Name: Yetişkin Hipokampal Arctic Zemin Sincap Nöral Kök Hücre Büyüme ve Farklılaşma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-07T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Keşfedin yetişkin Arktik zemin sincaplarından hipokampal nöral kök hücrelerinin ekimi, çoğaltılması ve nöron ile glial hücrelere farklılaştırılması yöntemini. Bu teknik iskemik koşullarda nörogenez araştırmaları için benzersiz bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materyal Komutanlığı hibe # 05178001 ve Nörolojik Bozukluklar ve İnme Ulusal Enstitüsü NS041069-06 tarafından desteklenmiştir. Biz Joel Vonnahme protokol yararlı yorumlar için teşekkür ederim.

1. AGS Nöral Kök Hücre ve Medya Hazırlık <ol><li> Bir şekilde izole nöral kök hücreler, daha önce açıklanan 9 Yetişkin hipokampal Arctic zemin sincap (AGS) Kriyoprezerve şişeleri ticari olarak elde edilebilir. Hücreler, hücreleri Kriyoprezerve bir durumda kalmasını sağlamak için kuru buz içeren yalıtılmış paketleri gecede sevk edilmektedir. Bütünlüğünü korumak için, açmak -150 daha düşük hemen alınması ve depolanması ile hücreleri ° C, ya da bir sıvı nitrojen Dewar buhar fazında. </li><li> AgsNSC Bazal Orta hazırlayın +% 5 FBS 95 ml agsNSC Bazal Orta 5 mL FBS (LS-1012) ekleyerek, </li><li> 500 mcL B-27 Supplement (Invitrogen) 50 ml agsNSC Bazal Orta ekleyerek agsNSC Genleşme Orta hazırlayın. Kullanana kadar 1mL alikotları ve -20 ° C'de saklayın B27 kalan bölün. </li><li> 25 ml Sıcak agsNSC Bazal Orta +% 5 - 37 ° C su banyosunda agsNSC Genişleme Orta FBS ve 20 ml. </li><li> Poli-L-ornitin ile genişletilmesi için kullanılan Coat matara <ol><li> Poli-L-ornitin (10 mg / ml) çalışan bir çözüm çözülme. ° C ile bir kez çözdürülmelidir bir ay kadar 2-8 arasında çözüm saklayın. </li><li> 8 mL Poli-L-Ornithine çalışma çözeltisi ekleyin ve bir Bacalı T-75 şişesi, balonun tüm kültür yüzeyi üzerinde eşit çözüm dağıtmak. (Kullanım 0.5 kullanılmış olabilecek diğer kültür gemiler için çözüm çalışma miktarını ayarlayın - 10 cm 2 kültür yüzey başına 1,0 mL Poli-L-Ornithine çözüm) </li><li> 37 ° C'de en az 24 saatlik bir matara inkübe edin. (Poli-L-Ornithine kaplı kültür damarlarının eklendi CO 2 olmadan bir kuluçka inkübasyon için tercih edilir.) Kaplamalı şişeler inkübatör iki hafta kadar saklanabilir. </li><li> Kullanmadan önce, şişeden Poli-L-Ornithine çalışma çözüm aspirat ve iki kez steril doku kültürü dereceli su ile yıkayın. Kullanmadan önce şişeyi neredeyse kuru hale gelene kadar sıvı aspire edin. </li></ol></li><li> Dewar bir şişe çıkarın ve flakon kapağı sıkıca kapatılmış olup olmadığını kontrol edin. Flakon neredeyse tamamen çözülene kadar yaklaşık 60-90 saniye veya 37 ° C su banyosunda bırakarak flakon flakon alt yarısında üst tutun; küçük bir miktar buz hala görünür olmalıdır. Potansiyel kontaminasyonu önlemek için, suyun flakon kapağı dışarı tutmak. Çözülme üzerinden yapmayın, bunu hücrelere zarar verebilir. </li><li> % 70 etanol veya isopropanol flakon dış Sprey, daha sonra biyolojik güvenlik kabini flakon. Kontaminasyon veya sıçramak önlemek için dikkatli bir şekilde kapağı çıkarın. </li><li> Steril bir pipet kullanarak 1 mL agsNSC Bazal medya +% 5 FBS ekleyerek yavaşça flakon hücrelerin yeniden askıya. 25 ml sıcak agsNSC Bazal Orta yeniden askıya hücreleri Transfer +% 5 FBS 50 ml santrifüj tüpüne. </li><li> Kriyo-flakon sulandırılmış hücre süspansiyonu ile bir kez durulayın. 6 dakika boyunca 150 xg'de hücreleri santrifüjleyin. En iyi sonuç için, her bir santrifüj tipi için hızı hesaplar. </li><li> Hücreleri aşağı dönerken, kuru poli-L-ornitin kaplı T-75 balonuna 10 ml agsNSC Genişleme Orta ve rh FGF-temel (40ng/mL) 40 mcL ekleyin. Santrifüj sonrasında, pelet aspire özen Süpernatant sıvı aspire. 10 ml agsNSC Genişleme Orta hücrelerin yeniden askıya aldı. AgsNSC Genişleme Orta yeniden askıya hücreler, T-75 balonuna ortama aktarın. </li><li> Kültür gemi yan-yan damar içindeki hücreler eşit olarak dağıtmak için yavaşça sallayın. </li><li> 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör Yeri numaralı seribaşı kültür gemi. Hücreler balon eklemek ve süreçleri tohumlama iki saat içinde oluşmaya başlar. Kayan hücreleri kalır ve orta içinde tıkıştırılmış, sonra% 5 FBS hücreler santrifüj ve taze orta ve balon adımları 1,8-1,10 çalıştırmak. </li></ol> 2. AgsNSC, genişletilmesi <ol><li> Çözülme ve tohum hücreleri iki gün (48 saat) sonra, tam orta yerine 20 mL agsNSC Genişleme Orta artı rh FGF-temel bir mcL 40 başak kullanarak yapılmalıdır. </li><li> 40 gün aşağıdaki aşılama rh FGF-bazik mcL Spike şişeler. Hücreler, üçüncü veya dördüncü gün sonra aşılama ile% 75-80 izdiham ulaştığınızda trypsinize hazır olacaktır. 4 gün sonra aşılama daha uzun süre kültür farklılaşmamış kök hücreleri uzun kuluçka hücreleri 3. adımında trypsinization tarafından yaralı olabilir, nöronlarda ve nöron ayırt başlamak için izin verecek, çünkü tavsiye edilmez. Rh FGF-temel bir haftaya kadar 4 ° C'de saklanır ve hala faaliyet sürdürmek olabilir. Daha fazla zamana ihtiyaç duyulması halinde rh FGF-temel -20 ° C'de bir ek donma / çözülme de gidebilirsiniz. </li></ol> 3. Hücre, Trypsinization <ol><li> agsNSC aşılama 3 ila 4 gün sonra geçişli olmalıdır. AgsNSC tekrar genişletilmiş olacak Pasajlanması önce 24 saat ve bir hafta arasında bir poli-L-ornitin kaplı şişesi hazırlayın. </li><li> Aspirekültür geminin orta. 2.5 mL% 0.05% Trypsin/0.02 yüzey alanının her 75 cm 2 geminin EDTA (CM-0017). Tüm hücreleri sağlamak için hafifçe Swirl tripsin / EDTA ile kaplanmıştır. Hücreler normal hücrelerin birleştiği bağlı olarak, 60 saniye içinde yüzeyden ayırmak için başlar. Trypsinize üzerinde etmeyin, bunu hücrelere zarar verir. Hafifçe birkaç taraftan kültür damarı dokunarak dekolmanı teşvik edecektir. </li><li> Hücrelerin müstakil hale sonra, 10 ml agsNSC Bazal Orta eklemek +% 5 FBS balon. Tripsin çözüm sağlamak için yavaşça girdap nötralize edilir. Aseptik laboratuvar teknikleri kullanarak, agsNSC Bazal orta +5% FBS 10 ml içeren steril bir santrifüj tüpü içine hücreleri pipetle. AgsNSC Bazal Orta ek olarak 10 mL şişeyi tekrar yıkanarak +% 5 FBS tekrarlayın ve ilk yıkamada ile birleşir. </li><li> 6 dakika boyunca 150 xg'de Santrifüj hücreleri yukarıda açıklandığı gibi. Santrifüj sonra, hücreler temiz bir gevşek pelet oluşturmalıdır. Hafifçe yukarı aşağı pipetleme ve 10 ml pipet ile 2X santrifüj tüpüne nötralize tripsin ve orta aspire edin ve önceden ısıtılmış agsNSC Bazal Orta 10 ml yeniden askıya hücre pelletini (kişi başına T-75 balon) +% 5 FBS. Aşağıda açıklandığı gibi bir hücre sayımı gerçekleştirin. </li></ol> 4. Hücre Kaplama için Standart Hesaplama <ol><li> Aseptik teknik kullanarak, girdap hücre süspansiyonu ve bir mikrosantrifüj tüpe transfer hücre süspansiyonu 15 mcL. % 0.4 Tripan Blue 15 mcL ekleyin. Yavaşça karıştırın ve hücre süspansiyon Odası (katalog # 1490: Hausser Bilimsel, Sayma Parlak Hattı gibi temiz bir hemasitometre odalarının her biri için 10 mcL <a href="http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">yük</a> http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm) . </li><li> Hemasitometre 4 kadranın en az güvenin. Tripan Blue pozitif mavi hücreler ölü ve sayılmamalıdır. Doğru hücre sayımı için, optimum sayıda kadran başına hücre 25-75 hücreleri olmalıdır. </li><li> Hücrelerinin sayımı sonra, ortalama 4 kadranın hesaplar. Hücre sayısı ortalama 10.000 ve seyreltme faktörü ile çarpın (2 tavsiye edilen hacim kullanarak) mL başına hücre sayısını belirlemek için. Toplam yüzdesini canlılığı% 92 den az olması durumunda bir takım nedenleri olabileceğini unutmayın. Bir nedeni düşük canlılığı FBS ile nötralizasyon tripsin önce, trypsinization üzerinde olabilir. Tripsin serum (FBS) konsantrasyonu çok düşük olduğu ve hücrelerin tripsinize olmaya devam başka bir nedeni olabilir. Üçüncü olarak, hücreler, kök hücreler, hücre-hücre teması nedeniyle ayırt trypsinization sırasında yaralanmaya yol açan neden çok konfluent olabilir. Bu yöntem yakından takip ise 3 veya daha fazla çiftlenmeler verim&gt; bir başlangıç ​​sayısı 500.000 ~ 4.000.000 hücrelerinin bir nüfus veren, beklenen olabilir. </li></ol> 5. Başka bir Genişleme Flask Aşılanması <ol><li> Bir gemi aşılamak için gerekli olan hücrelerin toplam sayısını belirlemek için, inoküle damar yüzey alanı (cm 2) (cm 2 başına 6.600 hücreleri ya da T-75 şişesi ortalama 500.000 hücreleri) tarafından istenen ekim yoğunluğu çarpın . Birden fazla gemi aşılama gemilerin toplam sayısı gemi başına bir hücre sayısını çarpın. Her iki tekne de aşılamak için gerekli hücre süspansiyonu hacmi (ml) belirlemek için, canlı hücre / hücre süspansiyonu mL sayısına göre bir gemi aşılamak için gerekli hücrelerin sayısı bölün. Birden fazla gemi aşılama hücre süspansiyonu inoküle edilecek gemilerin toplam sayısı bir gemi için gerekli olan hacim çarpılarak gerekli toplam hacmi hesaplarsanız. </li><li> Gevşek bir pelet bırakarak agsNSC Bazal Orta istenen hücre hacmi +% 5 FBS santrifüjleyin. Normalde 500.000 hücreleri +5% FBS daha önce açıklandığı gibi agsNSC Bazal Orta toplam hacmi 25 mL getirilir. Sıvı aspire ve 10 ml Bu ekstra santrifüj adım aşılamadan önce FBS kaldırmak için gerekli agsNSC Genişleme Orta gevşek pelet yeniden askıya. T-75 balona 10 ml önceden ısıtılmış agsNSC Genişleme Orta ekleyin. T-75 balona yeniden süspanse hücre süspansiyonu 10 ml ekleyin, daha sonra rh erlene FGF-temel 40 mcL ekleyin. Herhangi bir zamanda çalışmak için maksimum sayıda şişe karar verirken trypsinization ve aşılama 1.5 saat daha uzun sürer gerektiğini düşünün. Bir de sayısız şişeler kullanıyorsanız, tam bir medya değişiklikler için yeterli medya olmalıdır. </li><li> Yavaşça şişeyi yan yana gelen hücreler eşit olarak dağıtmak için rock ve daha önce açıklandığı gibi 37 ° C,% 5 CO 2 inkübatör, kültür damarları. </li></ol> 6. Farklılaşma için Well plakalar Aşılama için Hücreler seyreltilmesi <ol><li> Herhangi bir çok iyi formatı kullanılır, ancak BD Biocoat Poli-L-lisin kaplı 96 kuyucuğu inokülasyon des olabilirburada açıklanan şekilde değiştirin. 96 çok iyi plaka için ortalama 0.2 ml inoküle kuyu sayısı çarpılarak denemeniz için gerekli hücre süspansiyonu hacmi belirlemek ve aşılama esnasında herhangi bir hacim kaybı karşılamak için yaklaşık% 10 ekleyin. 75.000 hücre / mL 'lik bir hücre yoğunluğu seyreltme hesaplayın. % 2 FBS bir final konsantrasyonu (Tablo 1) elde etmek için Farklılaşma Orta eklenecek FBS miktarını belirlemek. FBS ve Farklılaşma Orta karıştırın. Hücreler Farklılaşma Orta FBS ile hesaplanan hacmi ile dikkatlice karıştırın. (Not: santrifüj sırasında hücreler agsNSC Bazal Orta +% 5 FBS FBS santrifüj sırasında hücreleri korur ve hücre adezyon FBS inhibe differention kolaylaştırır iken% 2 FBS Sulandırma hücreleri çok iyi bir yüzeye yapışma sağlayacaktır. 2% FBS farklılaşma teşvik için daha fazla seyreltilir. İnsülin Transferrin-Selenyum (ITS-e) da farklılaşma tanıtmak için Farklılaşma Orta yer almaktadır. </li><li> Biyogüvenlik kabini, her iyi, çok kanallı pipet ve büyük orifis ipuçları kullanarak Poli-L-lizin kaplı 96-plaka seyreltilmiş hücre süspansiyonu steril bir combitip rezervuar 200 uL dağıtmak. 37 1.5-2 saat plakaları ° C'de,% 5 CO 2. Hücreleri, bağlı, yaklaşık 90-120 dakika sonra, her bir kuyunun kullanarak büyük orifis pipet uçları dikkatlice orta (96 kuyucuğu için 100 mcL)% 50 çıkarmak sonra. Dikkatlice tekrar büyük orifis pipet uçları kullanarak, sıcak agsNSC Farklılaşma Orta ile kaldırıldı hacim değiştirin. (Standart orifis ipuçları Kullanım hücrelere zarar olabilir). </li><li> İki gün sonra aşılama (~ 48 saat),% 50 orta değişikliği agsNSC Farklılaşma Orta ve büyük orifis pipet uçları kullanarak gerçekleştirin. </li></ol> 7. Nöronların Bakım <ol><li> Nöronal Bakım Orta talimatları başına NeuraLife, glutamin ve B27 kullanarak hazırlayın. Nöronal Bakım Orta haftalık hazırlanmalıdır. </li><li> Son agsNSC Farklılaşma Orta değişikliği, normalde 4. Gün yazılan aşılama iki gün sonra,% 50 orta değiştirme Nöronal Bakım Orta kullanarak gerçekleştirin. </li><li> Her 2 ila 3 gün Nöronal Bakım Orta kullanarak% 50 orta değiştirmeleri gerçekleştirmeye devam etmektedir. Nöronal süreçleri Nöronal Bakım Orta değişen bir kaç gün içinde görünmelidir. Hücreleri Nöronal Bakım Medium aktarılıyor 3 hafta içinde kullanılmalıdır. Nöronlar, piyasada bulunan nöronal belirteçlerin bir numarayı kullanarak tespit edilebilir. Astrositler da her zaman görülecektir. </li><li> Kültür popülasyonları genellikle, toplam hücre sayısı nöronların% 40 den daha büyük bir oranı ifade eder. NeuraLife başka nöron bakım medya kullanımı morfolojik olgun görünmüyor ve kültür sürece hayatta olmayabilir alt hücreleri sağlayabilir. </li></ol> 8. Temsilcisi Sonuçlar: Arktik kara sincap yetişkin sinir kök hücreleri 500.000-600.000 cells/75mm şişesi numaralı seribaşı için 3 ile 5 gün boyunca her 24 saatte en az iki geçit çift devam edecektir. Bu hücreler basicFGF ve B27 kaldırma ve% 1-2 FBS varlığı ve% 1 İnsülin / Transferrin / Selenyum ile kolayca ayırt edecek ve 14-21 gün içinde TUJ1 (Covance) pozitif nöronların (bkz. Şekil 2) olacak. Toplam hücreleri nöronların oranı% 40-60, kültür yaşına bağlıdır (Şekil 3) arasında değişmektedir. Nöronlar-tohumlama sonrası en az 21 gün ile 12 gün sonrası tohumlama deneyleri için kullanılabilir. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler yüzey elde. Poli-L-Ornithine kaplı şişelerde agsNSC bazal medyada büyüme 3 gün sonra AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler Faz yüzey elde. Katlama yaklaşık her 24 saatte bir gerçekleşir. 100X büyütme Foto. <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Farklılaştırılmış AGS yetişkin hipokampal nöral kök hücreler Floresan mikrografı AGS nöral kök hücreler, sonra sabitleme için önce 17 gün daha Neuralife muhafaza 4 gün, farklılaşma medyaya maruz kaldılar. Hücreler,% 4 paraformaldehid ve Invitrogen TUJ1 birincil antikor (Covance) ve Alexa Fluor 568 sekonder antikoru (yeşil) kullanarak tespit nöronlar ile tespit edildi. Hoechst boyası 33343 tüm çekirdeklerin (mavi) leke eklendi. Hücre sayısı, nöron sayısı ve nöron oranı neurite akıbet Cellomics gelen yazılım ve Arrayscan araç kullanılarak tespit edildi. Bu fotoğraf yaklaşık% 57 nöronlar temsil eder. 10X büyütme <img src="/files/ftp_upload/2199/2199fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Nöron numaraları ve üç Farklılaştırılmış AGS nöral kök hücrelerin Nöron Oranıkültür yaşları AGS nöral kök hücreler, 12, 15 ve 17 gün önce tespit Neuralife tutulan, daha sonra 4 gün boyunca farklılaşma medyaya maruz kaldılar. Hücreleri sabit ve nöronlar TUJ1 birincil antikor (Covance) ile tespit edilmiştir. Hoechst boyası, toplam hücre tanımlaması için tüm çekirdekleri leke eklendi. Hücre sayısı, nöron sayısı ve yüzde nöron oranı neurite akıbet Cellomics gelen yazılım ve Arrayscan araç kullanılarak tespit edildi. Değerler ortalama 15 kuyu durumu + SD ortalama temsil eder. Tablo 1: Pasajlanması ve tohumlamada kullanılan Örnek hesaplamalar <ol><li> 700.000 hücre / ml hücre süspansiyonu </li><li> 75.000 hücre / mL ya da 15.000 hücre hücre yoğunluğu başına her kuyuda 0.2 mL hacimde kullanma. </li><li> Iyi = 19.2 mL veya istenilen son hacim 21 ml başına 0.2 ml 96 kuyu aşılamak. </li><li> ÷ İlk Konsantrasyon (Final Konsantrasyon x Final Cilt) = Başlangıç ​​Cilt (21 ml x 75.000 hücre / ml) ÷ 700.000 = 2.25 mL </li><li> Cilt hücre süspansiyonu FBS. 2.25 ml = 2.25 ml x 0.05 = 0,1125 ml </li><li> FBS hacmi, 21 ml = 21 ml x 0.02 = 0.42 mL gerekli </li><li> FBS Farklılaşma Orta eklemek hacmi = 0.42 ml - 0,1125 ml = 0,3075 ml </li><li> Hacmi 2.25 ml hücre süspansiyonu - 0,3075 ml% 5 FBS = 18,44 mL Farklılaşma Orta = 21 mL. </li><li> 18,44 mL Farklılaşma Orta 0,308 mL FBS ile birleştirin ve 2.25 ml hücre süspansiyonu ekleyin. </li></ol>

<ol><li>Barnes, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freeze+avoidance+in+a+mammal%3A+body+temperatures+below+0+degree+C+in+an+Arctic+hibernator%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Freeze avoidance in a mammal: body temperatures below 0 degree C in an Arctic hibernator.</a> Science. 244, 1593-1595 (1989).</li>
<li>Dave, K. R., Prado, R., Raval, A. P., Drew, K. L., Perez-Pinzon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arctic+ground+squirrel+brain+is+resistant+to+injury+from+cardiac+arrest+during+euthermia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">The Arctic ground squirrel brain is resistant to injury from cardiac arrest during euthermia.</a> Stroke. 37, 1261-1265 (2006).</li>
<li>Dave, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+kinase+C+epsilon+activation+delays+neuronal+depolarization+during+cardiac+arrest+in+the+euthermic+arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Protein kinase C epsilon activation delays neuronal depolarization during cardiac arrest in the euthermic arctic ground squirrel.</a> J Neurochem. 110, 1170-1179 (2009).</li>
<li>Ross, A. P., Christian, S. L., Zhao, H. W., Drew, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+tolerance+to+oxygen+and+nutrient+deprivation+and+N-methyl-D-aspartate+in+cultured+hippocampal+slices+from+hibernating+Arctic+ground+squirrel%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Persistent tolerance to oxygen and nutrient deprivation and N-methyl-D-aspartate in cultured hippocampal slices from hibernating Arctic ground squirrel.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 26, 1148-1156 (2006).</li>
<li>Christian, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arctic+ground+squirrel+%28Spermophilus+parryii%29+hippocampal+neurons+tolerate+prolonged+oxygen-glucose+deprivation+and+maintain+baseline+ERK1%2F2+and+JNK+activation+despite+drastic+ATP+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Arctic ground squirrel (Spermophilus parryii) hippocampal neurons tolerate prolonged oxygen-glucose deprivation and maintain baseline ERK1/2 and JNK activation despite drastic ATP loss.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1307-1319 (2008).</li>
<li>Jin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+stroke-induced+neurogenesis+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Evidence for stroke-induced neurogenesis in the human brain.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 13198-13202 (2006).</li>
<li>Maysami, S., Lan, J. Q., Minami, M., Simon, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proliferating+progenitor+cells%3A+a+required+cellular+element+for+induction+of+ischemic+tolerance+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cereb+Blood+Flow+Metab%22%5BJournal%5D)">Proliferating progenitor cells: a required cellular element for induction of ischemic tolerance in the brain.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28, 1104-1113 (2008).</li>
<li>Sung, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia%2Freoxygenation+stimulates+proliferation+through+PKC-dependent+activation+of+ERK+and+Akt+in+mouse+neural+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Hypoxia/reoxygenation stimulates proliferation through PKC-dependent activation of ERK and Akt in mouse neural progenitor cells.</a> Neurochem Res. 32, 1932-1939 (2007).</li>
<li>Brewer, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+rat+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci Methods. 71, 143-155 (1997).</li>
<li>Palmer, T. D., Takahashi, J., Gage, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+adult+rat+hippocampus+contains+primordial+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The adult rat hippocampus contains primordial neural stem cells.</a> Mol Cell Neurosci. 8, 389-404 (1997).</li>
</ol>

JA Kelleher-Andersson Neuronascent kurucusu ve Arktik kara sincap patent başvuruları mucididir. Neuronascent AGS medya ve kök hücreleri satışı üzerinde telif alır. RC McGee, medya ve AGS sinir kök hücrelerinin dağıtır Lifeline, Inc tarafından istihdam edilmektedir.

AGS yetişkin sinir kök hücreleri sağlam ve nöral kök hücrelerin çalışması için temel nöral kök hücre özelliklerini mükemmel bir kaynak haline çok sayıda geçişleri için açılabilir. Genişleme oranını yaklaşık iki katına biri her yirmi dört saatte, ancak hücreleri arasındaki temas astrositler farklılaşma lehine olacaktır, çünkü bu hücreler ulaşan izdiham önce geçişli olmalıdır. Bu nedenle, İletişim-aracılı farklılaşma farklılaşma trypsinization ve geçiş öncesinde başlar nöronların toplam hücre sayısı oranının önemli ölçüde...

<table><tbody><tr><td>agsNSC</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>FC-0004</td><td></td></tr><tr><td>agsNSC genişletme kiti</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0008</td><td>DMEM/F12, B27 ve rhFGFb için alternatif kaynak (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>agsNSC diferansiyasyon kiti</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0009</td><td>DMEM/F12 ve ITS-x için alternatif kaynak (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>NeuraLife bakım medyumu kiti</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL-0012</td><td>Alternatif kaynaklar NeuraBasal (LifeLine) veya Neurobasal (invitrogen), glutamin ve B27'dir (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;). Diferansiye hücreler NeuroLife içinde 3 haftaya kadar, ancak Neurobasal içinde 2 haftadan fazla tutulmamalıdır (&lt;a href=&quot;http://www.invitrogen.com">www.invitrogen.com&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Mikrometre (Bright Line Sayım Odası gibi)</td><td>Hausser Scientific</td><td>1490</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm">http://www.hausserscientific.com/hausserbrightlinedirect.htm&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Biocoat Poly-L-Lizin kaplı 96 kuyucuklu plakalar</td><td>BD Biosciences</td><td>356516</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.bdbiosciences.com">www.bdbiosciences.com&lt;/a&gt;</td></tr><tr><td>Geniş ağızlı pipet uçları</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-707-141</td><td>Pipetleme sırasında nöronal hücre hasarını önler. &lt;a href=&quot;http://www.fishersci.com">http://www.fishersci.com&lt;/a&gt;</td></tr></tbody></table>

yetişkin hipokampal arctic zemin sincap nöral kök hücre büyüme ve farklılaşma

Growth and Differentiation of Adult Hippocampal Arctic Ground Squirrel Neural Stem Cells

Arctic zemin sincap (Urocitellus parryii, AGS) dondurulması 1 yakınında ya da altında bir çekirdek vücut ısısı ile hibernate yeteneği benzersiz. Bu hayvanlar aynı zamanda, in vivo 2,3 ve oksijen-glikoz in vitro 4,5 mahrum beyin iskemik yaralanmalara karşı. Bu benzersiz nitelikleri, yaralanma ve iskeminin neden olduğu hücre ölümü ve son derece soğuk havalarda karşı AGS nöronların kapasitesi hesabı doğasında nöronal özellikleri incelemek AGS nöronlar izole etmek için bir ivme sağladı. Proteinler ya da bu hücrelerin ayırt edici özelliklerini sağlayan gen hedefleri belirleme iskemik endikasyon ve soğuk hoşgörü çalışması için bir dizi etkili tedavilerin keşif yardımcı olabilir. Yetişkin AGS hipokampus, bu kök hücrelerin kültür kolay genişleme için izin, yayılmaya devam etmektedir nöral kök hücreler içerir. Biz burada araştırmacılar amaçlarla herhangi bir sayı için, bu kök hücreler ve farklı nöronların yararlanabilirler hangi yöntemleri açıklanmaktadır. AGS bu adımları yakından takip ederek nöral kök hücreler, iki veya daha fazla pasajlar ile genişletilebilir ve sonra bölünen hücreleri sayısını en aza indirmek için toksik kimyasallar kullanmadan TUJ1 pozitif nöronların (~% 50) yüksek bir kültür için farklılaşmış. İskemi nöron 6 ve MEK / ERK ve PI3K/Akt hayatta kalma sinyalizasyon yolları, in vivo 7 ve in vitro 8 (Kelleher-Anderson, Drew ve ark, hazırlanmakta) iskemi direncine katkıda bulunur üzerinden ilerler nöron neden olur. Bu eşsiz sinir hücrelerinin ileri karakterizasyonu, bazı veya tüm bu yöntemleri kullanarak, birçok cephede ilerleme.

Sinir kök hücreleri, yetişkin olmayan kış uykusuna toklu Arctic zemin sincap (AGS) hipokampus hazırlanmıştır. Bu sinir kök hücreleri, sayısız kanallar sayesinde genişletilmiş, farklılaşmış ve glial kültürü neredeyse 50:50 nöron olarak muhafaza edilebilir.

Yetişkin Hipokampal Arctic Zemin Sincap Nöral Kök Hücre Büyüme ve Farklılaşma

Arktik yer sincapları (Urocitellus parryii, AGS), çekirdek vücut sıcaklıkları donma noktasına yakın veya donma noktasının altında olacak şekilde kış uykusuna yatabilme yetenekleriyle benzersizdirler 1. Bu ...

Bu prosedürün genel amacı, kış uykusuna yatmamış yetişkin bir yaşındaki arktik yer sincaplarının hipokampusundan hazırlanan nöral kök hücreleri ekmek, genişletmek ve farklılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle AGS nöral kök hücrelerinin ekilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, nöral kök hücreler genişletilir ve farklılaştırma ortamına ekilir.Prosedürün üçüncü adımı, nöronların farklılaştırılması ve sürdürülmesidir; son olarak hücreler, analiz için fikse edilir veya işleme tabi tutulup fikse edilir. Nihayetinde, GS nöral öncül hücrelerinin iki haftalık farklılaştırma ve sürdürme süreci boyunca, hatta iskemik koşullar altında bile bölünmeye devam ettiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Nöron sayıları, nöron oranlarını ölçen boyama ve floresan mikroskopi teknikleri ile belirlenir.Bu tekniğin doğurguları, inme ve kalp durması için tedavilerin keşfine kadar uzanmaktadır. Arktik yer sincaplarında, diferansiye nöronlar tüm iskemik hasarlara karşı toleranslıdır. Bu prosedüre başlamadan önce, A-G-S-N-S-C ekspansiyonunda kullanılacak flaskları polyol ornitin ile kaplayarak hazırlayın. Polyol Ornitin çalışma çözeltisini inkübatörde bekleterek prosedürü takip edin.Çözüldükten sonra, solüsyon 2

growth-differentiation-adult-hippocampal-arctic-ground-squirrel

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video protokolü yetişkin fare periventriküler bölge nöral kök hücreler oluşturmak ve genişletmek için neurosphere assay yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Bu video, nörosfer oluşum sürecini ve bunların hipokampal dokudan genişlemesini göstermektedir. Doğum sonrası fareden gelen nöral kök ve progenitör hücreler girus dokusunu dente eder ve birincil nöroküreler oluşturur, bunlar daha sonra ikincil nöroküreler oluşturmak üzere yeniden tohumlanır.

Hipokampal Dokudan Nörosferlerin Oluşumu ve Genişlemesi

Yetişkin beyin hasat nöral kök hücreler sinir sistemi gelişiminin temel araştırma rejeneratif tıpta potansiyel klinik uygulamaları keşfetmek için çeşitli uygulamalar kullanılmaktadır artmaktadır. Bu deneysel sonuçların ses için kritik bu hücreleri büyümek için kullanılan yalıtım ve kültür koşullarında titiz kontrolü yapar.

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

Bu video makale, aynı doku kesitinde yetişkin hipokampal nörogenezin tüm aşamalarını tespit etmek ve ölçmek için kapsamlı bir protokolü göstermektedir. Farklı konakçı türlerden uygun antikorlar mevcut olmadığında ortaya çıkan dolaylı çoklu immünofloresan sınırlamalarının üstesinden gelmek için bir yöntem geliştirdik.

Aynı Sunucu Türlerin Antikorlar ile İmmünohistokimya ve Çoklu Etiketleme Yetişkin hipokampal nöron Eğitim için

Nöral kök hücreleri (NSC'ler) ve soylarını yetişkin fare beyninin subventriküler bölgesinden (SVZ) izole etmek için Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) tabanlı bir yöntem bildiriyoruz. Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) transgenik farelere uygulandığında, canlı görüntüleme ile hücre döngüsü ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

köpek beyin yetişkin nörogenezi incelemek için değerli bir modeldir. izole ve primer beyin dokusundan yetişkin köpek hipokampal nöral prekürsör hücrelerin genişletilmesi için protokoller burada sundu.

İzolasyon ve Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncüleri genişletilmesi

Bu protokolün amacı, belirli bir lokal nöral devrenin kemogenetik manipülasyonuna yanıt olarak yetişkin nöral kök/progenitor hücrelerin davranışını analiz etmek için bir yaklaşım tanımlamakta.

Yetişkin hipokampal sinirsel precursor hücrelerinin devre spesifik Yönetmeliği

Burada sunulan nörosferlerin spontan nesil yüksek yoğunluklu kaplama nöronlardan nöral progenitor hücrelerinde zenginleştirilmiş bir protokoldür. Aynı deney sırasında, nöronlar daha düşük yoğunlukta kaplandığında, protokol aynı zamanda uzun süreli birincil sıçan nöron kültürleri ile sonuçlanır.

E14-E16 Sprague Dawley Sıçan Embriyosu İzole Karışık Primer Hipokampal ve Kortikal Nöronlardan Nörosfer Lerin Üretimi

Nöronal programlama ile üretilen insan pluripotent kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronların transplantasyonu, nörogelişimsel bozukluklar için potansiyel bir tedavi yaklaşımı olabilir. Bu protokol, insan kök hücre kaynaklı GABAerjik nöronal öncüllerin yenidoğan farelerin beyinlerine üretilmesini ve transplantasyonunu tanımlar, aşılanmış nöronların uzun süreli araştırılmasına ve terapötik potansiyellerinin değerlendirilmesine olanak tanır.

İnsan Kök Hücre Kaynaklı GABAerjik Nöronların Nörogelişimsel Bozuklukları Hafifletmek İçin Erken Postnatal Fare Hipokampüsüne Transplantasyonu

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Keşfedin yetişkin Arktik zemin sincaplarından hipokampal nöral kök hücrelerinin ekimi, çoğaltılması ve nöron ile glial hücrelere farklılaştırılması yöntemini. Bu teknik iskemik koşullarda nörogenez araştırmaları için benzersiz bir model sunar.

Yetişkin Hipokampal Arctic Zemin Sincap Nöral Kök Hücre Büyüme ve Farklılaşma

Daha fazla video keşfet