İyon Kanalları ve Fonksiyonel Analiz Mutagenez Heterologously Memeli Hücreleri cinsinden ifade edilir

G-proteini kapılı içe doğru doğrultucu potasyum kanalları veya GIRK'lar, nöronların eksitabilitesinin düzenlenmesinde önemlidir. GIRK'lar, muskarinik reseptör M2R gibi G-proteini kenetli reseptörler (GPCR'lar) ve alkol tarafından aktive edilebilir; bu durum alkol bağlanma bölgesindeki mutasyonların etkilerini incelemek için kullanılır. Aktivasyon üzerine, bölgeye özgü mutagenez yoluyla GIRK cDNA'sına tek bir nokta mutasyonu eklenir, saflaştırılmış GIRK konstrüktleri YFP konstrüktleri ile birlikte memeli hücrelerine transfekte edilir ve transfeksiyon verimliliği floresan görüntüleme ile değerlendirilir.

Ardından, alkol ve G-proteini bağımlı aktivasyonu karşılaştırmak için tüm hücre yama kenetleme (whole cell patch clamp) analizi gerçekleştirilir. Bu görsel deney gösterimi, LY kanallarının fonksiyonunun nasıl inceleneceği konusunda size temel bilgiler sağlayacaktır. Bugün, alkolün grup kanallarını nasıl aktive ettiği sorusuna odaklanacağız.

Burada gösterilen bölge yönelimli neogenez tekniği, iyon kanalı fonksiyonları hakkında içgörü sağlayabilir. Bu teknik, bir gende meydana gelen mutasyonun insan hastalığına yol açtığının bilindiği diğer sistemlere de uygulanabilir. Bunlar, hot cell patch Climbing tekniğinin gösterimleridir; bu teknik, kullanılabilir veriler üretmek için hassasiyet, uygun elektronik kompanzasyon ve pratik gerektiren birçok adım içerdiğinden kritiktir.

Bu protokolde transfeksiyon için kullanılan DNA şu şekilde hazırlanır. İlk olarak, PCR'dan elde edilen GRK alt birimi DNA'sı doğrudan memeli ekspresyon plazmidi PC DNA 3.1'e klonlanır. Nokta mutasyonları, uygun şekilde tasarlanmış primerler ve quick change XL iki bölge yönlendirmeli mutajenez kiti kullanılarak oluşturulur.

Bu sistem kullanılarak, tüm plazmidin replike edildiği ve primerler tarafından kodlanan nokta mutasyonlarının tanıtıldığı bir PCR işlemi gerçekleştirilir. PCR sonrası, replike edilen plazmidler DPN I restriksiyon enzimi ile sindirilir ve ardından ısı şoku yöntemiyle XL 10 gold ultra yetkin e. coli hücrelerine transforme edilir. Transforme edilmiş bakteriler, ampicillin içeren LB agar plaklarında büyütülür; plazmidi taşıyan bakteriler ampicillin'e dirençli olacak ve koloni oluşturacaktır.

İzole edilen koloniler seçilir ve mini kültürlerde büyütülür. Plazmid DNA'yı izole etmek için mini prep işlemleri gerçekleştirilir. Ardından, başarıyla transforme edilen mutantları tanımlamak için DNA dizilemesi yapılır.

E coli daha büyük bir şarjda büyütülür ve daha büyük miktarlarda plazmit DNA hazırlamak için maxi prep işlemleri gerçekleştirilir; her bir iki kuyucuğa yaklaşık 1x10⁵ HEK 293T hücresi ekilir. 12 kuyucuklu bir plakada, biri mutant ve diğeri kontrol için olmak üzere ayrılmıştır. Vahşi tip kanalı 37 °C'de inkübe edin.

Sekiz ila 24 saat sonra hücreler substrata tutunacak ve transfeksiyon için hazır hale gelecektir. Hücreleri; üretici talimatlarına uygun olarak 0,2 µg kanal CDNA, 0,4 µg M2R reseptör CDNA ve 0,04 µg Y-F-P-C-D-N-A ile lipo 2000 kullanarak transfekte edin. Başarıyla transfekte edilmiş hücreleri belirlemek için hücreleri 24 saat boyunca inkübe edin.

İstenen inkübasyon süresi dolduktan sonra, transfeksiyon verimliliğini belirlemek için hücreleri ters floresan mikroskobunun tablasına yerleştirin. Transfekte olan hücrelerin yüzdesini belirlemek için floresan ve DIC görüntülerini karşılaştırın. Kültür kabını inkübatöre geri koyun.

12 milimetrelik cam lamelleri temizleyin ve kullanıma kadar etanol içinde saklayın. Steril kabin içerisinde alevle yakarak kalıntı etanolu uzaklaştırın. Lamelleri 24 kuyucuklu bir plakaya yerleştirin ve 0.2 mg/mL ile kaplayın.

Transfeksiyondan 24 saat sonra poly-D-lysine ile kaplı yüzeylerdeki hücreleri tripsinize edin ve 24 kuyucuklu bir kabın içindeki poly-D-lysine kaplı lamellerin 4 ila 8 kuyucuğuna, kuyucuk başına 4x10³ hücre olacak şekilde ekleyin. Whole-cell patch clamp işlemini gerçekleştirmeden önce hücreleri 24 ila 48 saat daha inkübe edin. Borosilikat elektrot camı ve iki aşamalı dikey çekici kullanarak patch elektrotları hazırlayın.

İdeal olarak, tamamlanmış elektrot üç ila yedi mega ohm dirence sahip olmalı ve ısı ile cilalama gibi ek işlemlere ihtiyaç duymamalıdır. Yama kenetleme (patch clamping) için, transfekte edilmiş hücrelerin bulunduğu bir lamelin 20 milimolar potasyum veya 20 K eksternal çözelti içeren 35 milimetrelik bir kaba yerleştirin. Kabı, ters floresan mikroskobunun tablasına yerleştirin.

Burada kullanılan patch clamping düzeneği bir perfüzyon sistemi kullanmaktadır. Bu sistem, bir manifolda bağlı tüpler aracılığıyla yerçekimi ile beslenen ve hücrelere uygulanacak hücre dışı çözeltileri içerir. Her bir çözelti, bir solenoid sıkıştırma valfi ile uzaktan kontrol edilir.

Hücreleri odaklamak ve bulmak için DIC kullanın. YFP pozitif hücreleri belirlemek için YFP filtresine geçin. YFP pozitif hücreler tanımlandıktan sonra, perfüzyon sistemi ucunu, nöro floresan hücreden 20 ila 30 mikron veya iki ila üç hücre boyu uzaklığa konumlandırın.

Bir elektrodu iç elektrot çözeltisiyle doldurun. Bir şırınga ve esnek iğne kullanarak, ucundaki hava kabarcıklarını gidermek için doldurulmuş elektroda hafifçe vurun. Elektrotları, bir AXO patch 200 B amplifikatörünün baş aşamasına takın.

Amplifikatör ayarlarının tekrar tek bir konfigürasyona eşit olduğunu kontrol edin. Tüm hücre anahtarı beta eşittir bir ve alçak geçiren kap filtresi 10 kilohertz olarak ayarlanmıştır. Elektrot ucunu temiz tutmak için şırınga ve klemple pozitif basınç uygulayın.

Ardından, elektrot ucunu banyoya yerleştirmek ve hücrenin üzerine taşımak için bir mikromanipülatör kullanın. Amplifikatörü V track moduna ve metre düğmesini V track konumuna getirin. Daha sonra, amplifikatör metre ekranındaki voltajı 0.00 değerine getirerek pipet potansiyelini sıfırlamak için amplifikatör üzerindeki pipet ofset potansiyel metresini kullanın.

Alternatif olarak, amplifikatörde V clamp moduna geçin ve bir test voltaj basamağı uygulamak için test pulse düğmesini seçin. Dikdörtgen voltaj basamağı, clamp'in sızdırmazlık testi penceresinde görünecektir. Bazal akımı sıfır nanoamper seviyesine getirmek için amplifikatör üzerindeki pipet offset ayarını düzenleyin.

Sızdırmazlık testi, üç ila yedi mega ohm olması gereken elektrot direncini gösterecektir. Ardından, sızdırmazlık testi penceresini kapatın. Açılır menüden "acquire open protocol" (açık protokolü edin) seçeneğini belirleyin.

Ardından kaydedilmiş bir voltaj protokolü seçin. Burada seçilen protokol, tek bir voltaj adımını -100 millivolt değerine getirmek ve her iki saniyede bir +40 millivolt değerine kadar yükseltmek üzere önceden programlanmıştır. Bu rampa protokolü, tersine dönme potansiyelinin ve GK kanallarının içe doğru doğrultma özelliğinin gözlemlenmesine olanak tanır.

Voltaj kapılı iyon kanalları için, dikdörtgen bir voltaj basamağı daha uygun olabilir; mikromanipülatörün hassas ayarı kullanılarak hücreye yaklaşılır, pozitif basınç serbest bırakılır ve hücre yüzeyine temas ettikten sonra hafif bir negatif basınç uygulanır. Seal test ekranında meydana gelen direnç artışı izlenir. Direnç gigaohm seviyelerine ulaştığında, elektrot membrana sızdırmaz bir şekilde yapışmış demektir.

Bu durum giga mühür (giga seal) olarak adlandırılır. Bir şırınga kullanarak, membranı parçalamak ve hücreye erişim sağlamak için kısa süreli bir negatif basınç uygulayın. Tüm hücre konfigürasyonuna geçildiğinde, mühür testi, testin başlangıcında ve sonunda ani yükselmeler veya geçici akımlar şeklinde görülen büyük kapasitif akımları kaydedecektir.

Sızdırmazlık testinde darbe uygulayın. Ardından, membran testi düğmesine tıklayın. Klempe X'te, erişim direnci membran direncini kaydedin.

Bir not defterindeki membran kapasitansı, eksponansiyel uyumu görsel olarak doğrular. Membran kapasitansı hücre boyutuyla orantılıdır ve akım yoğunluğunu hesaplamak için kullanılacaktır. Erişim direnci ve membran direnci, kaydın devam etmek için yeterli olup olmadığını değerlendirmek amacıyla kullanılır.

İyi bir kayıt, düşük bir erişim direncine sahip olacaktır. Şimdi membran test penceresini kapatın ve sızdırmazlık testi penceresindeki sızdırmazlık testi düğmesine tekrar tıklayın; membran kapasitansını ve amplifikatördeki seri direnci kompanse etmek için V out değerini -40 mV olarak ayarlayın, tüm hücre kapasitansını (whole cell cap) açın ve geçici durum minimuma inip akım düz bir çizgi haline gelene kadar tüm hücre kapasitansını ve seri direnci ileri geri ayarlayın. Gerekirse, amplifikatör üzerindeki hızlı kapasitans (fast cap) düğmesiyle pipet kapasitansını ayarlayın.

Çok fazla veya çok az kompanzasyon, kalıntı kapasite geçişine neden olacaktır. Ardından, yüzde tahmin (percentage prediction) düğmesini %60 ile %80 arasına getirin; mühür testinde düz bir hat elde etmek için tüm hücre kapasitansını, seri direnci ve hızlı kapasitansı gerektiği gibi yeniden ayarlayın. Son olarak, hücrede osilasyon oluşturmadan yüzde kompanzasyonu yaklaşık %100'e getirin; bu sırada tüm hücre kapasitansı, seri direnç ve hızlı kapasitans potansiyometrelerini yeniden ayarlayarak darbenin mümkün olduğunca lineer kalmasını sağlayın.

Direnç ve kapasitans kompanzasyonu sağlandıktan sonra; amplifikatör kapasitans seri direnç yüzdesi, kompanzasyon yüzdesi tahmini ve gecikme süresi için ayarlanan değerleri bir deftere not edin, kontrol 20 K banyo çözeltisi için harici çözelti valfini açın. Amplifikatördeki alçak geçiren kap filtresini iki kilohertz olarak ayarlayın. Ardından, yazılımdaki kayıt düğmesine tıklayarak akımları kaydetmeye başlayın.

GER akımının içe doğru doğrultma özelliğini gözlemleyin. Bu durum, Nernst denklemi ile belirlenen potasyum ters çevirme potansiyelinin (EK) negatifindeki büyük bir içe doğru akım ve EK'nin pozitifindeki küçük bir dışa doğru akım olarak görülür. Kararlı bir bazal hat kaydettikten sonra, hücre dışı çözelti 20 K+ karbahol uygulayarak reseptör aracılı akım aktivasyonunu belirleyin.

Pik aktivasyon gözlemlenip akım kararlı duruma ulaştığında, tekrar K banyo çözeltisine geçin ve bazal akım seviyesine ulaşılana kadar bekleyin. Ardından, gert akımlarının alkol aktivasyonunu incelemek için 20 k artı 100 millimolar etanol içeren harici çözeltiye geçin ve pik yanıtı bekleyin.

Ardından tekrar 20 K banyo çözeltisine geçin ve bazal akım seviyesine ulaşana kadar bekleyin. Son olarak, bazal gert akımlarını belirlemek için 20 K artı 20 K baryum çözeltisine geçin ve buradaki yanıtı bekleyin. Gerk akımının inhibisyonu, prosedür boyunca -100 millivolt değerinde en belirgin hale gelerek görülmelidir.

Farklı hücre dışı çözeltilerin uygulandığına karşılık gelen iz tarama numarasını not edin. Tek bir clamp fit dosyası, tüm deneyler için tüm taramaları içerecektir. GK verilerini analiz etmek için clamp FIT 8.2 yazılımını kullanın.

Ekli yazılı protokoldeki talimatlara uygun olarak, yabani tip veya mutant GK kanalları eksprese eden HEC 2 9 3 T hücrelerinden iki farklı bütün hücre kaydı alınmış ve burada yabani tip GK iki için gösterildiği gibi bu videodaki talimatlara göre analiz edilmiştir. Soldaki panel, farklı solüsyonların varlığında voltaj rampası protokolü ile üretilen, üst üste bindirilmiş birkaç akımı içeren bir pencere barındırmaktadır. İçe doğru doğrultmaya dikkat edin.

Bu, akım izindeki yaklaşık 50 milisaniyede, eksi 100 milivolttaki daha büyük içe doğru akımdır. Akım izindeki yaklaşık 200 ila 260 milisaniyede, sıfır ile artı 40 milivolt arasındaki küçük dışa doğru akım, endojen bir voltaj kapılı potasyum kanalından kaynaklanmaktadır. Bu, Gert akım imleci değildir.

Bir tanesi maksimum içe doğru akım üzerine yerleştirilir ve imleç değerleri hesap tabloya yazılır. Hesap tabloda, iz numarası ve -100 milivolt'taki akım görülür.

Veriler; bazal akımı, karbahol kaynaklı ve alkolle tetiklenen akımların yanı sıra baryum ile inhibe edilmiş akımı içermektedir. Benzer şekilde, farklı çözeltilerin varlığındaki voltaj ramp akımları da yer almaktadır. Mutant kanal L 2 57 w için 20 k artı 100 millimolar etanol veya 20 k artı beş millimolar karbahol veya 20 k artı baryum gösterilmiştir.

Alkol ve karbo alkol tarafından indüklenen akımların önemli ölçüde daha küçük olduğuna dikkat edin. Bu bulgular, söz konusu kalıntının alkol ve g beta gamma alt birimleri tarafından GK kanallarının kapılanmasında önemli bir rol oynadığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bir mutasyonun nasıl oluşturulacağı ve gelişmiş elektrofizyolojik teknikler kullanılarak kanal fonksiyonu üzerindeki etkisinin nasıl inceleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu yöntem kavrandıktan sonra, bölge yönelimli neogenez tekniği iki ila üç gün içinde tamamlanabilir ve beş veya daha fazla mutasyona kadar ölçeklendirilebilir. Bu tekniklerin geliştirilmesi, iyon kanalı biyofizikçilerinin iyon kanalı fonksiyonlarının ve kapılanmasının temel özelliklerini keşfetmelerinin önünü açmıştır. Ayrıca, araştırmacıların bir iyon kanalı genindeki tek bir mutasyon nedeniyle ortaya çıkan insan hastalıklarını incelemelerine olanak tanır.