Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Antijene özgü T hücresi reseptörleri için transgenik fareler, somatik hücre nükleer transferi veya SCNT kullanarak önceden tanımlanmış T hücresi reseptör özgüllüklerine sahip fare modelleri oluşturmak için T hücresi gelişimi ve işlevi çalışmasında vazgeçilmez olmuştur. Bir fare, ilgilenilen bir patojen ile enfekte olur. T hücreleri fareden izole edilir ve daha sonra floresanla aktive edilmiş hücre sınıflandırması ile saflaştırılır.

Saflaştırılmış T hücresi daha sonra somatik hücre nükleer transferi için kullanılır. Embriyolar blast aşamasına geldikten sonra embriyonik kök hücreler izole edilir. Bu hücreler daha sonra blast assist'e enjekte edilir ve bunlar daha sonra yalancı hamile farelere aktarılır.

Elde edilen yavrular, PAX analizi ile doğrulanabilen, ilgilenilen T hücresi popülasyonunda belirgin bir artışı ifade eder. Merhaba, benim adım Okta AK ve burada Beyaz Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nde yüksek lisans öğrencisiyim. Bugün size somatik CLE transferi, blast assist enjeksiyonları ve embr transferinin nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim.

Somatik transferin temel avantajı, T hücresi reseptörlerini endojen lokustan eksprese eden ve bu nedenle endojen promotörün kontrolü altında olan fare modellerinin üretilebilmesi ve fare modellerinin çok hızlı bir şekilde üretilebilmesidir. Somatik sıvı gönderme transferi, önceden tanımlanmış T hücresi reseptörü veya B hücresi reseptörü özgüllüklerine sahip fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabilir. Bu, otoimmünite, bulaşıcı hastalık ve kanser gibi alanlarda çalışan kişiler için özel bir ilgi alanıdır.

Toxoplasma Gandhi gibi bir patojene özgü T hücresini izole etmek için, bağışıklık tepkisinin zirvesinde intraperitoneal enjeksiyonla enfekte olan cimri için, dalak ötenazi fareden izole edilir ve homojenize donör hücreler daha sonra izole edilir ve floresan etiketli antikorlar ve uygun tetramer ile inkübe edilir. Son olarak, patojene özgü T hücreleri elde etmek için bilgi sıralaması yapılır. Oosit enükleasyon işleminden önceki akşam.

Dört, beş ve yedi mikrometre piso enjeksiyon iğnelerini bir şırınga kullanarak hazırlayın ve üzerlerine cıva yükleyin. Ertesi gün, oositleri toplayarak somatik hücre nükleer transfer protokolüne başlayın, daha sonra bir ağız pipeti kullanarak, bunları bir Petri kabında K-S-O-M-A-A ortamı damlalarına aktarın. Petri kabının kapağında.

Yaklaşık 10 damla PVP yerleştirerek somatik hücre nükleer transferi veya SCNT gerçekleştirmek için aate hazırlayın. Mililitre cyto B başına beş mikrogram içeren yaklaşık 10 damla HCZB ve mililitre cyto B başına 2.5 mikrogram içeren yaklaşık 10 damla HCCB. S-C-N-T-A plakasını ters çevrilmiş bir bileşik mikroskobun tablasına yerleştirin.

Daha sonra, mikro manipülatöre yedi mikrometrelik bir enükleasyon iğnesi yerleştirin ve beş ila 10 kez atılan PVP çözeltisine çekerek yıkayın. Daha sonra 10 ila 30 metafaz, iki tutuklu siti Petri kabından mililitre başına beş mikrogram ile HCCB damlalarından birine aktarın. S-C-N-T-A plakası üzerindeki Cyto B, inkübasyon sırasında oda sıcaklığında beş dakika inkübe eder, oositleri yatay olarak hizalayın.

Beş dakika geçtikten sonra. Tutma iğnesinin önüne bir oosit yerleştirmek için enükleasyon iğnesini kullanın. Bir mikro enjektör kullanarak, oositi mikro pipet tutma iğnesine sabitlemek için bir vakum uygulayın.

Daha sonra, enükleasyon iğnesini kullanarak, op plazmasına kıyasla aşırı saydam görünen kromozom iğ kompleksi saat üç konumunda olana kadar oositi çevirin, zno lucita'ya nüfuz etmek için pedala basarak bir pizo darbesi başlatın. Bir pizo darbesi, uzunlamasına hareket eden ve çekirdeklenme iğnesinin ucunu titreştiren mekanik bir darbedir. Uç titreşimleri, zop lucita'nın delinmesine yardımcı olur.

Zona palita'dan geçtikten sonra, çekirdeklenme iğnesinin açıklığını metafaz iki mile bitişik olarak yerleştirin ve vakumu uygulayın. Kromozom iğ kompleksi yavaşça iğnenin içine doğru hareket edecektir. İğne çıkarıldıktan sonra, zar kendini kapatmalıdır.

Son olarak, bir ağız pipeti kullanarak, enükleasyonlu sitleri K-S-O-M-A-A damlalarına geri aktarın. Daha sonra aynı pipeti kullanarak, damla damla KSOM AA'ya aktararak yıkayın Nükleer transfer gerçekleştirmek için, mikro manipülatör üzerindeki yedi mikrometre enükleasyon iğnesini dört ila beş mikrometre nükleer transfer iğnesi ile değiştirin. İğneyi daha önce olduğu gibi PVP ile yıkayın.

Daha önce izole edilen CD sekiz pozitif T hücresini S-C-N-D-A plakası üzerindeki bir PVP damlasına yerleştirin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, 10 ila 30 ENUCLEATED sitte'yi mililitre başına 2.5 mikrogram olan bir damla HCZB'ye aktarın.

S ct üzerinde Cyto B. Bir tabak oda sıcaklığında beş dakika inkübe edilir. İnkübasyon sırasında, enjeksiyon iğnesini kullanarak sitleri yatay olarak hizalamak için nükleer transfer iğnesini kullanın.

PVP ortamından bir donör CD sekiz pozitif hücre alın ve dış zar parçalanana kadar içeri ve dışarı aspire edin. Gerekirse, zarın ve sitozolün parçaları bir pizo nabız uygulayın ve görünür olmalıdır. Çekirdeği iğnenin içine çekin.

Ardından 10 ila 30 olana kadar çekirdek toplamaya devam edin. Ardından, hizalanmış enükleasyonlu sitleri içeren damlaya geçin. Bir oositi tutma iğnesine sabitlemek için vakumu uygulayın.

Ardından, NU nükleer transfer iğnesini, çekirdekler açıklıktan uzağa bakacak şekilde zop lucita'nın yanına yerleştirin. İğne zop lucita'dan geçene kadar pizo pulse uygulayın. Bir çekirdeği dikkatlice iğnenin ucuna hareket ettirmek için mikro manipülatörü itin.

İğnenin ucu içeriye üçte ikisi girene kadar iğneyi oositin içine itin. Oosit zarının bir kısmı iğnenin içinde olacak şekilde küçük bir negatif basınç uygulayın. Bir sonraki adım çok kritiktir.

Oositin gerçekten açık olduğu tek zaman olduğu için. Tek bir ZO darbesi uygulayın. Ardından çekirdeği iğneden dışarı itmek için pozitif basınç uygulayın.

İğneyi, ucu oositin yaklaşık üçte biri olacak şekilde dikkatlice geri çekin ve ardından negatif basınç uygulayın ve iğneyi geri çekmeye devam edin. Oositi kapatmak için. Bu adımı her oosit ile tekrarlayın.

Tüm oositler bir çekirdek aldıktan sonra, bunları Petri kabına aktarın ve en az 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilen KS OM AA ortamının damlasından damlasına aktararak yıkayın. İnkübasyonun ardından, SCN T embriyolarını stronsiyum klorür içeren kalsiyum içermeyen aktivasyon ortamı damlalarına aktarın. Stronsiyum klorür, döllenme sırasında benzer şekilde meydana gelecek kalsiyum salınımlarını indükleyerek oositi aktive eder.

Altı saat kuluçkaya yatırın. İstenirse, aktivasyon ortamına histon diasetil asisis'in spesifik olmayan bir inhibitörü olan TSA'yı ekleyin Aktivasyonu takiben verimliliği artırmak için, psödopronükleus veya PPN pozitif SCNT embriyolarının miktarını belirlemek için embriyoları ters mikroskop altında inceleyin. PPN, görünümlerine göre tanımlanabilir.

Yumurtaya benziyorlar. Güneşli tarafı yukarı yıkama ve kültür. Embriyolar ve K-S-O-M-A-A, patlama destek aşamasına ulaşana kadar 37 santigrat derecede üç buçuk gün boyunca düşer.

Başlangıçta, çekirdeklenme ve NU nükleer transferi için size az önce gösterdiğimiz prosedürleri doğru bir şekilde gerçekleştirmeye odaklanmalısınız. Bu tekniklere hakim olduktan sonra, aşağıdaki prosedürlerin yönetilmesi daha kolaydır: Kullanılan embriyonik kök veya ES hücreleri. Burada standart teknikler kullanılarak türetilmiştir.

Bunlar, blast yardımlı enjeksiyonun yapıldığı gün, kotustan üç buçuk gün sonra hazırlanmalıdır. PVP ve HCZP içeren damlaları kaplayarak steril bir bakteri kabının kapağını hazırlayın. Ardından, daha önce olduğu gibi piso nabzı için 15 mikrometrelik bir enjeksiyon iğnesi hazırlayın.

Ardından, enjeksiyon iğnesini mikro manipülatöre yerleştirin ve PVP transferi ile yıkayın. 10 ila 30 patlama, bir damla HCZB'ye yardımcı olur. Ardından, beş ila 50 mikrolitre ESL süspansiyonunu başka bir HCZB damlasına yerleştirin.

Kolayca alınabilmeleri için yeterli sayıda ES hücresi bulunmalı, ancak kalabalık olmamalıdır. Ardından, enjeksiyon iğnesi ile 30 ila 100 ES hücresi alın. Patlama yardımı ile düşüşe geçin.

Püskürtme yardımını yatay olarak hizalayın ve vakum uygulayarak birini tutma iğnesi ile sabitleyin. İç hücre kütlesi saat dokuzda olana kadar patlama yardımını çevirmek için enjeksiyon iğnesini kullanın. Enjeksiyon iğnesini saat üç konumuna yerleştirin.

İğnenin ucunda ES hücresi olmadığından emin olun ve enjeksiyon iğnesi zop lucita ve trifecta'dan blastik contaya nüfuz edene kadar bir piso darbesi uygulayın. Beş ila 15 ES hücresini serbest bırakın, böylece iç hücre kütlesine yapışırlar. Enjeksiyonlar bittikten sonra tüm blast assist enjekte edilene kadar devam edin.

K-S-O-M-A-A'da iki kez yıkanır ve cerrahi embriyo transferine devam edilir, yalancı gebe dişilere yerleştirilir ve cerrahi alanda yalancı gebe kadın alıcı fareye anestezi uygulanır. Elektrikli bir tıraş makinesi kullanarak, saçları sağ alt kadrandan alın. İyot bazlı bir çözelti ve% 70 etanol kullanarak alanı diseksiyon mikroskobu altında dezenfekte edin.

Cildi açmak için makas kullanın, ardından cilt ile karın zarı arasına kapalı makas yerleştirin ve karın zarını deriden ayırmak için açın. Yumurtalığı, kırmızı bir nokta olarak görünmesi gereken peritondan bulun. Daha sonra o bölgedeki karın zarını açmak için makas kullanın.

UCT'yi veya çevresindeki yağı dikkatlice tutmak için forseps kullanın ve bir ağız pipetine bağlı bir kılcal damar kullanarak uterusu dışarı çekin. Forseps ile yumurta kanalını ve uterusu tutan yaklaşık 10 patlama yardımcısından oluşan bir grup alın. Rahimde küçük bir delik açmak için bir iğne kullanın.

Daha sonra patlatma yardımı ile kılcal damarı uterusun lümenine yerleştirin ve serbest bırakın. Uterusu karın boşluğuna geri itin. Peritonun kenarlarını bulun ve birkaç dikişle kapatın.

Farenin dış yüzeyini birkaç zımba ile kapatın. Ağrı kesici ilaçları deri altına uygulayın. Ardından fareyi bir ısıtma lambasının altındaki kafesine geri aktarın.

Uyanana kadar farenin nefesini izleyin. Enükleasyon ve somatik hücre nükleer transferini takiben. Embriyoların yaklaşık% 70'i psödopronükleus için pozitifti.

Bu şekilde gösterildiği gibi. Altı veya 10 saat boyunca TSA ile tedavinin hiçbir etkisi olmamıştır. Kültürde üç buçuk gün sonra, embriyoların %5 ila %10'u blast assist'e dönüştü.

Yine, TSA'nın eklenmesinin patlama yardımı geliştirme hızı üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. SCNT blast assist daha sonra embriyonik kök hücreleri elde etmek için kullanıldı. TSA, ESL'nin patlama yardımından türetilme oranını önemli ölçüde iyileştirdi.

S-C-N-T-E-S hücreleri, kimerik fareler oluşturmak için kullanılır. Bu farelerden kan alınır ve burada gösterildiği gibi gerçek analizi kullanılarak spesifik T hücrelerinin varlığı için analiz edilir. Kan, anti CDA antikoru ve spesifik tetramer ile boyandığında, çift pozitif bir popülasyon tanımlanabilir.

SCNT için kullanılan donör hücrenin doğru özgüllükte olduğunu gösterir. Size az önce somatik hücre LU transferi, blast assist enjeksiyonları ve embriyo transferinin nasıl yapıldığını gösterdim. Dikkate alınması gereken en önemli nokta, T hücresi veya B hücrelerinizin saflığıdır.

Somatik transferin nasıl gerçekleştirileceğini öğrendikten ve embriyolarınız patlama aşamasında, onları doğrudan sahte hamile kadınlara transfer etmek veya embriyonik kök hücreleri türetmek ve kimerik fareler oluşturmak için kullanmak arasında seçim yapabilirsiniz.