü Complexome Profilleme

Öğrenin hücresel lizatlardan multiprotein komplekslerini BN-PAGE ile karakterize etme yöntemini. Bu teknik, protein-protein etkileşimlerini koruyarak kompleks bileşenlerinin analizini sağlar.

Hücresel lizatları Multiprotein Kompleksleri Analizi Mavi Native Poliakrilamid Jel Elektroforez (BN-PAGE)

Daha fazla video keşfet