Name: İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-01T17:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 28 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerde GRK iyon kanallarının fonksiyonel analizi için yönlendirilmiş mutagenez ve yama kelepçesi tekniklerini. Bu yöntem nöronal uyarılabilirlik ve kanal aktivasyonunu incelemek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Alkol Suistimali Ulusal Enstitüsü ve PA için bir ön doktora NIH NRSA dostluk (F31AA017042); Çalışmalarımız Neuroscience (PAS), Ulusal Uyuşturucu Enstitüsü (PAS R01 DA019022) McKnight Endowment Fund mali desteği ile mümkün yapıldı Alkolizm. GIRK2 L257W mutant Dr. Prafulla Aryal tarafından sağlanmıştır. Floresan mikroskop ve sponsorluk nazik Leica Instruments tarafından sağlanmaktadır.

1. Sitesi Mutagenez Yönetmen Biz GIRK2 memeli ifade plazmid pcDNA3.1 kodlama cDNA ve Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II site directed mutagenesis kiti kullanılarak, üreticinin talimatlarına göre bir nokta mutasyonu tanıtmak. Astarlar dizisi mevcut online astar tasarım programı kullanarak kolayca oluşturulabilir: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Not: BD 14 ml tüpler protokol açıklanan yerine standart Eppendorf 1,5 mL tüpler kullanın. Ancak, XL10-Altın ultracompetent E. β-mercaptoethanol ile ön tedavi coli, 30s ısı şok ve NZY + (veya NZYM +) medya başarılı mutagenez için kritik öneme sahiptir. Mümkünse, yeni bir kısıtlama sitesi oluşturur ek bir sessiz mutasyon mühendislik Aşağıdaki mutant koloniler tarama için kullanışlı olabilir. 2. Miniprep, DNA Dizi ve Maxiprep 2.1 Qiagen miniprep ve sıralama. Bireysel bakteri kolonilerinin aldı ve ampisilin (AMP) ile LB suyu yetiştirilmektedir. Biz cDNA arındırıcı için üreticinin yönergelerini izleyin. Yukarıda Adım 1 dahil bir kısıtlama sitesi ise basit bir kısıtlama, sindirme, mutasyon, başarılı bir tanıtım teyit kullanılabilir. Otomatik DNA dizi analizi yapılır, off-site ve cDNA mutasyon varlığını doğrulamak için önemlidir, hem de herhangi bir istenmeyen mutasyonların olup olmadığını değerlendirmek. Bu adım çok önemlidir. Biz ileri T7 organizatörü ve BGH sıralama primerler ters kullanarak tüm GIRK kodlama dizisi dizisi pcDNA3.1 plazmid kanadında çoklu klonlama yeri. Not: sıralama Elektroferogram sıralama verileri yeterli kaliteyi sağlamak için dikkatli bir şekilde incelemek için önemlidir. Yüksek kaliteli Elektroferogram biraz arka plan gürültüsü ile keskin, örtüşmeyen zirveleri vardır. 2.2 Qiagen maxiprep. Biz üreticinin yönergeleri izleyin. Not: Bu adım verimli transfeksiyon için önemli olan cDNA saflık, geliştirmek için deneyler yer almaktadır. 3. HEK293T Hücre Kültürü ve Transfeksiyon Bütün bu adımlar, steril doku kültürü kaputu yapılmalıdır. 3.1 Hücre kültürü HEK293T hücreleri (37 ° C,% 5 CO 2 nemlendirilmiş inkübatör) kültüre kolay olduğu için, kullanımı kolay ve hızlı çoğaltma zaman, yüksek transfeksiyon verimliliği tüm hücre yama klemp elektrofizyoloji için uygun . HEK293T hücreleri plazmid pcDNA3.1 episomal çoğaltma sağlar SV40 büyük T antijeni ifade eder. HEK293T hücreleri L-glutamin ile desteklenmiş düşük glukoz DMEM medya ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) kültür. Pasajlanması hücreleri, hücreler / FBS içeren taze medya ilavesi ile enzim aktivitesi durur, doku çanak ayırmak kadar bekleyin, tripsin / EDTA konfluent (% 90-95) HEK293T hücrelerin% 0.25 ekleyin. Plaka ~ 1 X 10 5 hücre / 1 ml de ortalama antibiyotik içermeyen kültür ortamı ile birlikte 12 kuyu hücre kültürü çanak içine. (1 X 10 5 hücre, yaklaşık 10 ml medya ile yeniden süspanse konfluent T25 balon elde edilen hücre süspansiyonu 350 mcL) . 3.2 Transfeksiyon 8-24 saat sonra, HEK hücreleri plastik yapışır ve transfeksiyon için hazır olacak. CDNA 0.2 mikrogram kanal, Invitrogen Lipofectamine 2000 kullanılarak cDNA 0.4 mikrogram M2R reseptör cDNA ve 0.04 mg YFP Transfect hücreleri. Not: Biz, başarılı bir şekilde (yeşil hücreler muhtemelen GIRK kanalları ve M2 reseptörleri içerecektir) transfekte hangi hücrelerin belirlemek için cDNA YFP küçük bir miktar kullanın. Kullanımı cDNA konsantrasyonu her klon için ayarlanması gerekir. 3.3 transfekte hücrelerinin Floresan görselleştirme. Yeri 12-iyi bir ters floresan mikroskop sahnede plaka ve YFP ifade hücrelerini inceleyen. DIC görüntü karşılaştırın ve yeşil hücreleri yaklaşık numarasını not edin. Bu transfeksiyon verimliliği bir tahmin sağlar. 24-iyi yemekleri ve Poly-D-lizin kaplı kapak fişleri 3.4 Hazırlık 12 mm cam kapak fişleri (Warner, CS-12R), deiyonize su ile yıkama ve bir gecede% 95 etanol sallayarak, Radiacwash bir gecede onları sallayarak temizleyin. Kullanana kadar% 70 etanol temiz kapak fişleri saklayın. Etanol ile Petri kabı, forseps ve brülör kullanarak etanol kapalı alev, bir koyun kapak fişlerid steril bir 24 plaka bir yer. Poli-D-lisin 250 mcL (PDL) çözümü ile her bir kuyunun kapağı [0.2 mg / ml] ve kapak fişleri gecede PDL çözüm dalmış steril kaputun altında oturup sağlar. Buharlaşmasını önlemek için Parafilm 24 plaka sarın. Ertesi sabah, PDL aspirat ve 2x steril su ile yıkayın. Tabak kapağı, kaputun altında kuruması için açık bırakın. Steril alüminyum folyo ile kaplı kapak fişleri ile 24 iyi yemekleri sarılmış ve hafta boyunca oda sıcaklığında saklanabilir. Kapağında 3.5 Kaplama transfekte HEK293T hücreleri fişleri 24 saat 24-iyi çanak (~ 4 X 10 3 hücre / kuyu) transfeksiyon, split hücreler cam kapak içeren sonra poli-D-lizin ile kaplı kayar. Not: transfekte hücreleri 24-72 saat yazılan transfeksiyon kadar kullanılabilir. Hücreler yama kelepçe elektrofizyoloji deney için ayrı ayrı kapak fişleri sağlamak için ayrılmıştır. 4. Elektrofizyoloji 4.1 hazırlanması Çözümler Ekstrasellüler (banyo) solüsyonu: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0.5 mM CaCl 2, MgCl 2 2 mM ve 10 mM HEPES (NaOH ile pH 7.4 set). Kısım 20K banyo çözümü ve uygun modülatörleri <ul><li> 20K + Ba 2 + 1 mM BaCl 2 içeren çözüm: dahilde giderilmesi akımların spesifik bir inhibitörüdür </li><li> 20K + Karbakol'ün: 5 mcM Karbakol'ün ile çözüm: Belirli bir M2R agonist, G-proteinler M2R çiftler açık GIRK kanalları </li><li> 20K + Etanol: doğrudan GIRK kanalları etkinleştirmek için 100 mM EtOH içeren banyo solüsyonu </li></ul> Yeri banyo çözümleri hızlı değişim perfüzyon sistemi şırınga (solüsyon kaplarında). Not: Biz bir Warner tutam valf sistemi, banyo çözümleri kontrol etmek için kullanır. PE boru tavsiye edilir. İç / elektrot çözüm: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5.4 mM MgCl 2, 2.5 mM K 2 ATP ve 0,3 mcM Li 2 GTP ile 10 mM HEPES (pH, 7.4 '). ATP ve GTP olmadan elektrot çözümü olun. Biz, -80 ° C'de saklanan ATP ve GTP hacimde ayrı ayrı hazırlamak ve deney günü elektrot çözüm ekleyin. ATP / GTP korumak için buz üzerinde son elektrot çözümü ile şırınga tutar. Biz steril filtre (0.2 mikron) iç / dış çözümler mikrobiyal gelişmeyi engellemek ve tüplerin tıkanma olasılığı ve elektrot azaltmak. 4.2 Çekme elektrotlar Biz Narishige iki adımlı dikey Warner Aracı (1.5 mm dış çapı, 0.86 mm iç çap ve 7.5 cm uzunluğunda) çektirmesi ve borosilikat cam elektrot intrasellüler çözümü ile dolu direnç M 3-7 elektrotlar elde etmek için kullanırlar. Not: Bu deneysel elektrot çektirmesi ve elektrot cam türü için laboratuarda parametrelerini belirlemek için gereklidir. Bizim dikey çektirmesi için, ikinci çekme için ilk çekin ve ~ 43 için 60.2, bir ısı ayarı kullanın. Sıkma 4.3 Tüm hücre yama <ol><li> Ters bir floresan mikroskop aşamasında dış çözüm yeri ve çanak kapağı, vazelin küçük miktarda kullanarak, bir 35 mm çanak kayma kapak monte edin. Odak ve hücreleri bulmak için DIC kullanın YFP pozitif hücreleri bulmak için floresan YFP geçmek. </li><li> Perfüzyon manifoldu yeşil bir hücre (hücre dışında ilgi = 2-3 hücre boyu 20-30 mikron) yakın pozisyon ucu. </li><li> Kazanç 1, Yapılandırma:: tam hücreli β = 1, mod V-klemp elektrotlar solüsyonu ile doldurun, aşağıdaki başlangıç ​​ayarları Axopatch 200B amplifikatör (headstage Axon Instruments) ekleyin. </li><li> Pipet tıkanmasını önlemek ve hücrenin hemen üzerinde elektrot ucu yere manipülatör kullanmak için elektrot pozitif basınç uygulayın. </li><li> Pipet potansiyeli Sıfır için bir test gerilimi adım sunmak için Seal Sına düğmesini seçin. 5 mV dikdörtgen gerilim adım Clampex Mührü Test penceresinde görünecektir. 0 nA akım baz-line getirmek için amplifikatör Pipet Ofset potansiyometre ayarlayın. Alternatif olarak, V-track modu ve "0.00" amplifikatör metre ekranda gerilim getirmek için amplifikatör Pipet Ofset potansiyometre VTrack ve kullanımı metre topuzu seçici amplifikatör moduna geçiş yaparak pipet potansiyeli sıfır. </li><li> Clampex 8.2 yazılımı (M 3-7 olmalıdır) sızdırmazlık test komutunu kullanarak elektrot direncini kontrol ediniz.. </li><li> Kayıtlı bir protokol dosyasını açın veya yeni bir protokol oluşturmak. Protokol dosya açmak için ana menüden seçin, ardından Aç Protokolü Edinme ve kayıtlı bir gerilim protokol dosyayı seçin. Bu deneme için, protokol 2 üzerinden 40 mV ile -100 mV ve rampa tek bir 50 ms gerilim adım teslim membran potansiyeli-40mV tutmak için yaratılmıştır00 ms. Bu protokol, her 2 saniyede yürütülür. GIRK kanalları ters potansiyel ve içe doğru bir düzeltme gözlem için rampa protokolü sağlar. Gerilim-kapılı iyon kanalları için, dikdörtgen planlı bir gerilim adım daha uygun olabilir. </li><li> Yaklaşım hücre kullanarak ince ayar manipülatör, pozitif basınç serbest, negatif basınç uygulamak hücre yüzeyinde dokunduktan sonra, ve direnç artışı izlemek Seal Test osiloskop penceresinde. Bir kez direnç GΩ aralığında, elektrot membranı (Gigaseal kurdu) üzerine imzalanmıştı. </li><li> Negatif basınç, hücre zarı kırmak ve hücre içine erişim almak için bir darbe uygulayın. Bir kez tam hücreli yapılandırma, kayıt kapasitif akımlar artmıştır. </li><li> Clampex Membran Test Switch ve erişim direnci Ra, membran direnci Rm, membran kapasitans Cm yazmak ve göz gerçek kapasitif akım teorik eğri üstel uyum doğrulamak. Membran kapasitans hücre boyutu ile doğru orantılıdır ve akım yoğunluğunun hesaplanması için daha sonra kullanılabilir olacak. </li><li> 10 kHz -40 mV ve filtre V-Out (membran potansiyeli) Testi, Seal geri dönün </li><li> Amplifikatör membran kapasitans ve seri direnç için aşağıdaki adımları ile telafi: <ol class="lalpha"><li> TÜM HÜCRE CAP switch. Düz bir test darbe elde edene kadar, ileri ve geri TÜM HÜCRE OTP ve SERİSİ DİRENCİ çevirir ayarlayın. Ayrıca pipet kapasitans FAST CAP topuzu ayarlamanız gerekebilir. </li><li> Yaklaşık% 60-80% TAHMİN düğmeyi çevirin, tekrar tekrar ayarlayarak TÜM HÜCRE OTP ve seri direnç arama (pipet kapasitans telafisi FAST CAP topuzu de ayarlamanız gerekebilir). </li><li> Yeniden ayarlayarak TÜM HÜCRE CAP ve seri direnç (pipet kapasitans telafisi FAST CAP topuzu de ayarlamanız gerekebilir) nabız düz tutmaya çalışırken, hücre salınan% COMP-% 100 çevirin. Zaman sabiti azaltarak gecikme ayarlayın. </li><li> Cm (membran kapasitans), Rs (seri direnç),% COMP değerleri bir yere yazın,% beklenenin ve Gecikme süresi notebook amplifikatör. Cm ve Rs yukarıdaki Membran Test ölçülen Cm ve Rm yaklaşık olarak aynı olmalıdır. </li></ol></li><li> Banyo çözümü kontrol etmek için harici bir çözüm valfi açın. 2kHz amplifikatör 8-kutuplu Bessel filtre ayarlayın, bir gerilim kelepçe protokolü açın ve kayıt akımları başlar. </li><li> Biz, 100 mV ile +40 mV üzerinde 200 ms 50 ms sonra rampalar -100 mV adımları ve her 2 saniyede teslim edilir bir rampa protokolü kullanarak GIRK akımları kaydedin. Rampa protokol ters potansiyel gözlem ve GIRK kanalları içe düzeltme özelliği sağlar. Oda sıcaklığında (22-25 ° C), akım GIRK yakın K (E K = -50 mV) için hesaplanan denge potansiyeline yakın -50 mV (banyosunda 20 mM KCl ile), ters gerektiğini, sonra devam E K olumlu potansiyelleri oldukça düz. </li><li> Deneysel Protokol: istikrarlı bir temel kaydettikten sonra, 20K + Karbakol'ün çözüm geçmek ve 20K banyo çözümü için geri dönmek, tepki doruk beklemek, daha sonra 20K + Etanol uygulamak ve pik cevabı bekleyin, sonra 20K banyo çözüm geçmek ve nihayet 20K + Ba 2 + çözümü. Bu ilaçların uygulama esnasında GIRK akımları (en çok -100 mV telaffuz) genlik değişiklikleri görürsünüz. Notebook, farklı ekstrasellüler çözümler uygulamaya karşılık gelen iz numarasını not edin. Tek bir Clampfit dosyası tüm deney için tüm Piyango içerecektir. </li></ol> 5. Veri Analizi -100 MV veri GIRK akımları analiz etmek Clampfit 9.2 yazılımı kullanın. <ol><li> Kayıt ile dosyayı açın -100 mV imleç ayarlayın. Varsayılan olarak ekranda üst üste tüm izlerini göreceksiniz. "Imleçler yaz" simgesine basarak sayısal verilerini içeren Excel gibi bir elektronik tablo yaratacaktır. </li><li> Atama X tarafından takip numarası sütun ve imleci sütunun Y için ve hızlı bir deney bir zaman ders arsa çizebilirsiniz "Grafik Oluştur" ikonuna basarak. </li><li> Ba 2 + tek başına dış perfüzyon çözümü ("20K mevcut" eksi "20K + Ba 2 + Akım") kaydedilen geçerli varlığı mevcut çıkarılarak bazal akımı hesaplayın. Aktive akımları 20K bazal akım çıkarılarak indüklenmiş akımlar hesaplayın (20K + Karbakol'ün mevcut "eksi" 20K mevcut ";" 20K + Etanol geçerli "eksi" mevcut 20K "). Membran kapasitans (amplifikatör doğrudan okuma) tarafından mevcut bölerek akım yoğunluğu (pA / pF) hesaplayın. Bazal akımlar tarafından indüklenmiş akımlar bölünmesi ve 100 ile çarpılması ile yüzde aktivasyon hesaplayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Yabani tip kanallar ile transfekte hücreler geçerli kayıt gerekir. GIRK kanal ölçmek içind ekstraselüler çözüm içeren 20 mM K + (145 mM K + hücre içi) güçlü içe düzeltme ve potasyum kanallarının önemli bir özelliği ~ -50 mV, ters bir potansiyel göstermelidir. Yabani tip akım karbakol uygulama (bazal aşırı akım 3-5 kat artış) üzerine güçlü bir artış ve 100 mM etanol aynı şekilde cevap verecektir. Not: elektrofizyoloji işareti kongre içe akım negatif ve dışa akımı pozitif. GIRK2 alkol bağlayıcı cebinde L257W mutasyon için, hem karbakol ve etanol zayıflatılmış tepkiler göreceksiniz. Bu L257 alkol ve G-protein aktivasyonu GIRK2 kanalları dahil olduğunu göstermektedir. GIRK2 mutagenez sonuçlarını daha fazla örnek için, Aryal ve arkadaşları tarafından son 1 yayınımıza bakın. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Yabani tip GIRK2 kayıt için Clampfit 8.0 gösterir veri dosyası Pencere Üst sol panelinde üst üste farklı bah harici çözümler varlığı bir rampa gerilimi protokole tepki olarak kaydedilen süpürür gösterir. İmleç 1 -100 mV konumlandırılmış. Imleç değerleri tablo (sağ panel) yazılır. Alt sol panelinde süpürme sayısına karşılık, mevcut arsa gösterir. Etanol (EtOH) ve karbakol (Carb) ve Ba 2 + ile inhibisyonu ile akım artışı (Çökmelerin) unutmayın. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Mutant GIRK2 L257W kayıt Clampfit 8.0 gösterir veri dosyası Pencere Açıklamaları Şekil 1'de olduğu gibi aynıdır. Karbakol (Carb) aktivasyon ve mutant kanalları EtOH indüklenen akımların azaltılması kaybı unutmayın.

<ol><li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li>
<li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K%2B+channels+examined+by+scanning+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Phys%22%5BJournal%5D)">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li>
<li>Doyle, D. A., Cabral, M. orais, Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure+of+the+potassium+channel%3A+molecular+basis+of+K%2B+conduction+and+selectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li>
<li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li>
<li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K%2B+channel+Kir2.2+at+3.1+%26Aring%3B+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li>
</ol>

Site-directed mutagenesis iyon kanallarının yapı-işlev ilişkileri incelemek için klasik bir yaklaşım. Bu, kritik bir kalıntı iyon kanalı değiştirerek bir kanal fonksiyonu belirgin değişiklikleri gözlemek gerekir önerme üzerine dayanır. Buna karşın, pek çok kritik olmayan pozisyonda mutasyonların kanal işlevi büyük tedirginlikler olmadan sokulabilir. Tipik olarak, söz konusu kalıntı ilk alanin, triptofan, 2 amino asitlerin en büyük mutasyon küçük bir polar olmayan amino asit, mutasyona uğramış. Kanal fonksiyonu için önemli bir kalıntı ise, her iki mutasyonların kanal aktivitesini değişecektir. Daha az temel kalıntısı mutasyona uğramış ise, mutasyon, özellikle alanin etkileri genellikle normaldir. Triptofan mutasyonlar triptofan boyutu ile ilişkili sterik engeller nedeniyle değişikliklere neden daha olasıdır. Genellikle, alanin veya triptofan yapısal bilgi kanalı (alanin veya triptofan tarama olarak adlandırılır) bir parçası, içinde eksik olan, sistematik mutasyon kritik artıkları bulmak için kullanılabilir. Paralel olarak, nispeten kısa bir süre içinde birden fazla artıkları test için izin ile birden fazla farklı nokta mutasyonlarının klonlar hazırlanmış olabilir dikkat etmek önemlidir. Son zamanlarda, kanal birden fazla kristal yapıları 3,4,5 kullanılabilir hale gelmiştir. Onlar bu protokolü açıklanan yaklaşım kullanarak test edilecek potansiyel kilit artıkları önermek için kullanılabilir. Yabani tip kanal ölçümleri her zaman doğru transfeksiyon ve elektrofizyolojik deneyleri yapıldı sağlamak için bir pozitif kontrol olarak hizmet mutant kanal ölçümü eşlik etmelidir. Nokta mutasyonlarının fonksiyonel bir akımı eksikliği, güncel bir kanal aktivite yabani tip ya da değiştirilmiş düzenlemeye benzer yol açabilir. Ölçülebilir mevcut olmaması, yanlış katlanır veya değişmiş kaçakçılığı nedeniyle olabilir. Böyle bir durumda kanal biyotinilasyon tahlil veya plazma zarı ve hücre içinde kalan kanallar fonksiyonel olmayan kanallar arasında ayırt etmek için ekstrasellüler etiketi karşı immünofloresan boyama (hücre permeabilization olmadan) kullanarak yüzeye doğru trafikleri olmadığını öğrenmek için faydalı olabilir . Sonuç olarak, kanal değil, aynı zamanda kanal düzenleme mutasyon sonucu bazal aktivite sadece araştırmak için tavsiye edilir. G proteinleri, PIP2, iyonlar, ATP konsantrasyonu, fosforilasyon (tirozin, serin veya treonin mutasyon kullanarak), ubikuitinasyon veya sumoilasyon (lisin mutasyon kullanarak) tarafından düzenlenmesi de dahil olmak üzere ilgi iyon kanal kanal fonksiyonu modülasyon farklı mekanizmalar göre ele olabilir , doğrudan kanal açıcılar veya blokerleri.

<table><tbody><tr><td>Kimyasallar</td><td>Sigma</td><td>Değişken</td><td></td></tr><tr><td>Mini Prep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Radiacwash</td><td>Biodex</td><td>005-100</td><td></td></tr><tr><td>Poly-D-lysine hydrobromide</td><td>BD Biosciences</td><td>CB40210</td><td>Poly-L-lysine de kullanılabilir</td></tr><tr><td>Maxi Prep Kiti</td><td>Qiagen</td><td>12263</td><td></td></tr><tr><td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kiti</td><td>Stratagene</td><td>200512-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Lamelller &amp;#710;&amp;#8230; 12 mm</td><td>Warner Instruments</td><td>CS-12R</td><td></td></tr><tr><td>Kapiler Cam Tüp Borosilikat-standart duvar</td><td>Warner Instruments</td><td>G150-3</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="blank"&gt;Evirme floresan mikroskobu&lt;/a&gt;</td><td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Leica</a></td><td>DMI3000 B</td><td></td></tr><tr><td>Elektrofizyoloji</td><td>Nikon/&lt;br/&gt;Leica/&lt;br/&gt;Zeiss</td><td>Floresan özellikli herhangi bir evirme DIC&lt;br/&gt;(Hoffmann)&lt;br/&gt;mikroskobu</td><td></td></tr><tr><td>Amplifikatör</td><td>Molecular Devices</td><td>Axon Axopatch 200B amplifikatörü</td><td></td></tr><tr><td>Perfüzyon sistemi</td><td>Warner Instruments</td><td>VC-6 Perfusion MM-6</td><td></td></tr><tr><td>Dijitalize edici</td><td>Molecular Devices</td><td>Digidata 1320 dijitalize edici</td><td></td></tr><tr><td>Manipülatörler</td><td>Sutter Instruments</td><td>Manipülatör: MP-85</td><td></td></tr><tr><td>Elektrot Çekici</td><td>Narishige</td><td>PC10 dikey elektrot çekici</td><td></td></tr><tr><td>İzolasyon Masası</td><td>Technical Manufacturing Corporation</td><td>Hava masası</td><td></td></tr></tbody></table>

İyon kanalları ve fonksiyonel analiz mutagenez heterologously memeli hücreleri cinsinden ifade edilir

Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Biz nasıl bir iyon kanalı bir nokta mutasyonu tanıtan fonksiyonel etkilerini incelemek amacıyla gösterecektir. Biz nöronların eksitabilite düzenleyen için önemli olan G-protein-kapılı içsel giderilmesi potasyum (GIRK olarak anılacaktır) kanalları, çalışma. Dört farklı memeli GIRK kanal alt birimden (GIRK1-GIRK4) vardır - bir homotetramer oluşturması nedeniyle biz GIRK2 odaklanır. Muskarinik reseptör (M2R) olarak G-protein reseptörler (GPCRs), farklı türde uyarılması GIRK kanal aktivasyonuna yol açar. Alkol aynı zamanda doğrudan GIRK kanallarını harekete geçirir. Biz özellikle cDNA GIRK kanal için bir veya daha fazla nükleotidler değişen bir amino asit nasıl mutasyona gösterecektir. Bu mutasyona uğramış cDNA dizisi saflaştırılmış bakteriler amplifiye olacak ve nokta mutasyonu varlığı DNA dizi tarafından teyit edilecektir. Mutasyona uğramış ve yabani tip GIRK kanallar için cDNAs in vitro kültür insan embriyonik böbrek HEK293T hücrelerine transfekte olacaktır. Son olarak, tüm hücre yama klemp elektrofizyoloji ektopik ifade yabani tip ya da mutasyona uğramış GIRK kanallar yoluyla makroskopik potasyum akımlarını incelemek için kullanılır. Bu deneyde, biz M2R bağımlı ve alkol bağımlısı aktivasyon GIRK2 kanal L257W mutasyon etkisi inceleyeceğiz.

Biz nasıl bir iyon kanalı fonksiyonu tek bir nokta mutasyonu etkisinin araştırılması gösterecektir.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Bir iyon kanalında nokta mutasyonu oluşturmanın fonksiyonel etkilerinin nasıl inceleneceğini göstereceğiz. G proteini ile kapılı içe doğru doğrultucu...

G-proteini kapılı içe doğru doğrultucu potasyum kanalları veya GIRK'lar, nöronların eksitabilitesinin düzenlenmesinde önemlidir. GIRK'lar, muskarinik reseptör M2R gibi G-proteini kenetli reseptörler (GPCR'lar) ve alkol tarafından aktive edilebilir; bu durum alkol bağlanma bölgesindeki mutasyonların etkilerini incelemek için kullanılır. Aktivasyon üzerine, bölgeye özgü mutagenez yoluyla GIRK cDNA'sına tek bir nokta mutasyonu eklenir, saflaştırılmış GIRK konstrüktleri YFP konstrüktleri ile birlikte memeli hücrelerine transfekte edilir ve transfeksiyon verimliliği floresan görüntüleme ile değerlendirilir.Ardından, alkol ve G-proteini bağımlı aktivasyonu karşılaştırmak için tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) analizi gerçekleştirilir. Bu görsel deney gösterimi, LY kanallarının fonksiyonunun nasıl inceleneceği konusunda size temel bilgiler sağlayacaktır. Bugün, alkolün grup kanallarını nasıl aktive ettiği sorusuna odaklanacağız.Burada gösterilen bölge yönelimli neogenez tekniği, iyon kanalı fonksiyonları hakkında içgörü sağlayabilir. Bu teknik, bir gende meydana gelen mutasyonun insan hastalığına yol açtığının bilindiği diğer sistemlere de uygulanabilir. Bunlar, hot cell patch Climbing tekniğinin gösterimleridir; bu teknik, kullanılabilir veriler üretmek için hassasiyet, uygun elektronik kompanzasyon ve pratik gerektiren birçok adım içerdiğinden kritiktir.Bu protokolde transfeksiyon için kullanılan DNA şu şekilde hazırlanır. İlk olarak, PCR'dan elde edilen GRK alt birimi DNA'sı doğrudan memeli ekspresyon plazmidi PC DNA 3.1'e klonlanır. Nokta mutasyonları, uygun şekilde tasarlanmış primerler ve quick change XL iki bölge yönlendirmeli mutajenez kiti kullanılarak oluşturulur.Bu sistem kullanılarak, tüm plazmidin replike edildiği ve primerler tarafından kodlanan nokta mutasyonlarının tanıtıldığı bir PCR işlemi gerçekleştirilir. PCR sonrası, replike edilen plazmidler DPN I restriksiyon enzimi ile sindirilir ve ardından ısı şoku yöntemiyle XL 10 gold ultra yetkin e. coli hücrelerine transforme edilir. Transforme edilmiş bakteriler, ampicillin içeren LB agar plaklarında büyütülür; plazmidi taşıyan bakteriler ampicillin'e dirençli olacak ve koloni oluşturacaktır.İzole edilen koloniler seçilir ve mini kültürlerde büyütülür. Plazmid DNA'yı izole etmek için mini prep işlemleri gerçekleştirilir. Ardından, başarıyla transforme edilen mutantları tanımlamak için DNA dizilemesi yapılır.E coli daha büyük bir şarjda büyütülür ve daha büyük miktarlarda plazmit DNA hazırlamak için maxi prep işlemleri gerçekleştirilir; her bir iki kuyucuğa yaklaşık 1x10⁵ HEK 293T hücresi ekilir. 12 kuyucuklu bir plakada, biri mutant ve diğeri kontrol için olmak üzere ayrılmıştır. Vahşi tip kanalı 37 °C'de inkübe edin.Sekiz ila 24 saat sonra hücreler substrata tutunacak ve transfeksiyon için hazır hale gelecektir. Hücreleri; üretici talimatlarına uygun olarak 0,2 µg kanal CDNA, 0,4 µg M2R reseptör CDNA ve 0,04 µg Y-F-P-C-D-N-A ile lipo 2000 kullanarak transfekte edin. Başarıyla transfekte edilmiş hücreleri belirlemek için hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin.İstenen inkübasyon süresi dolduktan sonra, transfeksiyon verimliliğini belirlemek için hücreleri ters floresan mikroskobunun tablasına yerleştirin. Transfekte olan hücrelerin yüzdesini belirlemek için floresan ve DIC görüntülerini karşılaştırın. Kültür kabını inkübatöre geri koyun.12 milimetrelik cam lamelleri temizleyin ve kullanıma kadar etanol içinde saklayın. Steril kabin içerisinde alevle yakarak kalıntı etanolu uzaklaştırın. Lamelleri 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin ve 0.2 mg/mL ile kaplayın.Transfeksiyondan 24 saat sonra poly-D-lysine ile kaplı yüzeylerdeki hücreleri tripsinize edin ve 24 kuyucuklu bir kabın içindeki poly-D-lysine kaplı lamellerin 4 ila 8 kuyucuğuna, kuyucuk başına 4x10³ hücre olacak şekilde ekleyin. Whole-cell patch clamp işlemini gerçekleştirmeden önce hücreleri 24 ila 48 saat daha inkübe edin. Borosilikat elektrot camı ve iki aşamalı dikey çekici kullanarak patch elektrotları hazırlayın.İdeal olarak, tamamlanmış elektrot üç ila yedi mega ohm dirence sahip olmalı ve ısı ile cilalama gibi ek işlemlere ihtiyaç duymamalıdır. Yama kenetleme (patch clamping) için, transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu bir lamelin 20 milimolar potasyum veya 20 K eksternal çözelti içeren 35 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Kabı, ters floresan mikroskobunun tablasına yerleştirin.Burada kullanılan patch clamping düzeneği bir perfüzyon sistemi kullanmaktadır. Bu sistem, bir manifolda bağlı tüpler aracılığıyla yerçekimi ile beslenen ve hücrelere uygulanacak hücre dışı çözeltileri içerir. Her bir çözelti, bir solenoid sıkıştırma valfi ile uzaktan kontrol edilir.Hücreleri odaklamak ve bulmak için DIC kullanın. YFP pozitif hücreleri belirlemek için YFP filtresine geçin. YFP pozitif hücreler tanımlandıktan sonra, perfüzyon sistemi ucunu, nöro floresan hücreden 20 ila 30 mikron veya iki ila üç hücre boyu uzaklığa konumlandırın.Bir elektrodu iç elektrot çözeltisiyle doldurun. Bir şırınga ve esnek iğne kullanarak, ucundaki hava kabarcıklarını gidermek için doldurulmuş elektroda hafifçe vurun. Elektrotları, bir AXO patch 200 B amplifikatörünün baş aşamasına takın.Amplifikatör ayarlarının tekrar tek bir konfigürasyona eşit olduğunu kontrol edin. Tüm hücre anahtarı beta eşittir bir ve alçak geçiren kap filtresi 10 kilohertz olarak ayarlanmıştır. Elektrot ucunu temiz tutmak için şırınga ve klemple pozitif basınç uygulayın.Ardından, elektrot ucunu banyoya yerleştirmek ve hücrenin üzerine taşımak için bir mikromanipülatör kullanın. Amplifikatörü V track moduna ve metre düğmesini V track konumuna getirin. Daha sonra, amplifikatör metre ekranındaki voltajı 0.00 değerine getirerek pipet potansiyelini sıfırlamak için amplifikatör üzerindeki pipet ofset potansiyel metresini kullanın.Alternatif olarak, amplifikatörde V clamp moduna geçin ve bir test voltaj basamağı uygulamak için test pulse düğmesini seçin. Dikdörtgen voltaj basamağı, clamp'in sızdırmazlık testi penceresinde görünecektir. Bazal akımı sıfır nanoamper seviyesine getirmek için amplifikatör üzerindeki pipet offset ayarını düzenleyin.Sızdırmazlık testi, üç ila yedi mega ohm olması gereken elektrot direncini gösterecektir. Ardından, sızdırmazlık testi penceresini kapatın. Açılır menüden "acquire open protocol" (açık protokolü edin) seçeneğini belirleyin.Ardından kaydedilmiş bir voltaj protokolü seçin. Burada seçilen protokol, tek bir voltaj adımını -100 millivolt değerine getirmek ve her iki saniyede bir +40 millivolt değerine kadar yükseltmek üzere önceden programlanmıştır. Bu rampa protokolü, tersine dönme potansiyelinin ve GK kanallarının içe doğru doğrultma özelliğinin gözlemlenmesine olanak tanır.Voltaj kapılı iyon kanalları için, dikdörtgen bir voltaj basamağı daha uygun olabilir; mikromanipülatörün hassas ayarı kullanılarak hücreye yaklaşılır, pozitif basınç serbest bırakılır ve hücre yüzeyine temas ettikten sonra hafif bir negatif basınç uygulanır. Seal test ekranında meydana gelen direnç artışı izlenir. Direnç gigaohm seviyelerine ulaştığında, elektrot membrana sızdırmaz bir şekilde yapışmış demektir.Bu durum giga mühür (giga seal) olarak adlandırılır. Bir şırınga kullanarak, membranı parçalamak ve hücreye erişim sağlamak için kısa süreli bir negatif basınç uygulayın. Tüm hücre konfigürasyonuna geçildiğinde, mühür testi, testin başlangıcında ve sonunda ani yükselmeler veya geçici akımlar şeklinde görülen büyük kapasitif akımları kaydedecektir.Sızdırmazlık testinde darbe uygulayın. Ardından, membran testi düğmesine tıklayın. Klempe X'te, erişim direnci membran direncini kaydedin.Bir not defterindeki membran kapasitansı, eksponansiyel uyumu görsel olarak doğrular. Membran kapasitansı hücre boyutuyla orantılıdır ve akım yoğunluğunu hesaplamak için kullanılacaktır. Erişim direnci ve membran direnci, kaydın devam etmek için yeterli olup olmadığını değerlendirmek amacıyla kullanılır.İyi bir kayıt, düşük bir erişim direncine sahip olacaktır. Şimdi membran test penceresini kapatın ve sızdırmazlık testi penceresindeki sızdırmazlık testi düğmesine tekrar tıklayın; membran kapasitansını ve amplifikatördeki seri direnci kompanse etmek için V out değerini -40 mV olarak ayarlayın, tüm hücre kapasitansını (whole cell cap) açın ve geçici durum minimuma inip akım düz bir çizgi haline gelene kadar tüm hücre kapasitansını ve seri direnci ileri geri ayarlayın. Gerekirse, amplifikatör üzerindeki hızlı kapasitans (fast cap) düğmesiyle pipet kapasitansını ayarlayın.Çok fazla veya çok az kompanzasyon, kalıntı kapasite geçişine neden olacaktır. Ardından, yüzde tahmin (percentage prediction) düğmesini %60 ile %80 arasına getirin; mühür testinde düz bir hat elde etmek için tüm hücre kapasitansını, seri direnci ve hızlı kapasitansı gerektiği gibi yeniden ayarlayın. Son olarak, hücrede osilasyon oluşturmadan yüzde kompanzasyonu yaklaşık %100'e getirin; bu sırada tüm hücre kapasitansı, seri direnç ve hızlı kapasitans potansiyometrelerini yeniden ayarlayarak darbenin mümkün olduğunca lineer kalmasını sağlayın.Direnç ve kapasitans kompanzasyonu sağlandıktan sonra; amplifikatör kapasitans seri direnç yüzdesi, kompanzasyon yüzdesi tahmini ve gecikme süresi için ayarlanan değerleri bir deftere not edin, kontrol 20 K banyo çözeltisi için harici çözelti valfini açın. Amplifikatördeki alçak geçiren kap filtresini iki kilohertz olarak ayarlayın. Ardından, yazılımdaki kayıt düğmesine tıklayarak akımları kaydetmeye başlayın.GER akımının içe doğru doğrultma özelliğini gözlemleyin. Bu durum, Nernst denklemi ile belirlenen potasyum ters çevirme potansiyelinin (EK) negatifindeki büyük bir içe doğru akım ve EK'nin pozitifindeki küçük bir dışa doğru akım olarak görülür. Kararlı bir bazal hat kaydettikten sonra, hücre dışı çözelti 20 K+ karbahol uygulayarak reseptör aracılı akım aktivasyonunu belirleyin.Pik aktivasyon gözlemlenip akım kararlı duruma ulaştığında, tekrar K banyo çözeltisine geçin ve bazal akım seviyesine ulaşılana kadar bekleyin. Ardından, gert akımlarının alkol aktivasyonunu incelemek için 20 k artı 100 millimolar etanol içeren harici çözeltiye geçin ve pik yanıtı bekleyin.Ardından tekrar 20 K banyo çözeltisine geçin ve bazal akım seviyesine ulaşana kadar bekleyin. Son olarak, bazal gert akımlarını belirlemek için 20 K artı 20 K baryum çözeltisine geçin ve buradaki yanıtı bekleyin. Gerk akımının inhibisyonu, prosedür boyunca -100 millivolt değerinde en belirgin hale gelerek görülmelidir.Farklı hücre dışı çözeltilerin uygulandığına karşılık gelen iz tarama numarasını not edin. Tek bir clamp fit dosyası, tüm deneyler için tüm taramaları içerecektir. GK verilerini analiz etmek için clamp FIT 8.2 yazılımını kullanın.Ekli yazılı protokoldeki talimatlara uygun olarak, yabani tip veya mutant GK kanalları eksprese eden HEC 2 9 3 T hücrelerinden iki farklı bütün hücre kaydı alınmış ve burada yabani tip GK iki için gösterildiği gibi bu videodaki talimatlara göre analiz edilmiştir. Soldaki panel, farklı solüsyonların varlığında voltaj rampası protokolü ile üretilen, üst üste bindirilmiş birkaç akımı içeren bir pencere barındırmaktadır. İçe doğru doğrultmaya dikkat edin.Bu, akım izindeki yaklaşık 50 milisaniyede, eksi 100 milivolttaki daha büyük içe doğru akımdır. Akım izindeki yaklaşık 200 ila 260 milisaniyede, sıfır ile artı 40 milivolt arasındaki küçük dışa doğru akım, endojen bir voltaj kapılı potasyum kanalından kaynaklanmaktadır. Bu, Gert akım imleci değildir.Bir tanesi maksimum içe doğru akım üzerine yerleştirilir ve imleç değerleri hesap tabloya yazılır. Hesap tabloda, iz numarası ve -100 milivolt'taki akım görülür.Veriler; bazal akımı, karbahol kaynaklı ve alkolle tetiklenen akımların yanı sıra baryum ile inhibe edilmiş akımı içermektedir. Benzer şekilde, farklı çözeltilerin varlığındaki voltaj ramp akımları da yer almaktadır. Mutant kanal L 2 57 w için 20 k artı 100 millimolar etanol veya 20 k artı beş millimolar karbahol veya 20 k artı baryum gösterilmiştir.Alkol ve karbo alkol tarafından indüklenen akımların önemli ölçüde daha küçük olduğuna dikkat edin. Bu bulgular, söz konusu kalıntının alkol ve g beta gamma alt birimleri tarafından GK kanallarının kapılanmasında önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bir mutasyonun nasıl oluşturulacağı ve gelişmiş elektrofizyolojik teknikler kullanılarak kanal fonksiyonu üzerindeki etkisinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu yöntem kavrandıktan sonra, bölge yönelimli neogenez tekniği iki ila üç gün içinde tamamlanabilir ve beş veya daha fazla mutasyona kadar ölçeklendirilebilir. Bu tekniklerin geliştirilmesi, iyon kanalı biyofizikçilerinin iyon kanalı fonksiyonlarının ve kapılanmasının temel özelliklerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Ayrıca, araştırmacıların bir iyon kanalı genindeki tek bir mutasyon nedeniyle ortaya çıkan insan hastalıklarını incelemelerine olanak tanır.

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

İfade ve HEK-293T Hücreler Rekombinant Gerilim Gated İyon Kanalları Elektrofizyolojik Kayıt için optimize edilmiş Transfeksiyon Strateji

Lipid membranlar bir prototip voltaj kapılı potasyum kanalı tam sulandırılması için prosedürler açıklanmıştır. Sulandırılmış kanallar biyokimyasal testler, elektrik kayıtları, ligand ve tarama elektron kristalografik çalışmalar için uygundur. Bu yöntemler, başka zar proteinlerinin yapısal ve fonksiyonel çalışmalar için genel uygulamalar olabilir.

Yapısal ve İşlevsel Araştırmalar için Lipid Membranlar bir Kv Kanal Sulandırma

Burada tarif edilen hücre-bağlı patch-clamp tekniği ile, bir iyon kanalının güncel kayıt uzun uzanır elde edilmesi için bir işlemdir. Bu yöntem, gerçek zamanlı olarak, gözlemlemek için izin veren, biyolojik sinyali altında yer open-close kanal konformasyonlarının desen. Bu veriler rahatsız biyolojik membranların kanal özellikleri hakkında bilgilendirmek.

Tek kanallı bir hücre-bağlı Patch-clamp kayıt

Burada anlatılan Kistik Fibrozis kusurlu olan bu klorür kanalı, etkinliğini korur saflaştırılmış yabani tip ve mutant CFTR proteininin fonksiyonel yeniden bir hızlı ve etkili bir yöntemdir. CFTR aracılık ettiği yeniden proteoliposomes gelen iyodür akış kanalı aktivitesinin çalışmaları ve küçük moleküllerin etkilerini sağlar.

Saf Yabanitip ve Mutant CFTR Protein Fonksiyonel Sulandırma ve Kanal Aktivite Ölçümleri

Bu makalenin ilk bölümü, plazma zarlarında veziküler Na+/H+ değiştiricileri eksprese eden mutant hücre hatlarının nasıl seçileceğini gösterir. İkinci bölüm, bu değiştiricilerin iyon seçiciliğini ve kinetik parametrelerini belirlemek için kullanılan hücre içi pH ölçümlerine ve hızlı iyon alımına dayalı protokoller sağlar.

Na fonksiyonel karakterizasyonu<sup&gt; +</sup&gt; / H<sup&gt; +</sup&gt; Seçim Proton-öldürme Kullanma hücre içi Bölmeler ve Eşanjörleri Plazma Membran Them Express

Kalıtsal kardiyak aritmiler genellikle bir veya daha fazla iyon kanallarının yüzey teslim değiştiren mutasyonlar neden olur. Burada, TSA-201 hücrelerinde eksprese edilen rekombinant iyon kanallarının göreli ve toplam hücre yüzeyi protein ekspresyonunun bir ölçümünü sağlamak için tahliller flow sitometri uyum sağlar.

Akım Sitometri Kullanımı rekombinant İyon Kanallarının göreli Hücre Yüzey ve toplam İfade tayini

bir heterolog ifade sistemi ile incelenmesi iyon kanalları biyomedikal araştırmalarda bir çekirdek tekniği haline gelmiştir. Bu yazıda, bir uyarılabilir promoterin kontrolü altında geçici transfeksiyon gerçekleştirerek sıkı bir şekilde kontrol iyon kanal ekspresyonunu elde etmek için bir zaman etkili bir yöntem sunmaktadır.

İndüklenebilir geçici transfeksiyon yoluyla kontrol edilebilir iyon kanal İfade

İyon kanalları arıtma kez, zorlu ama bir kez elde, potansiyel olarak vitro araştırmalar fonksiyonları ve yapıları kanallarının izin verebilirsiniz. Burada, biz ifade ve arıtma memeli bestrophin protein, bir ailenin Ca2 +için kademeli yordamlar açıklar-Cl- kanalları aktif.

İfade ve arıtma memeli Bestrophin iyon kanalları

Bu iletişim kuralı tarafından cryo-elektron mikroskobu, verimli bir şekilde en az çaba ve toksisite, protein ayıklama, arıtma ile memeli hücrelerinde genlerin ifade etmek için kullanılan bir baculovirus sistemi de dahil olmak üzere iyon kanal yapılarını belirlemek için kullanılan teknikler açıklanır, ve kalite kontrol, örnek kılavuz hazırlık ve tarama, hem de veri toplama ve işleme.

İfade ve insan Lipid duyarlı ba * kanal TRPC3 arınma için tek-parçacık Cryo-elektron mikroskobu ile yapısal kararlılık

Bu protokol, membran potansiyelindeki değişiklikleri ölçerek elektrojenik membran proteinlerinin incelenmesi için bir yöntem açıklamaktadır. Bu tahlil, epitel hücre hatlarında endojen olarak eksprese edilen çoklu iyon kanallarının fonksiyonel olarak okunması için bir platform sağlar.

İki Epitel Hücre Hattında İki Endojen İyon Kanalının Yüksek Verimli Fonksiyonel Çalışması için Membran Potansiyelinin Floresan Bazlı Bir Analizi

İyon kanallarının farmakolojik olarak hedeflenmesi, solid tümörlerin tedavisinde umut verici bir yaklaşımdır. Kanser hücrelerinde iyon kanalı fonksiyonunu karakterize etmek ve iyon kanalı modülatörlerinin kanser canlılığı üzerindeki etkilerini test etmek için ayrıntılı protokoller sağlanmıştır.

Kanser Hücrelerinde İyon Kanallarının Taranması

Öğrenin, memeli hücrelerde GRK iyon kanallarının fonksiyonel analizi için yönlendirilmiş mutagenez ve yama kelepçesi tekniklerini. Bu yöntem nöronal uyarılabilirlik ve kanal aktivasyonunu incelemek için kullanılır.

İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

Daha fazla video keşfet