Name: Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-30T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Öğrenin, somatik hücre çekirdek aktarımı ile T hücre reseptörü spesifikliği önceden tanımlanmış transgenik fare modelleri nasıl üretilir. Bu yöntem, otoimmünite, enfeksiyon hastalıkları ve kanser araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, H. Eisen, M. Gubbels, K. kamyonet Grinsven, E. Guillen, A. Drake, V. Mahajan, S. Gao, ve G. verimli tartışmalar ve reaktifler için Yapı müteşekkiriz. Biz J. Dausman, R. Flannery, J. Jackson ve fare koloni yönetimi ile yardımı için müteşekkiriz. P. Wisniewski FACSorting için müteşekkiriz. EMF İnsan Sınır Bilim Programı tarafından desteklenmiştir. RJ Ulusal Sağlık hibe RO1-HD045022 ve R37-CA084198 Enstitüsü tarafından desteklenmiştir. HLP Ulusal Sağlık Enstitüsü hibe tarafından desteklenmiştir.

Bu yöntem bildirilen araştırma <a href="http://www.sciencemag.org/cgi/content/abstract/328/5975/243">Kirak ve ark, Bilim 328 (5975), 243-248 (2010)</a> . 1. Donör Hücreleri İzolasyon Spesifik T ve B hücreleri transnuclear fare modelleri oluşturmak için donör hücreler olarak kullanılmadan önce, fare ilgi bir patojen ile enfekte ya da bir ilgi antijen aşı olmak gerekir. Toxoplasma gondii spesifik CD8 + hücreleri kullanılan olduğundan, aşağıdaki protokolü, kişisel ilgi göre adapte edilebilir, bu hücrelerin ve ihtiyaçlarını üretimi ve izolasyon anlatacağız . <ol><li> Kistler bir fare beyin Homojenat (yaklaşık 40) türetilen BL / 6 H-2 b) ve (H-2 d sınırlı CD8 + T hücrelerinin izolasyonu sağlayan x Balb / c F1 (B6CF1) fareler, intraperitoneal enjekte edilir. </li><li> Immün yanıt zirvesinde, enfekte fare ötenazi, dalak izole edilmiş ve 6 ml kırmızı kan hücresi (RBC) lizis tamponu içeren bir çanak içine yerleştirilmiş. </li><li> Dalak, buzlu tarafı iki kapak slaytlar kullanarak, dikkatli bir zemin ve eritrosit lizis tamponu oda sıcaklığında 5 dakika inkübe. </li><li> 14 ml PBS bir hücre süzgeç (40 veya 70 mm) ile, 50 ml şahin tüp ve 300g az 5 dakika santrifüj hücre süspansiyonu filtre. </li><li> Süpernatantı, hücre pelet, 1.5 ml Eppendorf tüp içine, 1 ml PBS ve transfer tekrar süspansiyon haline getirin. 300g az 5 dakika süreyle santrifüj ve sonra süpernatant kaldırmak. </li><li> 50 mcL PBS içinde hücre pelletini tekrar ilgi hücre tipi (örneğin CD3, B220, CD8 ve CD4) tanımlamak için floresan etiketli antikorlar eklemek ve floresan MHC-I tetramer (CD4-T hücreleri MHC-II tetramer) yüklü etiketli 4, 30 dakika hücre süspansiyonu ve inkübe ilgi peptid ° C. </li><li> 1 ml PBS, 300 g, 3 ml PBS tekrar süspansiyon pelet 5 dakika süreyle santrifüj ekleyin ve bir tüp içine bir hücre süzgeç (40 veya 70 mikron) aracılığıyla hücre süspansiyonu filtre. </li><li> Kapıların sıkı (Şekil 1B) FACSorting gerçekleştirin. </li></ol> 2. Somatik Hücre Nükleer Transferi Somatik Hücre Nükleer Transferi için birkaç protokol vardır. Metafaz-II tutuklandı oosit kullanımı ve Cytochalasin B. Bu nedenle donör hücreleri kullanarak ikinci mayoz bölünme inhibisyonu G0/G1 aşamasında ihtiyaç vardır nitelendirdi. <ol><li> Oosit hazırlanması <ol><li> Dişi fareler BDF1 arka plan, 17:00 ve 19:00 arasında fare başına 5IU PMS ile intraperitoneal enjekte edilir. </li><li> Yaklaşık 47 saat sonra, her bir fare 5IU HCG ile intraperitoneal enjekte edilir. </li><li> HCG enjeksiyonu aynı gün oosit bir kültür çanak (KSOM AA yağ altında damla) hazırlayın ve onları bir kuluçka 37 ° C,% 5 CO 2. Ayrıca, cıva ile onlara yükleyerek SCNT (enükleasyon 7μm ve lenfosit çekirdekleri nükleer transferi için 4 veya 5μm) için gerekli iğneler hazırlar. </li><li> Fareler Euthanize ve HCG sonra 13h (yaklaşık 8:00) hakkında siyon hatası izole. HCZB 1-2 damla siyon hatası toplayın. </li><li> Tek-tek M2 w / Hyaluronidase içeren bir damla siyon hatası taşıyın. Nick forsepsle dikkatli bir şekilde yumurtalık ve açılan oosit-kümülüs kompleks taşımak. Tüm oosit-kümülüs kompleksleri izole edilmiştir, çanak 37 inkübe ° C sonra </li><li> 2-5 dakika (tam zamanlı Hyaluronidase toplu bağlıdır) oosit toplamak sonra HCZB ve plaka KSOM-AA damla içine yıkayın. </li></ol></li><li> Oositlerin Enükleasyon <ol><li> SCNT plaka hazırlamak için bir petri kapağını kullanın. Mikroskop ve mikromanipülatör ayarlayın. </li><li> PVP enükleasyon iğne (7 mm), enükleasyon ile başlamadan önce yıkayın. </li><li> Enükleasyon için HZCB Cytochalasin B (5 mg / ml) ile bir damla oosit bir grup (10-30) yerleştirin. Line-up yatay oosit (en az 5 dakika) kuluçka. </li><li> Bir oosit ve holding iğne önünde yerleştirin. Holding iğne bir vakum uygulanarak yumurtanın sabitleyin. Enükleasyon iğne kullanarak, kromozom-mil-kompleks (CSC, sık sık "çekirdek" olarak da adlandırılır) 03:00 pozisyonda kadar oosit açın. </li><li> Piezo-pulse oosit zarar vermeden dikkatlice zona pellusida nüfuz kullanma. Metafaz-II mili bitişik iğne açılış yerleştirin ve vakum uygulamak. "Çekirdek" yavaş yavaş iğne hareket etmelidir ve membran tamamen çıkarıldıktan sonra kendini imzalaması gerektiğini. </li><li> KSOM-AA damlalar halinde geri enükleasyon oosit aktarın ve onları birçok kez yıkayın. E tekrarlayınyeni bir grup ile oosit çekirdeklenme adımları. Tüm yumurta enükleasyon veya 11:00 civarına kadar kadar devam edin. </li></ol></li><li> Nükleer transfer <ol><li> Nükleer transferi için, döviz, nükleer transfer iğnesi (4 veya 5 mikron) ve PVP ile yıkayın enükleasyon iğne (7 mikron). </li><li> PVP ile bir damla ilgi hücreleri (örneğin CD8 + T hücreleri) koyun, iyice karıştırın ve en az 10 dakika inkübe edin. </li><li> HCZB Cytochalasin B (2.5 mg / ml) ile bir damla enükleasyon oositlerin bir grup (10-30) yerleştirin. Line-up oosit yatay nükleer transfer iğnesi kullanarak kuluçka iken (min. 5 dakika). </li><li> PVP-hücre süspansiyonu bir donör hücre Pick up-and-out dış zar (membran ve sitoplazmada parçaları görünür olmalı) aşağı kırılmış kadar aspire. Gerekirse bir piezo-darbe uygulanabilir. Bir çekirdek izole edildikten sonra, iğne biraz yukarı taşımak ve 10-30 kadar çekirdekleri almaya devam edin. </li><li> Hizalanmış enükleasyon oosit içeren damlasına kadar hareket ettirin. Vakum uygulanarak holding iğnesi bir oosit sabitleyin. Nükleer transfer iğnesi (çekirdekleri uzakta açılması gerekir), zona pellusida bitişik ve iğne zona pellusida geçti kadar piezo-pulse uygulamak yerleştirin. Dikkatlice bir çekirdeği, iğne ucu hareket iğne, iğne ucu 2 / 3 iç kadar oosit içine itmek. Oosit membran biraz iğne, böylece küçük bir negatif basınç uygulayın. </li><li> Bir sonraki adım, oosit aslında "açık" olduğu zaman sadece zaman olduğundan çok kritik. Piezo bir tek darbe uygulayın pozitif basınç uygulayarak iğne çekirdeğini dışarı itmek, iğne ucu oosit yaklaşık 1 / 3 olacak şekilde dikkatlice geri çekin ve daha sonra uygulamak negatif basınç ve iğne geri çekmeye devam oosit mühür. Her oosit ile bu adımı yineleyin. </li><li> Bir grubun bütün oosit bir çekirdek aldıktan sonra, onlar KSOM-AA medya yıkanmış ve kültürü vardır. Oosit ile bu işlemi tekrarlayın. </li><li> Son grup en az 30 dakika KSOM-AA kültürleri edildikten sonra, SrCl2 içeren Ca-ücretsiz aktivasyon medya damlalar halinde SCNT-embriyolar transfer edilir. </li><li> Aktivasyon 6 saat sonra, pseudo-pronuclei miktarı (ÖNYTRLK) pozitif SCNT-embriyolar belirlenir. Embriyoların blastosist aşamasına ulaşana kadar sonra yıkanmış ve KSOM-AA kültür ek 3.5 gün düşer. </li><li> İlaçlar ya da tercih kimyasallar (trichostatin olarak A) aktivasyon ve kültür ortamı eklenebilir. </li></ol></li></ol> Embriyonik kök hücrelerinin, 3.Derivation SCNT-blastosist pseudo-hamile kadın (doğrudan ya da bir adım klonlama olarak da bilinir) içine aktarmak için ya da (aynı zamanda dolaylı ya da iki adım klonlama olarak da bilinir) embriyonik kök hücreleri elde etmek için kullanılabilir. Çok daha ES hücreleri oluşturmak için etkili olduğundan, biz iki adım prosedürü seçin. 5. bölümde açıklandığı gibi, bilim adamı doğrudan klonlama ilgilenen durumda blastosist pseudo-hamile kadınlar doğrudan transfer edilebilir. Embriyonik kök hücrelerinin türetme açıklayan birçok protokol vardır. Burada açıklanan bir besleyici hücreler ve fetal buzağı serumu kullanan standart bir teknik. <ol><li> ES hücre derivasyon için nükleer transferinden sonra ikinci gün, 96-U-plaka hazırlamak. </li><li> 96-U-plaka her kuyuya en az 10 dakika boyunca inkübe Jelatin, 100 mcL ekleyin ve daha sonra kaldırmak. </li><li> Çözülme besleyici hücreler ve tekrar süspansiyon ESD orta göre hacmi, 10 ml ESD orta ve hücre süspansiyonu 200 mcL 25 cm 2 lik bir alana denk örneğin besleyici hücreler yeniden süspanse jelatin ile tedavi edilen her birine eklenir. </li><li> Plaka 37 bir kuluçka ve kültür içine koyun ° C,% 5 CO 2. </li><li> 3,5 gün sonra, embriyoların blastosist aşamasına olmalıdır. </li><li> Birkaç damla ES hücre orta ve asidik thyrode kaplama steril bir bakteriyel bir yemek hazırlayın. </li><li> Blastosist normal ES hücre orta içeren damlalar halinde ilk KSOM-AA damla transfer ve iki kere yıkanır. </li><li> Asidik thyrode bir damla içine dikkatlice bir grup (5-10 blastosist) blastosist transferi ve orada zona pellusida eriyene kadar tutun. </li><li> Blastosist, sonra bir damla ile ES orta içine transfer iki kez yıkanır ve sonra besleyici kaplı 96-U-plaka (iyi birine bir blastosist) yerleştirilir. </li><li> Embriyolar daha sonra onları rahatsız etmeden bir kuluçka 5-7 gün 37 ° C,% 5 CO 2 kültüre. Bu bir embriyo zaman verirbesleyici tabaka ttach ve bir sonucudur oluşturmak için. </li><li> Her kuyuya ESD orta kaplama besleyiciler, 24 kuyucuğu hazırlayın, örneğin 12 mL ESD orta ve 50 cm 2 besleyici eşdeğer bir tekrar süspansiyon hale getirin ve her kuyuya hücre süspansiyonu 500 mcL ekleyin. </li><li> Dikkatlice embriyoların 96-U-plaka ESD orta kaldırmak, 250 mcL HEPES (PBS) ile iki kez iyice yıkayın, 50 mcL tripsin ekleyin ve 37 yaklaşık 5 dakika boyunca inkübe ° C </li><li> Akıbet tek bir hücre süspansiyonu, 37, 24 plaka ve inkübe içine transfer ° C,% 5 CO 2 ayrı düşmüş kadar, birden çok kez yukarı ve aşağı Pipet </li><li> ESC ESC türetme başarılı olursa, koloniler 7-10 gün sonra görünür olmalıdır. </li></ol> 4.Blastocyst enjeksiyon Blastosist enjeksiyon transgenik fare modelinde her türlü oluşturmak için rutin bir tekniktir. Blastosist sonraki transfer ve pseudo-hamile kadın içine enjeksiyon iyi zamanlanmış gerektiğini belirtmek önemlidir. <ol><li> PMS ve HCG ile Başbakan dişi farelerde bölüm 2.1 'de açıklandığı gibi. HCG enjeksiyonu, erkek fareler (kafes ortalama bir kadın ve bir erkek fare) ile birlikte dişi fareler koymak sonra. </li><li> Ertesi gün, fişler için kadın kontrol edin. Bu 0.5dpc (Days yazılan cinsel birleşmede) olarak sayılır. </li><li> Döllenmiş embriyolar, daha sonra, ek olarak 3 gün KSOM-AA bölüm 2.1 'de açıklanan ve kültürlü olarak yumurtalık izole edilir. </li><li> Blastosist enjeksiyon (3.5dpc) günü ES hücrelerinin hazırlayın. </li><li> ES hücrelerinin orta çıkarın, 37, HEPES (PBS) ile iki kez yıkamak tripsin ekleyin ve 5 dakika boyunca inkübe ° C </li><li> ES orta, bir tabak içinde plaka, 37, 45-60 dakika boyunca inkübe ° C,% 5 CO 2 besleyici hücreler (besleyici hücreler Embriyonik kök hücrelerin daha hızlı uymak) miktarını azaltmak için. Tripsinize hücreleri ile yeniden süspanse </li><li> Bir hücre süzgeç (40 veya 70 mikron) ile hücre süspansiyonu bir tüp içine aktarın ve 1000rpm az 5 dakika süreyle santrifüj. </li><li> Gerektiği kadar buz üzerinde 500 mcL ES orta ve mağaza supernatant, tekrar süspansiyon hücre pelletini çıkarın. </li><li> PVP ve HCZB içeren kaplama damla tarafından, steril bir bakteriyel çanağı kapak hazırlayın. </li><li> Cıva ile yükleme koymaktan ve PVP ile yıkanarak 15 mikron iğne hazırlayın. </li><li> Blastosist (10-30 blastosist) bir grup HCZB bir damla içine yerleştirin ve HCZB başka bir damla, 5-50 mcL ES hücre süspansiyonu (konsantrasyonu bağlıdır) ekleyin. </li><li> ES hücrelerinin (50-100 hücreleri) bir iğne ile toplayınız. </li><li> Blastosist damlasına kadar hareket ettirin. Blastosist yatay olarak aynı hizaya getirin ve bir vakum uygulanarak holding iğne ile düzeltmek. </li><li> Iç hücre kütlesi (ICM) 9:00 pozisyonunda kadar bir iğne kullanarak blastosist açın. </li><li> 3 saat enjeksiyon iğnesi yerleştirin, iğne ucu hiç ES hücrelerinin olmadığından emin olun ve piezo-pulse zona pellusida ve trophectoderm blastocoel içine enjeksiyon iğnesi yoluyla nüfuz kadar geçerlidir. </li><li> ES hücreleri ICM sopa, böylece birkaç ES hücreleri (5-15 hücreleri) bırakın. Bir grubun tüm blastosist ES hücreleri ile enjekte edilmiş kadar devam edin. </li><li> Blastosist bir grup tamamlandıktan sonra, KSOM-AA iki kez yıkayın ve tüm blastosist enjekte kadar KSOM-AA ile bir damla tutmak. </li></ol> 5. Embriyo Transferi Pseudo-hamile kadın içine embriyo transferi, çok dikkatli ve araştırmacı enstitü kurallarına göre yapılması gereken gereken bir cerrahi işlem, temsil eder. <ol><li> , Dişi alıcı fareler uyuşturan, sağ alt kadranda tıraş ve dezenfekte edin. </li><li> Makas kullanarak cilt açın ve cilt periton ayrı. </li><li> (Kırmızı nokta) aracılığıyla periton yumurtalık bulun ve yumurtalık yakın periton açık. </li><li> Bir forseps kullanarak, dikkatli bir şekilde, yumurtalık kapmak ve rahim çekin. </li><li> Yaklaşık 10 blastosist kılcal ağız pipet bağlı bir grup seçin. </li><li> Bir forseps ile Fix rahim içine küçük bir iğne ile küçük bir bütün yumruk ve uterus lümenine blastosist kılcal yerleştirin. </li><li> Embriyoların rahim içine dikkatlice bırakın ve kılcal kaldırmak. </li><li> Rahim karın boşluğuna geri itin. </li><li> Periton kenarları bulun ve birkaç dikiş ile kapatın. </li><li> Birkaç zımba ile fare cilt kapatın. </li><li> Post-operatif ağrı, vücut ağırlığının mg başına 5 mg Carprofen yönetmek. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Somatik hücre nükleerB6CF1 arka planda önceden tanımlanmış T hücrelerinin transferi. Mutlak ve göreli SCNT blastosist elde edilen CD8 + T hücreleri ve embriyonik kök hücrelerinden oluşturulan embriyoların numaraları. <img src="/files/ftp_upload/2168/2168fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 SCNT embriyonik kök hücreleri enjekte kimerik farelerin Temsilcisi akım sitometri analizi. Kapısı ve sayısı (toplam CD8 + T hücreleri ortalama yüzde) kimerik farelerde spesifik CD8 + T hücrelerinin varlığını gösterir.

<ol><li>Schatz, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V%28D%29J+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Rev%22%5BJournal%5D)">V(D)J recombination.</a> Immunol. Rev. 200, 5-5 (2004).</li>
<li>Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R., R, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+TCR+expression+in+transgenic+mice+constructed+using+cDNA-based+alpha-+and+beta-chain+genes+under+the+control+of+heterologous+regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements.</a> Immunol. Cell Biol. 76, 34-34 (1998).</li>
<li>Eggan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+vigor%2C+fetal+overgrowth%2C+and+viability+of+mice+derived+by+nuclear+cloning+and+tetraploid+embryo+complementation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Hybrid vigor, fetal overgrowth, and viability of mice derived by nuclear cloning and tetraploid embryo complementation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 6209-6209 (2001).</li>
<li>Kishigami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significant+improvement+of+mouse+cloning+technique+by+treatment+with+trichostatin+A+after+somatic+nuclear+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Significant improvement of mouse cloning technique by treatment with trichostatin A after somatic nuclear transfer.</a> Biochem Biophys Res Commun. 340, 183-183 (2006).</li>
<li>Wakayama, T., Yanagimachi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cloning+with+nucleus+donor+cells+of+different+age+and+type%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Reprod+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse cloning with nucleus donor cells of different age and type.</a> Mol Reprod Dev. 58, 376-376 (2001).</li>
</ol>

Biz burada SCNT önceden tanımlanmış özgüllüğü transnuclear farelerde T hücreleri oluşturmak için kullanılan olabilir göstermiştir. Burada gösterilen olmasa da, bu tekniğin de önceden tanımlanmış özgüllük ile B hücreleri transnuclear fareler üretmek için kullanılabilir olmalıdır. Dikkate alınması gereken önemli bir şey fare zorlanma ve cinsiyet, enfekte veya aşı ve ilgi T veya B hücreleri izole etmek için kullanılır. T ve B hücreleri genel olarak çok düşük bir yeniden programlama verimliliği, istenilen haplotip F1 hibritler kullanmanızı öneririz. Donör hücre aynı zamanda seks belirler Çünkü, biz erkek farelerde T veya B hücre kullanmanızı öneririz. Bu üremek için daha kolay ve hızlı olan erkek farelerin, sadece erkek kimerik farelerin, germline yoluyla TCR veya BCR gönderemediği anlamına gelir. Birlikte ele alındığında, biz SCNT üzerinden bu epigenetik yeniden programlama immünolojik alan için büyük bir avantaj olacaktır fare modellerinde bir roman türünü oluşturmak için güçlü bir araçtır temsil düşünüyorum.

<table><tbody><tr><td>Alyuvar Lizis Tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>REF 352340</td><td></td></tr><tr><td>Gebe Kısrak Serumu (PMS)</td><td>Calbiochem</td><td>367222</td><td></td></tr><tr><td>İnsan Koriyonik Gonadotropini (HCG)</td><td>Calbiochem</td><td>230734</td><td></td></tr><tr><td>Hiyalüronidaz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4272</td><td>Tip IV-S</td></tr><tr><td>KSOM-AA</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-106-D</td><td></td></tr><tr><td>HCZB</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-173-D</td><td>Özel ortam</td></tr><tr><td>Aktivasyon için Ca-içermeyen ortam</td><td>EMD Millipore</td><td>MR-174-D</td><td>Özel ortam</td></tr><tr><td>SrCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>255521</td><td>100mM = 10x</td></tr><tr><td>AlbuMAX I</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11020-021</td><td></td></tr><tr><td>PVP</td><td>MP Biomedicals</td><td>102787</td><td>HCZB kullanarak %10'luk çözelti hazırlayın ve %0,1 AlbuMAX I ekleyin</td></tr><tr><td>Sitoşalazin B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td>500&amp;#x03BC;g/ml = 100x</td></tr><tr><td>Trikostatin A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8552</td><td>5mM = 1000x</td></tr><tr><td>Mineral Yağı</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td></td></tr><tr><td>Tutma iğnesi</td><td>Humagen</td><td>MPH-SM-30</td><td></td></tr><tr><td>Enjeksiyon ve transfer iğneleri</td><td>Humagen</td><td>4-15, 7-15, 15-15</td><td></td></tr><tr><td>Ağız pipeti</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Makas</td><td>Fine Science Tools</td><td>14088-10</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-10</td><td>veya benzeri</td></tr><tr><td>Yara Klipsi Uygulayıcı</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Yara Klipsleri</td><td>BD Biosciences</td><td>427630</td><td></td></tr><tr><td>Sütur</td><td>Ethicon Inc.</td><td>K871H</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30071.03</td><td>%15</td></tr><tr><td>Penisilin/Streptomisin</td><td>Lonza Inc.</td><td>17-602E</td><td>100x</td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>MP Biomedicals</td><td>101806</td><td>200mM = 100x</td></tr><tr><td>Esansiyel Olmayan Aminoasitler</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>11140050</td><td>100x</td></tr><tr><td>&amp;#946;-Merkapto&amp;#8211;etanol</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>21985-023</td><td>500ml'de 5&amp;#x03BC;l</td></tr><tr><td>LIF</td><td>EMD Millipore</td><td>ESG1106</td><td>1000x</td></tr><tr><td>MEK inhibitörü</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>9900L</td><td>Sadece ES türetimi için, ES ortamına ekleyin (final konsantrasyon 50&amp;#x03BC;M)</td></tr></tbody></table>

karşı Önceden tanımlanmış t hücre reseptör özgüllükleri transnuclear fare toxoplasma gondii scnt ile elde edilen

Transnuclear Mice with Pre-defined T Cell Receptor Specificities Against Toxoplasma gondii Obtained Via SCNT

Lenfositler, T hücreleri gibi, belirli bir özgüllük 1 ile bir alıcı oluşturmak için, genetik V (D) J rekombinasyon uğrarlar. Için transgenik farelerin bir yeniden düzenlenmiştir antijen-spesifik T hücre reseptör (TCR) T hücre gelişimi ve işlevi incelemek için vazgeçilmez bir araç olmuştur. Ancak, bu TCRS genellikle, yüksek afinite ile T hücreleri için kaçınılmaz seçer tekrarlanan antijen stimülasyonu, genellikle uzun vadeli kültürden sonra ilgili T hücreleri izole edilmiştir. TCR Rastgele genomik entegrasyon α-ve β-zinciri ve olmayan endojen rehberleri ifade ekspresyon seviyesi ve kinetik değişimlerine yol açabilir. Somatik hücre nükleer transferi yoluyla epigenetik yeniden programlama ilgi herhangi bir hücreden embriyonik kök hücreler ve fareler üretmek için bir araç sağlar. Sonuç olarak, epigenetik işaretleri sıfırlanır SCNT bilinen özgüllük T hücreleri uygulandığında, bu genetik V (D) J düzenlenmeleri, SCNT embriyonik kök hücreler (EKH) ve onlardan elde edilen farelerin aktarılır. Toxoplasma gondii karşı önceden tanımlanmış özgüllükleri T hücrelerinin deneysel olarak tanıtıldı genetik değişiklik yapmadan, kendi endojen lokusların spesifik TCR ifade fare modelleri oluşturmak için kullanılabileceğini göstermiştir. Göreli kolaylığı ve hız gibi transnuclear modeller elde edilebilir olan diğer hastalık modelleri yapımı için söz sahibidir.

Somatik Hücre Nükleer Transferi (SCNT) üzerinden epigenetik yeniden programlama önceden tanımlanmış T hücre reseptör (TCR) özgüllükleri fare modelleri oluşturmak için bir araç olarak kullanılabileceğini göstermektedir. Bu transnuclear fareler, endojen endojen organizatörü kontrol altında lokus karşılık gelen TCR ifade eder.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

T hücreleri gibi lenfositler, belirli bir özgüllüğe sahip bir reseptör üretmek için genetik V(D)J rekombinasyonuna uğrarlar1. Yeniden düzenlenmiş bir ... için transgenik fareler...

Antijen spesifik T hücresi reseptörleri için transgenik fareler, somatik hücre çekirdek transferi veya SCNT kullanarak önceden tanımlanmış T-hücresi reseptör spesifitelerine sahip fare modelleri oluşturmak suretiyle, T hücresi gelişimi ve fonksiyonunun incelenmesinde vazgeçilmez olmuştur. Bir fare, hedeflenen bir patojenle enfekte edilir. T hücreleri fareden izole edilir ve ardından floresanla aktive edilen hücre ayıklama yöntemiyle saflaştırılır.Saflaştırılmış T hücreleri daha sonra somatik hücre çekirdek transferi için kullanılır. Embriyolar blastosist aşamasına ulaştıktan sonra, embriyonik kök hücreler izole edilir. Bu hücreler daha sonra, yalancı gebe farelere transfer edilecek olan blastosistlere enjekte edilir.Elde edilen yavrular, PAX analizi ile doğrulanabilen, ilgili T-hücresi popülasyonunda belirgin bir artış göstermektedir. Merhaba, adım Okta AK ve White Biyomedikal Araştırma Enstitüsü'nde doktora sonrası araştırmacıyım. Bugün size somatik CLE transfer blast asist enjeksiyonlarının yanı sıra embriyo transferinin nasıl gerçekleştirileceğini göstereceğim.Somatik transferin temel avantajı, T-hücre reseptörlerini endojen lokus üzerinden ve dolayısıyla endojen promotör kontrolü altında eksprese eden fare modellerinin oluşturulabilmesi ve bu modellerin çok hızlı bir şekilde üretilebilmesidir. Somatik sıvı transferi, önceden tanımlanmış T-hücre reseptörü veya B-hücre reseptörü özgüllüklerine sahip fare modelleri geliştirmek için bir araç olarak kullanılabilir. Bu durum, otoimmünite, enfeksiyöz hastalıklar ve kanser gibi alanlarda çalışan araştırmacılar için özel bir önem taşımaktadır.Toxoplasma gondii gibi bir patojene özgü T hücrelerini izole etmek için, immün yanıtın zirve noktasında intraperitonal enjeksiyonla enfekte edilmiş farelerin ötanazisi sonrası dalak izole edilir; ardından homojenize edilen donör hücreler izole edilerek floresan işaretli antikorlar ve uygun tetramer ile inkübe edilir. Son olarak, patojene özgü T hücrelerini elde etmek için FACS ayıklama işlemi gerçekleştirilir. Oosit enükleasyon prosedüründen önceki akşam.Bir şırınga kullanarak dört, beş ve yedi mikrometre pikoenjeksiyon iğnelerini cıva ile retrograd şekilde doldurun. Ertesi gün, önce oositleri toplayarak, ardından bir ağız pipeti kullanarak bunları bir Petri kabındaki K-S-O-M-A-A ortamı damlacıklarına aktararak somatik hücre çekirdek transferi protokolüne başlayın. Petri kabının kapağında.Yaklaşık 10 damla PVP, mililitre başına beş mikrogram cyto B içeren yaklaşık 10 damla HCZB ve mililitre başına 2,5 mikrogram cyto B içeren yaklaşık 10 damla HCCB yerleştirerek somatik hücre çekirdek transferi veya SCNT gerçekleştirmek için bir plaka hazırlayın. Bu plaka S-C-N-T-A plakası olarak adlandırılacaktır. S-C-N-T-A plakasını bir ters bileşik mikroskobun tablasına yerleştirin.Ardından, yedi mikrometre çapında bir enükleasyon iğnesini mikro manipülatöre yerleştirin ve PVP çözeltisi içine beş ila 10 kez çekip boşaltarak yıkayın. Sonra, Petri kabındaki 10 ila 30 adet metafaz II evresinde durdurulmuş oositleri, S-C-N-T-A plakası üzerindeki beş mikrogram/mL Cyto B içeren HCCB damlalarından birine aktarın. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin; inkübasyon sırasında oositleri yatay olarak hizalayın.Beş dakika geçtikten sonra, bir oositle tutma iğnesinin önüne yerleştirmek için enükleasyon iğnesini kullanın. Bir mikro enjektör kullanarak, oositi mikro pipet tutma iğnesine sabitlemek için vakum uygulayın.Ardından, enükleasyon iğnesini kullanarak, op plazmaya kıyasla hiper transparan görünen kromozom iğ etkisi kompleksi saat üç pozisyonuna gelene kadar oositi döndürün; zona lucida'yı delmek için pedala basarak bir pizo darbesi başlatın. Pizo darbesi, boylamsal olarak ilerleyen ve nükleasyon iğnesinin ucunu titreştiren mekanik bir darbedir. Uç titreşimleri, zona lucida'nın delinmesine yardımcı olur.Zona pellucida geçildikten sonra, nükleasyon iğnesinin ağzını metafaz iki iğine yakın bir konuma yerleştirin ve vakumu uygulayın. Kromozom iğ kompleksi yavaşça iğnenin içine hareket edecektir. İğne çıkarıldığında, membran kendini kapatmalıdır.Son olarak, ağız pipeti kullanarak enükle edilmiş sitleri tekrar K-S-O-M-A-A damlacıklarına aktarın. Ardından, aynı pipeti kullanarak onları KSOM AA damlacıkları arasında birinden diğerine aktararak yıkayın. Nükleer transferi gerçekleştirmek için mikromanipülatör üzerindeki yedi mikrometrelik enükleasyon iğnesini dört ila beş mikrometrelik bir nükleer transfer iğnesiyle değiştirin. İğneyi daha önce olduğu gibi PVP ile yıkayın.Daha önce izole edilen sekiz pozitif T hücresini S-C-N-D-A plağı üzerindeki bir PVP damlasına yerleştirin. İyice karıştırın ve oda sıcaklığında en az 10 dakika inkübe edin. Ardından, 10 ila 30 ENÜKLEASYON geçirmiş sitle hücreyi, 2.5 µg/mL konsantrasyonundaki bir HCZB damlasına aktarın.S ct. A plakası üzerindeki Cyto B'yi oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında, enjeksiyon iğnesini kullanarak sitleri nükleer transfer iğnesi ile yatay olarak hizalayın.PVP ortamından donör bir CD8 pozitif hücre seçin ve dış membran parçalanana kadar hücreyi içeri çekip dışarı bırakın. Gerekirse, membranın vele sitozolün fragmanları görünür hale gelene kadar bir piezo darbesi uygulayın. Çekirdeği iğnenin içine çekin.Ardından, 10 ila 30 adet olana kadar çekirdekleri toplamaya devam edin. Sonrasında, hizalanmış enükle edilen oositleri içeren damlaya geçin. Bir oositi tutma iğnesine sabitlemek için vakum uygulayın.Ardından, NU nükleer transfer iğnesini, çekirdekler açıklıktan uzağa bakacak şekilde zop lucita'nın yanına yerleştirin. İğne zop lucita'nın içinden geçene kadar pizo darbesi uygulayın. Bir çekirdeği dikkatlice iğnenin ucuna taşımak için mikro manipülatörü itin.İğnenin ucunun üçte ikisi içeri girene kadar iğneyi oositin içine itin. Oosit membranının küçük bir kısmının iğnenin içine girmesi için hafif bir negatif basınç uygulayın. Bir sonraki adım oldukça kritiktir.Oositin gerçekten açık olduğu tek an olduğu için, tek bir ZO darbesi uygulayın. Ardından, çekirdeği iğneden dışarı itmek için pozitif basınç uygulayın.İğne ucunun yaklaşık üçte biri oositin içinde kalacak şekilde iğneyi dikkatlice geri çekin, ardından negatif basınç uygulayarak iğneyi çekmeye devam edin. Oositi mühürlemek için bu adımı her bir oosit için tekrarlayın.Tüm oositler çekirdek aldıktan sonra, bunları Petri kabına aktarın ve 37 °C'de en az 30 dakika inkübe edilmiş KS OM AA medyumu damlacıkları arasında sırayla aktararak yıkayın. İnkübasyonun ardından, SCN T embriyolarını stronsiyum klorür içeren kalsiyumsuz aktivasyon medyumu damlacıklarına aktarın. Stronsiyum klorür, döllenme sırasında meydana gelecek olan kalsiyum osilasyonlarını tetikleyerek oositi aktive eder.Altı saat boyunca inkübe edin. İstenirse, aktivasyon besiyerine histon deasetilazların spesifik olmayan bir inhibitörü olan TSA EKLEYİN. Aktivasyon sonrası verimliliği artırmak için, psödo pronükleus veya PPN pozitif SCNT embriyolarının miktarını belirlemek amacıyla embriyoları ters mikroskop altında inceleyin. PPN'ler, görünümlerine göre tanımlanabilir.Yumurtaya benzerler. Sarısı yukarıda kalacak şekilde yıkanır ve kültüre alınır. Embriyolar, blastokist aşamasına ulaşana kadar 37 °C'de üç buçuk gün boyunca K-S-O-M-A-A damlaları içinde tutulur.Başlangıçta, size az önce gösterdiğimiz nüklasyon ve NU nükleer transfer prosedürlerini doğru şekilde uygulamaya odaklanmalısınız. Bu tekniklerde uzmanlaştıktan sonra, sonraki prosedürleri yönetmek daha kolay olacaktır. Burada kullanılan embriyonik kök veya ES hücreleri, standart teknikler kullanılarak türetilmiştir.Bunlar, çiftleşmeden üç buçuk gün sonra, blast destekli enjeksiyon gününde hazırlanmalıdır. PVP ve HCZP içeren damlalar damlatarak steril bir bakteri tabağının kapağını hazırlayın. Ardından, daha önce olduğu gibi pico-pulse için 15 mikrometre boyutunda bir enjeksiyon iğnesi hazırlayın.Ardından, enjeksiyon iğnesini mikro manipülatöre yerleştirin ve PVP transferi ile yıkayın. HCZB damlası içine 10 ila 30 blast yardımı uygulayın. Daha sonra, beş ila 50 µL ESL süspansiyonunu başka bir HCZB damlasına yerleştirin.ES hücreleri kolayca alınabilecek miktarda olmalı ancak çok yoğun olmamalıdır. Ardından, enjeksiyon iğnesiyle 30 ila 100 ES hücresi alın. Blast assist damlasına doğru ilerleyin.Blastosist yardımcısını yatay olarak hizalayın ve vakum uygulayarak tutma iğnesiyle sabitleyin. İç hücre kütlesi saat dokuz yönüne gelene kadar blastosist yardımcısını döndürmek için enjeksiyon iğnesini kullanın. Enjeksiyon iğnesini saat üç yönüne yerleştirin.İğnenin ucunda ES hücreleri olmadığından emin olun ve enjeksiyon iğnesi zona pellucida'yı ve trifecta'yı geçerek blastosel'e girene kadar bir piko pulse uygulayın. İç hücre kütlesine yapışmaları için beş ila 15 ES hücresi bırakın. Tüm blastosistler enjekte edilene kadar işleme devam edin; enjeksiyonlar tamamlandıktan sonra işlemi bitirin.K-S-O-M-A-A ile iki kez yıkayın ve psödo gebeli dişilerle cerrahi embriyo transferine geçin; anestezi uygulanmış psödo gebe alıcı fareyi cerrahi alana yerleştirin. Elektrikli tıraş makinesi kullanarak sağ alt kadranındaki tüyleri temizleyin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, bölgeyi iyot bazlı bir solüsyon ve %70 etanol kullanarak dezenfekte edin.Deriyi açmak için makas kullanın, ardından kapalı makası deri ile periton arasına yerleştirip açarak peritonu deriden ayırın. Periton aracılığıyla, kırmızı bir nokta şeklinde görünmesi gereken yumurtalığı bulun. Ardından, bu bölgedeki peritonu açmak için makas kullanın.UCT'yi veya çevresindeki yağı dikkatlice kavramak için pens kullanın ve ağız pipetine bağlı bir kapiler yardımıyla uterusu dışarı çekin. Ovidukt ve uterusu pensle tutarak yaklaşık 10 blastosistten oluşan bir grubu alın. Uterusta küçük bir delik açmak için bir iğne kullanın.Ardından, blast assist içeren kılcal boruyu uterus lümenine yerleştirin ve serbest bırakın. Uterusu tekrar abdominal boşluğa itin. Peritonun kenarlarını bulun ve birkaç dikişle kapatın.Fareyle cilt kesisini birkaç zımba ile kapatın. Ağrı kesiciyi deri altına uygulayın. Ardından fareyi, bir ısıtıcı lamba altındaki kafesine geri yerleştirin.Fare uyanana kadar solunumu takip edin. Enükleasyon ve somatik hücre çekirdek transferini takiben, embriyoların yaklaşık %70'i psödo pronükleus için pozitifti.Bu şekilde gösterildiği üzere, 6 veya 10 saatlik TSA uygulaması herhangi bir etki yaratmamıştır. Kültürde üç buçuk gün sonra, embriyoların %5 ila %10'u blastokiste dönüşmüştür.Yeniden, TSA eklemesinin blastokist gelişme hızına herhangi bir etkisi olmamıştır. SCNT blastokistleri daha sonra embriyonik kök hücreler elde etmek için kullanılmıştır. TSA, ESL'lerin blastokistlerden türetilme oranını önemli ölçüde artırmıştır.S-C-N-T-E-S hücreleri, kimera farelerin oluşturulmasında kullanılır. Bu farelerden kan alınır ve burada gösterildiği gibi akış sitometrisi kullanılarak belirli T hücrelerinin varlığı analiz edilir. Kan, anti CDA antikoru ve spesifik tetramer ile boyandığında, çift pozitif bir popülasyon tanımlanabilir.SCNT için kullanılan donör hücrenin doğru özgünlükte olduğunu göstermektedir. Size somatik hücre LU transferinin, blast yardımcısı enjeksiyonların ve embriyo transferinin nasıl gerçekleştirileceğini göstermiş oldum. Dikkat edilmesi gereken en önemli nokta, T-hücrelerinizin veya B hücrelerinizin saflığıdır.Somatik transferin nasıl gerçekleştirileceğini öğrendikten ve embriyolarınız blastokist evresine ulaştıktan sonra, bunları doğrudan yalancı gebe dişilere transfer etmeyi veya embriyonik kök hücre türetmek ve kimera fareler üretmek için kullanmayı seçebilirsiniz.

transnuclear-mice-with-pre-defined-t-cell-receptor-specificities

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz retroviral transdüksiyon kullanarak fare antijen spesifik T-hücrelerinin üretmek için bir protokol...

Fare T-hücrelerinin, T-hücre reseptörleri retroviral İletimi

Indüklenmiş pluripotent kök (iPS) hücrelerden T lenfositlerin Nesil T hücre tabanlı immünoterapi için embriyonik kök hücreler kullanarak alternatif bir yaklaşım verir. Yöntem kullanılarak ya da...

T Lenfositler doğru İsteyerek Pluripotent Kök Hücrelerinin Yönetmen Farklılaşma

Hümanize fareler kullanılarak tümör spesifik T hücrelerin oluşturulması ve karakterizasyonu burada tanımlanmıştır. İnsan timik doku ve genetiği değiştirilmiş insan hematopoietik kök hücrelerin bağışıklığı baskılanmış farelere nakledilmektedir. Anti-tümör bağışıklık yanıtı in vivo incelenmesi için izin veren bir mühendislik insan bağışıklık sisteminin sulandırma ile sonuçlanır.

Bir Kök Hücre tabanlı Gen Terapisi Tümör Modeli olarak BLT Insanlaşmış Fare Kullanma

Ex vivo Fare neuroepithelium Tek Hücre Bölümler Canlı Görüntüleme

Bu protokolü kullanarak, biz görselleştirme ve encysting parazitin enfekte nöron arasındaki mekansal ilişkinin analizini sağlayan parazit Toxoplasma gondii ile enfekte farelerde görüntü 160 mikron kalınlığında beyin bölümlerine başardık.

Nöronlar 3-D Görüntüleme ve Analiz Enfekte İn Vivo Ile Toxoplasma gondii

İkili bir genetik stratejiden yararlanarak, Cre aracılı rekombinasyondan sonra tamamlayıcı transsinaptik izleyicileri eksprese eden farelerde nöral devre izleme için ayrıntılı bir protokol sağlıyoruz. Hücreye özgü izleyici üretimi genetik olarak kodlandığından, deneysel yaklaşımımız, murin embriyonik beyin gelişimi sırasında tek hücre çözünürlüğünde nöral devrelerin oluşumunu ve olgunlaşmasını incelemek için uygundur.

Embriyonik Fare beyninde İzleme Koşullu Genetik transsinaptik

İleri genetik, hücre otonom bağışıklığına direnç için önemli olan hücre içi patojenlerdeki genleri tanımlamak için güçlü bir yaklaşımdır. Mevcut yaklaşım, bağışıklık kaçışı için önemli olan yeni Toxoplasma gondii genlerini tanımlamak için doğuştan gelen bağışıklık hücrelerini, özellikle makrofajları kullanır.

İleri Genetik tanımak makrofajlar kullanılarak Ekranlar<em&gt; Toxoplasma gondii</em&gt; Genler önemli direnç için IFN-γ-bağımlı hücre otonom bağışıklık

Enterik sinir sistemi, bağırsağı çoğaltan, göç eden ve kolonize eden nöral krest hücreleri tarafından oluşturulur. Nöral krest hücreleri, nörotransmitter fenotiplerine özgü belirteçlerle nöronlara farklılaşır. Bu protokol, enterik sinir sistemi nörotransmitter ekspresyonunu görselleştirmek için murin embriyonik gastrointestinal sistemin diseksiyonu, sabitlenmesi ve immün boyanması için bir tekniği tanımlar.

Fare Enterik Sinir Sistemi Geliştirme gözünüzde canlandırın için immün

Tek bir T hücre reseptörü (TCR) retroviral tabanlı in vivo ekspresyon sistemi için hızlı ve esnek bir protokol sunuyoruz.  Retroviral vektörler, TCR transgenik farelere alternatif olarak in vivo olarak tek bir TCR'nin T hücresi gelişimini ve işlevini incelemek için kemik iliği progenitör hücrelerini dönüştürmek için kullanılır.

Kemik iliği projenitör hücrelerinin retroviral İletimi T-hücre reseptör Retrogenic fareler üretmek için

Burada sunulan canlı fare oküler yüzey görüntüleme için bir multifoton mikroskobik platformdur. Floresan transgenik fare hücre çekirdekleri, hücre zarları, sinir lifleri ve oküler yüzey içinde kılcal damarların görüntülenmesi sağlar. Kolaj nasyonal yapılardan elde edilen doğrusal olmayan ikinci harmonik nesil sinyalleri stromal mimariler için etiketsiz görüntüleme sağlar.

Fare Kornea ve Konjonktiva Canlı Görüntüleme için Özel Multifoton Mikroskop platformu

Bu makale, insana özgü bir anti-CD19 monoklonal antikorun radyo-etiketlenmesi için metodolojiyi ve bunun in vivo PET görüntüleme, ex vivo gama sayımı ve otoradyografi yaklaşımlarını kullanarak bir fare multipl skleroz modelinin periferik dokularındaki B hücrelerini ölçmek için nasıl kullanılacağını detaylandırmaktadır.

Pozitron Emisyon Tomografisi Kullanılarak Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Fare Modelinde CD19+ B Hücrelerinin Görüntülenmesi

Öğrenin, somatik hücre çekirdek aktarımı ile T hücre reseptörü spesifikliği önceden tanımlanmış transgenik fare modelleri nasıl üretilir. Bu yöntem, otoimmünite, enfeksiyon hastalıkları ve kanser araştırmalarında kullanılır.

Karşı Önceden tanımlanmış T Hücre Reseptör özgüllükleri Transnuclear Fare Toxoplasma gondii SCNT ile Elde Edilen

Daha fazla video keşfet