Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Antijen spesifik T hücresi reseptörleri için transgenik fareler, somatik hücre çekirdek transferi veya SCNT kullanarak önceden tanımlanmış T hücresi reseptör özgüllüklerine sahip fare modelleri oluşturmak suretiyle, T hücresi gelişimi ve fonksiyonlarının incelenmesinde vazgeçilmez olmuştur. Bir fare, ilgilenilen bir patojen ile enfekte edilir. T hücreleri fareden izole edilir ve ardından floresan aktive hücre ayıklama yöntemiyle saflaştırılır.

Saflaştırılmış T-hücreleri daha sonra somatik hücre çekirdek transferi için kullanılır. Embriyolar blastokist evresine ulaştıktan sonra, embriyonik kök hücreler izole edilir. Bu hücreler daha sonra blastosistlere enjekte edilir ve ardından blastosistler yalancı gebe farelere transfer edilir.

Elde edilen yavrular, PAX analizi ile doğrulanabilen, ilgilenilen T-hücresi popülasyonunda belirgin bir artış sergiler. Merhaba, ismim Okta AK ve White Biyomedikal Araştırmalar Enstitüsü'nde doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün size somatik CLE transfer blast asist enjeksiyonlarının yanı sıra embriyo transferinin nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim.

Somatik transferin temel avantajı, T-hücre reseptörlerini endojen lokustan eksprese eden ve dolayısıyla endojen promotör kontrolü altında olan fare modellerinin oluşturulabilmesi ve bu fare modellerinin çok hızlı bir şekilde üretilebilmesidir. Somatik sıvı transferi, önceden tanımlanmış T-hücre reseptörü veya B-hücre reseptörü özgüllüklerine sahip fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabilir. Bu durum; otoimmünite, enfeksiyöz hastalıklar ve kanser gibi alanlarda çalışan araştırmacılar için özel bir önem taşımaktadır.

Toxoplasma gondii gibi bir patojene özgü T hücrelerini izole etmek için, immün yanıtın zirve noktasında intraperitonal enjeksiyonla enfekte edilmiş farelerin dalakları çıkarılır ve homojenize edilir; ardından donör hücreler izole edilerek floresan işaretli antikorlar ve uygun tetramer ile inkübe edilir. Son olarak, patojene özgü T hücrelerini elde etmek için FACS ayıklama işlemi gerçekleştirilir. Oosit enükleasyon prosedüründen önceki akşam.

Siringe kullanarak cıva ile retrograd yükleme yaparak dört, beş ve yedi mikrometrelik pico enjeksiyon iğneleri hazırlayın. Ertesi gün, oositleri toplayarak somatik hücre çekirdek transferi protokolüne başlayın, ardından bir ağız pipeti kullanarak bunları bir Petri kabındaki K-S-O-M-A-A ortamı damlalarına aktarın. Petri kabının kapağında.

Yaklaşık 10 damla PVP, mililitre başına beş mikrogram cyto B içeren yaklaşık 10 damla HCZB ve mililitre başına 2,5 mikrogram cyto B içeren yaklaşık 10 damla HCCB yerleştirerek somatik hücre çekirdek transferi veya SCNT gerçekleştirmek için bir plaka hazırlayın. Bu plaka S-C-N-T-A plakası olarak adlandırılacaktır. S-C-N-T-A plakasını ters bileşik mikroskobun tablasına yerleştirin.

Ardından, mikromanipülatöre yedi mikrometre enükleasyon iğnesini yerleştirin ve PVP çözeltisinin içine beş ila 10 kez çekip bırakarak yıkayın. Daha sonra, Petri kabındaki 10 ila 30 adet metafaz iki evresinde durdurulmuş oositleri, S-C-N-T-A plakası üzerindeki beş mikrogram/mL Cyto B içeren HCCB damlalarından birine aktarın. Oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin; inkübasyon sırasında oositleri yatay olarak hizalayın.

Beş dakika geçtikten sonra, tutucu iğnenin önüne bir oosit yerleştirmek için enükleasyon iğnesini kullanın. Bir mikro enjektör yardımıyla, oositi mikro pipet tutucu iğneye sabitlemek için vakum uygulayın.

Ardından, enükleasyon iğnesi kullanarak, oosit plazmasına kıyasla hiper-şeffaf görünen kromozom iğciği kompleksini saat üç yönüne getirene kadar oositi döndürün ve zona lucida'yı penetre etmek için pedala basarak bir piezo darbesi başlatın. Piezo darbesi, boylamsal olarak ilerleyen ve nükleasyon iğnesinin ucunu titreştiren mekanik bir darbedir. Uç titreşimleri, zona lucida'nın delinmesine yardımcı olur.

Zona pellucida geçildikten sonra, nükleasyon iğnesinin ucunu metafaz iki iğinin yanına yerleştirin ve vakumu uygulayın. Kromozom iğik kompleksi yavaşça iğnenin içine hareket edecektir. İğne geri çekildiğinde, membran kendi kendini kapatmalıdır.

Son olarak, bir ağız pipeti kullanarak enükle edilen sitleri tekrar K-S-O-M-A-A damlacıklarına aktarın. Ardından aynı pipeti kullanarak, hücreleri KSOM AA damlacıklarından diğerine aktararak yıkayın. Çekirdek transferini gerçekleştirmek için mikromanipülatördeki yedi mikrometrelik enükleasyon iğnesini dört ila beş mikrometrelik bir çekirdek transfer iğnesiyle değiştirin. İğneyi daha önce yaptığınız gibi PVP ile yıkayın.

Daha önce izole edilen sekiz pozitif CD T hücresini S-C-N-D-A plağındaki bir damla PVP içine yerleştirin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin. Ardından, 10 ila 30 ENÜKLEASYON yapılmış sitleri, 2,5 micrograms per milliliter içeren bir damla HCZB'ye aktarın.

S ct. A plakası üzerindeki Cyto B'yi oda sıcaklığında beş dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon sırasında, enjeksiyon iğnesini kullanarak sitleri yatay olarak hizalamak için nükleer transfer iğnesini kullanın.

PVP ortamından donör bir CD8 pozitif hücre alın ve dış membran parçalanana kadar hücreyi içeri çekip dışarı bırakın. Gerekirse, membran vele sitozol fragmanları görünene kadar piezo darbesi uygulayın. Çekirdeği iğneye çekin.

Ardından, 10 ila 30 adet olana kadar çekirdekleri toplamaya devam edin. Sonrasında, hizalanmış enükle edilmiş oositleri içeren damlaya geçin. Bir oositi tutucu iğneye sabitlemek için vakumu uygulayın.

Ardından, NU nükleer transfer iğnesini, çekirdekler açıklıktan uzağa bakacak şekilde zop lucita'nın yanına yerleştirin. İğne zop lucita'yı tamamen geçene kadar pizo darbesi uygulayın. Bir çekirdeği dikkatlice iğnenin ucuna taşımak için mikro manipülatörü itin.

İğnenin ucunun üçte ikisi içeri girene kadar iğneyi oositin içine itin. Oosit membranının küçük bir kısmının iğneye girmesi için hafif bir negatif basınç uygulayın. Bir sonraki adım oldukça kritiktir.

Oositin gerçekten açık olduğu tek zaman olduğu için, tek bir ZO darbesi uygulayın. Ardından, çekirdeği iğneden dışarı itmek için pozitif basınç uygulayın.

İğneyi, ucu oositin yaklaşık üçte birine gelecek şekilde dikkatlice geri çekin, ardından negatif basınç uygulayın ve iğneyi geri çekmeye devam edin. Oositi mühürleyin. Bu adımı her oosit için tekrarlayın.

Tüm oositler bir çekirdek aldıktan sonra, bunları Petri kabına aktarın ve 37 °C'de en az 30 dakika inkübe edilmiş KS OM AA medyumunun damlaları arasında transfer ederek yıkayın. İnkübasyonun ardından, SCN T embriyolarını stronsiyum klorür içeren kalsiyumsuz aktivasyon medyumunun damlalarına aktarın. Stronsiyum klorür, döllenme sırasında da benzer şekilde gerçekleşen kalsiyum osilasyonlarını tetikleyerek oositi aktive eder.

Altı saat boyunca inkübe edin. İstenirse, aktivasyon ortamına histon deasetilazların spesifik olmayan bir inhibitörü olan TSA ekleyin. Aktivasyon sonrası verimliliği artırmak için, pseudo pronuklei veya PPN pozitif SCNT embriyolarının miktarını belirlemek amacıyla embriyoları ters mikroskop altında inceleyin. PPN, görünümlerine göre tanımlanabilir.

Yumurtaya benzerler. Sarısı üstte kalacak şekilde yıkanır ve kültüre alınır. Embriyolar, blastokist evresine ulaşana kadar 37 °C'de üç buçuk gün boyunca K-S-O-M-A-A damlaları içinde tutulur.

Başlangıçta, size az önce göstermiş olduğumuz çekirdeklenme ve NU nükleer transfer prosedürlerini doğru şekilde uygulamaya odaklanmalısınız. Bu tekniklerde uzmanlaştıktan sonra, sonraki prosedürleri yönetmek daha kolay olacaktır. Burada kullanılan embriyonik kök hücreler veya ES hücreleri, standart teknikler kullanılarak türetilmiştir.

Bunlar, çiftleşmeden üç buçuk gün sonra, blast destekli enjeksiyon gününde hazırlanmalıdır. PVP ve HCZP içeren damlaları damlatarak steril bir bakteri kabının kapağını hazırlayın. Ardından, daha önce yapıldığı gibi pico pulse için 15 mikrometre enjeksiyon iğnesini hazırlayın.

Ardından, enjeksiyon iğnesini mikro manipülatöre yerleştirin ve PVP transferi ile yıkayın. Bir damla HCZB içine 10 ila 30 blast yardımı uygulayın. Daha sonra, 5 ila 50 µL ESL süspansiyonunu başka bir HCZB damlasına yerleştirin.

Kolayca alınabilmeleri için yeterli miktarda ES hücresi olmalı, ancak hücreler çok sıkışık olmamalıdır. Ardından, enjeksiyon iğnesi ile 30 ila 100 ES hücresi alın. Blast assist bulunan damlaya geçiniz.

Blastosist destekleyiciyi yatay olarak hizalayın ve vakum uygulayarak tutucu iğne ile sabitleyin. İç hücre kütlesi saat dokuz yönüne gelene kadar blastosist destekleyiciyi enjeksiyon iğnesi ile döndürün. Enjeksiyon iğnesini saat üç yönüne yerleştirin.

İğnenin ucunda ES hücreleri olmadığından emin olun ve enjeksiyon iğnesi zona lucida ve trofektodermi geçip blastosist boşluğuna girene kadar bir piko darbesi uygulayın. İç hücre kütlesine yapışmaları için beş ila 15 ES hücresi bırakın. Tüm blastosistler enjekte edilene kadar işleme devam edin; enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra işlemi sonlandırın.

K-S-O-M-A-A ile iki kez yıkayın ve yalancı gebe dişilere cerrahi embriyo transferine geçin; anestezi uygulanmış yalancı gebe alıcı fareyi cerrahi alana yerleştirin. Bir elektrikli tıraş makinesi kullanarak sağ alt kadrandaki tüyleri temizleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, iyot bazlı bir solüsyon ve %70 etanol kullanarak bölgeyi dezenfekte edin.

Cildi açmak için makas kullanın, ardından kapalı makasları cilt ile periton arasına yerleştirip peritonu ciltten ayırmak için açın. Periton üzerinden, kırmızı bir nokta şeklinde görünmesi gereken yumurtalığı bulun. Ardından, o bölgedeki peritonu açmak için makas kullanın.

UCT'yi veya çevresindeki yağ dokusunu pensle dikkatlice kavrayın ve ağız pipetine bağlı bir kapiler yardımıyla uterusu dışarı çekin. Ovidukt ve uterusu pensle tutarak yaklaşık 10 blastokistten oluşan bir grubu toplayın. Uterusta küçük bir delik açmak için bir iğne kullanın.

Ardından, blast assist içeren kılcal tüpü uterus lümenine yerleştirin ve serbest bırakın. Uterusu tekrar abdominal kaviteye itin. Peritonun kenarlarını bulun ve birkaç dikişle kapatın.

Fareyle deri, birkaç zımba ile kapatın. Subkütan olarak ağrı kesici uygulayın. Ardından fareyi, bir ısıtıcı lamba altındaki kafesine geri yerleştirin.

Fare uyanana kadar solunumunu izleyin. Enükleasyon ve somatik hücre çekirdek transferini takiben, embriyoların yaklaşık %70'inde yalancı pronükleuslar pozitif olarak belirlendi.

Bu şekilde gösterildiği üzere, TSA ile altı veya 10 saatlik tedavi herhangi bir etki yaratmamıştır. Kültürde üç buçuk gün geçtikten sonra, embriyoların %5 ila 10'u blastokiste dönüşmüştür.

Yine, TSA ilavesinin blastokist yardımı gelişim hızı üzerinde hiçbir etkisi olmamıştır. SCNT blastokist yardımları daha sonra embriyonik kök hücreler elde etmek için kullanılmıştır. TSA, blastokist yardımlarından ESL elde edilme oranını önemli ölçüde artırmıştır.

S-C-N-T-E-S hücreleri, kimera fareler üretmek için kullanılır. Bu farelerden kan alınır ve burada gösterildiği gibi, belirli T hücrelerinin varlığı akış sitometrisi kullanılarak analiz edilir. Kan, anti CDA antikoru ve spesifik tetramer ile boyandığında, çift pozitif bir popülasyon tanımlanabilir.

SCNT için kullanılan donör hücrenin doğru spesifiteye sahip olduğunu gösterir. Size somatik hücre LU transferinin, blast asist destekli enjeksiyonların ve embriyo transferinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş oldum. Dikkat edilmesi gereken en önemli nokta, T hücrelerinizin veya B hücrelerinizin saflığıdır.

Somatik transferi nasıl gerçekleştireceğinizi öğrendikten ve embriyolarınız blast aşamasına geldikten sonra, bunları doğrudan yalancı gebe dişilere transfer etmeyi veya embriyonik kök hücreler türetmek ve kimera fareler oluşturmak için kullanmayı seçebilirsiniz.