Name: VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-13T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Öğrenin Drosophila embriyolarını dik konumda görüntüleme yöntemini; konfokal mikroskopiyle kesit analizi ve gen ifadesi ölçümü için gliserin jel kullanılır. Bu teknik gelişim biyolojisi araştırmalarında hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar Deborah Harris ve Danielle MacKay özellikle borçlu. Bu iş için destek ve CWRU Sanat ve Sosyal Bilimler Fakültesi Biyoloji Bölümü tarafından sağlanan ve biyolojik bilimler alanında lisans eğitimi desteklemek için HHMI hibe numarası 52005866.

1. Görüntüleme Metodoloji <ol><li> Homojen bir sıvı hale gelene kadar 20-30 dakika boyunca 55 ° C derecede su banyosunda jöle gliserin eritin. Girdap, ancak kabarcık oluşumunu önlemek için, şişe sallamayın. </li><li> Jöle erir iken, gliserol, temiz bir cam slayt (isteğe bağlı) bir Kimwipe kullanılarak ince bir tabaka uygulanır. </li><li> Eritilmiş gliserin Pipet 1 ile 1,5 ml sütü slayt yüzeyde ince bir katman yaratmak için bir kesim P1000 pipet kullanarak. Kabarcıkları önlemek için dikkatli bir şekilde Pipet. </li><li> Jöle yatay bir yüzey üzerine 5 dakika, 5 dakika sonra -20 ° C'de slayt yerleştirmek ve embriyo uyumuna devam katılaşmaya. Alternatif olarak, Saran Wrap slayt kapak ve 5 güne kadar 4 ° C'de yerleştirin. </li><li> Pipet jöle yatak tarafında% 70 gliserol / PBS veya diğer antifade gliserol tabanlı montaj ortam (örneğin Slowfade veya Vectashield) lekeli embriyoların küçük bir damla. </li><li> Jöle yüzeyine açılan tek tek aktararak embriyolar ön hizalama başlayın. Eğimli tarafı bir kaşık kullanarak, eğimli bir derialtı iğne kullanarak aktarabilirsiniz. </li><li> Kabaca embriyoların 2 ile 3 sütun boyunca yerleştirin. Bir embriyo iğne takılıyor içeren diğer embriyolar serbest bırakmak için açılan karıştırın. Bu noktada dikkatli bir şekilde hizalamak zaman israf etmeyin. Sütunlar arasında biraz boşluk bırakın. </li><li> Derialtı iğne yardımı ile jöle orta yatay sürgülü embriyolar hizalayın. Iken sürgülü, yönlendirmek, aynı yönde başları ve kuyrukları. Sütun boyunca birbirine paralel olun. Bükülmüş Kimiwipe bir parça bir iz olarak sol PBS gliserol fazla çıkarın. Not: Fazla gliserol, iki jöle tabakalarının ayrılması zor kesilmiş ve monte etmek için, embriyolar jel içinde gevşek kaplı olması neden olacaktır. Tersine, çok gliserol kaldırarak kuru ve embriyolar dümdüz olacak. </li><li> Embriyolar (50-150 mcL kaç uyumlu hale getirilmiştir bağlı olarak) üzerinde ince bir tabaka jöle yaymak için bir kesme sarı ucu kullanın. </li><li> Yeri -20 ° C derin dondurucuda 10-20 dakika süreyle 4 ° C gecede slayt veya depolamak. Jöle tamamen kesmeden önce sert emin olun. Aksi takdirde, embriyo blok tüketim için çok zor olacak. Kesim için en iyi sonuçları ertesi gün elde edilir. </li><li> Diseksiyon kapsamında, jöle ile hizalanır embriyoların her iki tarafta tamamen kesmek için jilet kullanın. Jileti düz kesimler yapmak için bir 90 ° açıyla tutun. Önlemek için aşırı jöle görüntüleme engel olabilir embriyoların ön ve arka kutupları çok yakın kesimler yapılmalıdır. </li><li> 100-200 mcL soğuk PBT (4 ° C, PBS +0.1% Tween 20) keser ve dikkatlice bir spatula ile embriyoları arasında jöle kazıyın. Not: PBT olarak deterjan, jöle embriyoların zarar vermeden slayt çıkarılması yardımcı olur. </li><li> Bir iğne kullanarak, daha fazla kesim için temiz bir slayt gömülü embriyolar ile jöle blok transferi. 5-7 embriyolar ile küçük blokları kesin. PBT jöle blok etrafında kolayca taşımak için kullanın. Alternatif olarak, tam gerekirse, jöle kırparak için daha fazla istikrar yaratan cam, verdikleri izin vermek, kuru bir cam yüzey blok yerleştirin. </li><li> Dik bir jilet ve bir iğne yardımı ile jöle gömülü embriyolar çevirin. Mikroskop altında görselleştirme için kullanılan standı mikroskobun tipine göre, aşağıdaki iki adım ikisinden biri ile devam edin. </li><li> Ters mikroskop yer dik bir pozisyonda embriyolar, embriyo blokları uzun bir lamel üzerine tamamladı. Jöle en az miktarı ile embriyonun tarafına amacı ile daha yakın temas halinde olmasını sağlamak. </li><li> Dik mikroskop: "destekler" olarak kullanılan ve "destekler" arasında gliserol embriyo blok superglue ile yapıştırılmış dört # 1 lamelleri ile iki yığınlarının olun. Uzun bir lamel kullanarak yığınları Köprüsü. </li><li> Konfokal analizi için kullanılacak hedefleri bulmak için çalışma mesafesi kontrol görüntü embriyo ile tüm yol ya da sadece kısmen olsun. Örneğin, D. melanogaster embriyolar ~ 0.55 mm uzunluğunda ve tamamen Zeiss 20x Plan-Apo veya 40x LD Neo-Fluor amacı kullanarak görüntülü olabilir. Aşağıdaki web sitesi mevcut Zeiss hedefleri hakkında bilgi ve çalışma mesafelere göre hedefleri arama seçeneği sunar: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php </li></ol> 2. Temsilcisi Sonuçlar Embriyoların değişmeden kalır, çünkü bu yöntem, embriyonun büyüklüğü ve gen ekspresyonu arasındaki mesafelerin hassas ölçümler yapmak üzere kullanılabilir. Şekil 1, biz nükleer leke DAPI (mavi), anti-Dorsal protein (kırmızı), sog mRNA (sarı) ve sna mRNA (yeşil) ile boyanmış bir blastodermin dönem embriyoların göstermektedir. Morfolojik süreçses, mezoderm invajinasyon (Şekil 2A, B) ve mezodermal hücreler (Şekil 3 ve 4) göç gibi aynı zamanda bu yöntemi kullanarak görüntülenmiştir olabilir. DV ekseni boyunca Farklı bir Z-pozisyonları Şekil 2-4 gösterildiği gibi, odak düzlemi değiştirerek elde edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Blastodermin aşamasında sağlam embriyonun Dik optik dilim mRNA ve protein çift boyama. Yerinde sondalar (sog ve SNA) ve primer antikor (anti-Dorsal) ile boyanan protein Hedef mRNA'ların rakam gösterilir. DAPI çekirdekleri etiketlemek için kullanılmıştır. Sog ve sna ifade Dorsal ifade nükleer iken, sitoplazma apikal yer olduğunu unutmayın. Çekirdekleri bulunmaktadır sog doğmakta olan transkript güçlü sinyaller de bu büyütme görülebilir. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Sağlam bir gastrulating embriyo Dik görüntüleme. MRNA problar kullanılır ve kendi renkleri resimde belirtilmiştir. A) Bu aşamada, üç gen aynı Florlu (yeşil sna, sog ve DPP) ile boyandı Not mekansal olarak ayrılmış alanlar olarak ifade edilir. Invaginating mezoderm sna ifade neuroblast tabakası ind ifade ve sog ifade hala sinir sistemi ventral bölgelerinde mevcut ise ektoderm, DPP ifade eder. B) aynı embriyo konfokal daha derin bir düzlemde şiddetle sna ifade invaginating mezoderm taban notu, ancak apikal bölgenin düşük seviyelerde ifade. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Salyangoz, ind ve DPP mRNA'ların (yeşil), dorsal protein (kırmızı); mikrop bant ile sağlam embriyonun Dik görüntüleme sog RNA (sarı) genişletilmiş. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyandı. Embriyonun baş yakınındaki A) Odak düzlemi. B), aynı embriyonun gövde bölgede başka bir odak düzlemli. Ventral orta hatta yakın bir mikrop-band uzatılmış embriyonun her iki tarafta yalan yanal göç önce mezodermal hücreler (Şekil 4 karşılaştırmak) Not kitle. Yaymaksızın neuroblasts yeşil (ind ve sna) etiketlenir. <img src="/files/ftp_upload/2175/2175fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Dik görüntüleme germ bant uzatma süresi boyunca sağlam bir embriyo sog RNA (sarı), salyangoz, ind ve DPP mRNA'ların (yeşil), dorsal protein (kırmızı). A), epitel (ok) yaymaksızın neuroblasts Not Bu aşamada (yeşil) ind ve sna hem boyandı. Sog kısıtlı ifadesi ventral orta hat (sarı) de unutmayın . Bu aşamada DPP İfade embriyo (yıldız) lateral kenarlarında görülebilir. B) aynı embriyo Optik bölüm sonuna yakın, orta-arka bölgeye karşılık gelen embriyo uzunluğu, A gösterilir. Ventral orta hat hücreleri sog lekeli.

<ol><li>Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+processing+and+analysis+for+quantifying+gene+expression+from+early+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos.</a> Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).</li>
<li>Grβhans, J., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+link+between+morphogenesis+and+cell+division+during+formation+of+the+ventral+furrow+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila.</a> Cell. 101, 523-531 (2000).</li>
<li>Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+detection+of+RNA+expression+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos.</a> Science. 305, 846-846 (2004).</li>
<li>Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((End-on+imaging%3A+a+new+perspective+on+dorsoventral+development+in+Drosophila+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos.</a> Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).</li>
<li>Zander, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+mounting+delicate+bryophytes+in+glycerol%5BTitle%5D)+AND+%22The+Bryologist%22%5BJournal%5D)">On mounting delicate bryophytes in glycerol.</a> The Bryologist. 100, 380-382 (1997).</li>
<li>Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+imaging+of+the+Dorsal+nuclear+gradient+reveals+limitations+to+threshold-dependent+patterning+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).</li>
</ol>

Dilimleri 2 veya genellikle floresan renklendirmeler için zararlı mikrotom işleme, gömülü medya kullanımı ya dikkatli bir yandan diseksiyonu gerektirir beri Drosophila embriyoların kesit görüntüleri almak zor olabilir. Alternatif olarak, Z-Konfokal mikroskop yapılan yığınları kesit görüntülerin 3 boyutlu rekonstrüksiyon yapmak için kullanılabilir. Ancak, doğru bir 3 boyutlu rekonstrüksiyon ve photobleaching sorunlu olur, birkaç ince Konfokal dilim yapmak için zaman alıcı. Boylamasına monte edilmiş görüntüleme embriyolar, aynı zamanda, protein ya da mRNA seviyeleri 1 ölçümü amacıyla floresan sinyallerin hassas ölçümler alarak karmaşıklaştırır embriyo, daha derin bölümleri ulaşıldığında meydana gelen ışık saçılması başka endişe konusu. Hatta bir iki foton konfokal mikroskop, ışık saçılması hala sınırlı olmak üzere en iyi örnek şeffaflık için montaj medya seçimi yapar embriyo, ortasında sarısı malzeme opaklık nedeniyle bir konudur. Bu sorunları aşmak için, dikey konumlandırma embriyoların &quot;End&quot; görüntüleme adı verilen yeni bir tekniği son 4 canlı ve sabit örnekleri görüntü için geliştirilmiştir . Bu çalışmada, biz yerinde sondalar 3 birden fazla lekeli herhangi bir boyut ve şekil sabit embriyolar veya dokular basit bir hazırlık ve görselleştirme sağlayan dikey olarak monte edilen embriyolar için yeni bir protokol geliştirmiştir. Bizim yöntemi jelatinimsi bir tutarlılık içinde uyumlu embriyoların kaplamak için kullanılır montaj medya kullanılarak oluşur. Konfokal mikroskop her türlü görüntüleme önce gömülü embriyoları içeren bu montaj medya kesme taş blokların dik olarak konumlandırılmış olabilir. Embriyoların jöle içine gömme ve dikey olarak konumlandırma, embriyonun dorsal-ventral eksen boyunca hücreler aynı anda sunulduğu mikroskopisi kullanılarak yatay kesitler almak mümkün. Bu ışık saçılması ve boylamasına monte edilmiş embriyolar geleneksel Z-yığın yeniden yapılanma oluşur floresan boyaların photobleaching artık ortadan kalkar sorunları beri kantifikasyon amaçlar için önemli bir gelişme. Dorsal-ventral zıt pozisyonlarda bulunan hücreler aynı anda ve aynı konfokal Z-pozisyon imaged Böylece, dorsal-ventral eksen boyunca gen ekspresyonu veya protein düzeylerinin ölçümü, doğru. Buna ek olarak, açıklanan yöntem bize DV 6 eksen boyunca farklı pozisyonlarda hücreleri görselleştirmek için karmaşık hesaplama unrolling yöntemleri kullanmadan, 3-D bir embriyonun dorsal-ventral eksen boyunca tam bir 2-D görüntü elde etmesini sağlar. Bazı kritik adımlar, iki tabaka jöle arasında bölünmüş önlemek için, embriyolar hizaladıktan sonra aşırı gliserol kaldırarak içerir. Ancak, örnek çok susuz ise, elde edilen görüntü şekilsiz olabilir ve yanlış morfoloji var. Buna ek olarak, embriyonun çevresindeki jöle orta yerine düz bir açıyla kesilmiş ise, ortaya çıkan görüntü, 90 derece dışında bir açıyla embriyoların yanlış bir konumlandırma şekli nedeniyle, daha yuvarlak ve daha fazla yumurta görünebilir. Son olarak, jöle, ön / arka ucunda embriyonun yeterince yakından kesmek değilse, amacı, çalışma mesafesi esas jöle ve embriyo içine odaklanmak için kullanılır, çünkü uygun bir görüntü elde etmek mümkün değildir. Önemli bir adım daha görüntüleme geç gastrulating embriyo hizalayarak önce dikkatlice kapsamında ilgi aşamaları sıralamak için zaman gerekli olabilir. Genellikle uzunlamasına bir pozisyonda en kolay kabul edilebilir morfolojik özelliklerine göre, embriyolar sahnelenir. Bu yöntem ile yapılabilir alternatif değişiklikler arasında, bir anti-solmaya reaktifi (örneğin, p-Phenylenediamine&#39;nin veya PPD), floresan boya photobleaching karşı korunmasına yardımcı, jöle, ikinci katmanı içine dahil etmektir.

<table><tbody><tr><td>Gliserin Jöle montaj ortamı</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>17998-10</td><td>Koruyucu olarak düşük konsantrasyonda fenol içerir ve çekep altında veya iyi havalandırılan bir alanda kullanılmalıdır. Kendi ortamınızı hazırlamak için gereken tarif Zander, 1997'de açıklanmıştır.</td></tr><tr><td>Zeiss LSM 700 Konfokal</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td>Şu objektifler kullanılmıştır: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm).</td></tr><tr><td>%0.1 Tween 20 içeren fosfat tamponlu salin (PBT)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cam mikroskop lamları</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Cam lameller</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72204-02</td><td>Boyut 1 &amp;#189; (bu çalışmada kullanılan objektiflere özeldir).</td></tr><tr><td>Cam lameller (destek yapmak için)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-10</td><td>Süper yapıştırıcı ile yapıştırılmış dört lamel kullanın.</td></tr><tr><td>Diseksiyon mikroskobu</td><td>M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Jilet</td><td></td><td></td><td>Çelik sırtlı tek kenarlı endüstriyel bıçaklar</td></tr><tr><td>Spatula</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-401-10</td><td></td></tr><tr><td>Hipodermik iğneler</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482610</td><td>26 Gauge</td></tr><tr><td>Pipetler</td><td>Labnet International</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ve dik görüntüleme drosophila embriyolar

Upright Imaging of Drosophila Embryos

Birkaç iyi bilinen morfogenetik gradyanlar ve hücresel hareketler / dorsal ventral eksen boyunca meydana<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyo. Ancak, bu süreçler görüntülemek için kullanılan güncel teknikleri biraz sınırlı. Aşağıdaki protokol, sabit ve etiketli montaj için yeni bir teknik açıklar<em&gt; Drosophila</em&gt; Konfokal görüntüleme ile koronal görüntülemek için embriyo. Bu yöntem, gliserin jöle montaj medya iki kat arasında embriyolar gömme oluşur ve görüntüleme jöle şeritleri dik olarak konumlandırılmış. Embriyolar sandviç için ilk adım, bir slayt üzerinde gliserin jöle ince bir yatak yapmak için. Daha sonra, embriyolar bu yüzey üzerinde dikkatle hizalanmış ve jöle ikinci bir tabaka ile kaplıdır. Ikinci kat katılaşmış sonra, jöle şeritler kesilir ve görüntüleme için dik çevrileceği. Alternatifler embriyoların mikroskop standı kullanılmak üzere türüne bağlı olarak görselleştirmek için açıklanmıştır. Dorsal-ventral eksen boyunca tüm hücreleri tek bir konfokal Z-düzlemi içinde görüntülü olduğu için, yöntem boylamasına monte embriyoların 3D rekonstrüksiyonlar ortak saçılma photobleaching veya ışık olmadan, hassas ölçüm ve floresan sinyallerin karşılaştırma sağlar.

Burada lekeli için bir montaj protokolü<em&gt; Drosophila</em&gt; Mikroskopisi kullanarak kesit görüntüleme sağlayan bir dik pozisyonda embriyolar.

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Drosophila embriyosunun dorsal/ventral ekseni boyunca birçok iyi bilinen morfogenetik gradyan ve hücresel hareket gerçekleşir. Ancak, mevcut ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, embriyo boyutunun hassas bir şekilde ölçülmesi ve protein ile RNA ekspresyon seviyelerinin nicelleştirilmesi için kullanılabilecek, konfokal mikroskopi yardımıyla sağlam oph embriyolarının koronal görüntülerini elde etmektir. Bu işlem, embriyoları çevrelemek ve onları dik konumlandırmak için jelatin kıvamında bir montaj ortamı kullanılarak gerçekleştirilir. İlk adım olarak.Embriyolar ince bir gliserin jölesi tabakası üzerine hizalanır ve ardından bu ortamın ikinci bir tabakasıyla örtülür. Sonrasında, embriyoları içeren montaj ortamı, dikey olarak çevrilip tutulabilecek bloklar halinde kesilir. Görüntüleme için konumlandırılan embriyolar sonucunda, herhangi bir konfokal mikroskop ile görselleştirilmiş kesit görüntüleri elde edilir.Merhaba, benim adım Milu. Case Western Reserve Üniversitesi biyoloji bölümündeki Meso Lab'de lisansüstü öğrencisiyim. Bugün, konfokal mikroskop kullanarak PHI embriyolarını geniş bir pozisyonda görüntülemek için bir montaj protokolünü uygulamalı olarak göstereceğiz.Bu yöntemi, Case'deki gelişimsel biyoloji dersi laboratuvarımızda Dr. ile iş birliği içinde geliştirdik. Bu tekniğin Mindin Laboratuvarı tarafından geliştirilen Endon görüntüleme tekniği gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, herhangi bir boyut ve şekildeki fikse edilmiş embriyoların veya dokuların basit bir şekilde hazırlanmasına ve görselleştirilmesine olanak tanımasıdır. Bu yönteme dair ilk fikri, elle dilimlenmesi oldukça zor olan diğer gesso türlerinin çok küçük embriyolarının enine kesitlerini görselleştirmemiz gerektiğinde geliştirdik. Bu yöntem, dorsal ventral aks boyunca gen ekspresyonunun ve protein seviyelerinin hassas bir şekilde nicelleştirilmesine imkan tanıyarak gelişimsel biyoloji alanındaki soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Embriyolar tipik olarak boylamsal olarak yerleştirilir. Enine kesitlerin Zack rekonstrüksiyonlarını elde etmek mümkün olsa da, genellikle floresan gözlerin fotobeyazlaması ve ışık saçılması gibi sorunlar ortaya çıkar ve bu işlem oldukça zaman alıcıdır. Bizim tekniğimiz, embriyoların enine kesit görüntüleri tek bir konfokal nokta boyunca görselleştirildiği için bu sorunları en aza indirir.Genellikle, bu yöntemi yeni deneyimleyen kişiler, gliserinli jöle bloklarını embriyoların uç kısımlarına yakın yerlerden keserken bazı zorluklar yaşayabilirler. Bu yöntem dikkatli bir uygulama gerektirdiğinden, görsel gösterimi kritik önem taşır. Bugün öğrencilerimiz Catherine Chen ve Catty tarafından drosophila embriyolarının dik görüntüleme için hazırlanmasına yönelik hazırlanan bir gösterimiz bulunmaktadır.Öncelikle, gliserin jölesini 55 °C'lik bir su banyosunda, homojen bir sıvı girdabı haline gelene kadar 20 ila 30 dakika boyunca eritin. Ancak, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için şişeyi sallamayın. Kesilmiş bir P 1000 pipet ucu kullanarak, eritilmiş gliserin jölesinden bir mililitreyi dikkatlice lam üzerine pipetleyin.Hava kabarcıklarından arındırılmış, ince ve düzgün bir ilk tabaka oluşturmak için jelin yatay bir yüzeyde beş dakika boyunca katılaşmasını bekleyin. Ardından lamı -20 °C'lik bir dondurucuya beş dakika süreyle yerleştirin. Alternatif olarak, lamı streç filmle kapatın ve beş güne kadar 4 °C'de muhafaza edin.Jölenin ilk tabakası katılaştığında, lamı mikroskoba götürün ve embriyo hizalama işlemine geçin. İlk jöle tabakasının kenarına az miktarda boyanmış embriyo ve %70 PBS gliserol pipetleyin. Mikroskop altında embriyoları, lam başına üç ila dört sütun boyunca yan yana hizalayın.Hipodermik bir iğnenin eğimli tarafını bir kaşık gibi kullanarak embriyoları alın. İğne yardımıyla embriyoları jöle ortamı üzerinde yatay olarak kaydırarak, tüm embriyo başlarını dikkatlice aynı yöne doğru yönlendirin.Hizalanmış embriyoların son konfigürasyonu, DNA enjeksiyonu için açıklanana benzer olacaktır. Bükülmüş bir Kim wipe parçası kullanarak, embriyolar üzerindeki fazla PBS gliserolü alın. İkinci bir jöle tabakası oluşturmak için, embriyo sayısına bağlı olarak, embriyoların üzerine dikkatlice 50 ile 300 µL arasında eritilmiş gliserin jölesi pipetleyin.Son olarak, lamı -20 °C'de 5 ila 10 dakika boyunca soğutun veya +4 °C'de gece boyunca saklayın. Gliserol içine gömülmüş embriyoları, stereomikroskop altında görüntülemek amacıyla lamdan çıkarmak için, hizalanmış embriyoların ön ve arka taraflarına yakın bölgelerdeki jöleyi bir jilet yardımıyla kesin. Jileti 90 derecelik bir açıyla tutun.Düz kesimler yapmak için kesim yerlerinin yanına 100 ila 200 µL soğuk PBT ekleyin. Embriyoların yanındaki jöleyi dikkatlice sıyırın. Bir spatula kullanırken, PBT embriyo bloğunun serbest kalmasına yardımcı olur.Bloğu, daha fazla kesim yapmak üzere kuru bir mikroskop lamına aktarın. İlk olarak, içerisinde beş ila yedi embriyo bulunan daha küçük bloklar kesin. İkinci olarak, görüntülemeyi engelleyebilecek fazla gliserin jelini temizleyin.Son olarak, gömülü embriyoları bir jilet ve bir iğne yardımıyla dik konuma getirin. Ters konfokal mikroskop kullanarak drosophila embriyolarını görüntülemek için, embriyoları içeren jöle bloğunu bir lamel üzerine yerleştirin. Embriyonun en az jöle bulunan kısmının objektife daha yakın olduğundan emin olun.Görüntüleme için dik bir mikroskop kullanılıyorsa, supra glue'dan dört yığın hazırlayın. Birincisi, destek olarak kullanılacak lamel camlarını hazırlayın ve gliserol içindeki embriyo bloğunu bu desteklerin arasına yerleştirin. Konfokal analiz için yığınları daha uzun bir lamel camı kullanarak birbirine bağlayın.Numuneyi mikroskop tablasına yerleştirin. Embriyonun tamamını mı yoksa sadece bir kısmını mı görüntüleyebileceğinizi belirlemek için kullanılacak objektiflerin çalışma mesafesini kontrol edin ve burada gösterildiği gibi görüntülemeye başlamak için bilgisayarda konfokal konfigürasyonu ayarlayın. Protokol doğru şekilde uygulandığında, embriyolar bütün halde bırakıldığı için morfolojisi bozulmamış embriyoların kesit görüntüleri gözlemlenebilir.Bu yöntem, embriyo boyutlarının ve dorsal ventral eksen boyunca gen ekspresyon seviyelerinin hassas ölçümlerini yapmak için kullanılabilir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik 30 ila 45 dakika içinde tamamlanabilir. Embriyoların üzerine ikinci gliserin jölesi tabakası dökülmeden önce fazla gliserolün uzaklaştırılması önemlidir.Aksi takdirde, iki katman ayrılabilir ve kesme adımını daha zor hale getirebilir. Ayrıca, kullandığınız objektiflerin çalışma mesafesini, embriyonun tamamını mı yoksa sadece bir kısmını mı görüntüleyebileceğinizi belirlemek için kontrol etmeniz gerekir; çünkü çalışma mesafesi, görüntüleyebileceğiniz alan üzerinde bir kısıtlama oluşturur. Jeli, embriyonun objektife doğru konumlandıracağınız tarafına yakın bir şekilde kestiğinizden emin olun.Aksi takdirde, embriyolar yerine sadece jeli görüntülemiş olursunuz. Bu videoyu izledikten sonra, Joseph embriyolarının kesit görüntülerini nasıl alacağınız konusunda iyi bir anlayış kazandığınızı umuyoruz. Bizi izlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Bu protokolde açıklanan dik görüntüleme yöntemi, gelişmekte olan bir Drosophila melanogaster yumurtasının kutuplarının ayrıntılı olarak görüntülenmesine olanak sağlar.  Bu uçtan bakış, foliküler epitelde çoklu hücre tiplerinin düzenlemelerine ve morfolojilerine yeni bir bakış açısı sağlar.

Dik Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurta Odaları

Fare embriyolarının üç boyutlu (3D) görüntülerini elde etmek için yüksek çözünürlüklü episkopik mikroskopi kullanan ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu geliştirilmiş protokol, floresan boyanın penetrasyonunu arttırmak için modifiye edilmiş bir doku hazırlama yöntemi kullanır, böylece hem küçük hem de büyük boyutlu numunelerin morfometrik analizine izin verir.

3D Görüntüleri Hızlı Toplama Yüksek çözünürlüklü Episcopic Mikroskopi kullanma

Bu protokol uzun vadeli ex vivo kültür ve Drosophila hayali diskin canlı görüntüleme için ayrıntılı bir yöntem tarif etmektedir. Göz diskin canlı görüntüleme 10 saat süre içinde fotoreseptör farklılaşma ve ommatidial dönüşünü gösterir. protokol basit ve pahalı kurulum gerektirmez.

Uzun süreli Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Göz Disk

Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Öğrenin Drosophila embriyolarını dik konumda görüntüleme yöntemini; konfokal mikroskopiyle kesit analizi ve gen ifadesi ölçümü için gliserin jel kullanılır. Bu teknik gelişim biyolojisi araştırmalarında hızlı ve güvenilir sonuçlar sağlar.

VE Dik Görüntüleme Drosophila Embriyolar

Daha fazla video keşfet