Yetişkin Hipokampal Arctic Zemin Sincap Nöral Kök Hücre Büyüme ve Farklılaşma

Bu prosedürün genel amacı, kış uykusuna yatmayan yetişkin yılkı kutup yer sincaplarının hipokampüsünden hazırlanan nöral kök hücreleri tohumlamak, genişletmek ve ayırt etmektir. Bu, önce A GS nöral kök hücrelerinin tohumlanmasıyla gerçekleştirilir. Daha sonra, nöral kök hücreleri genişletin ve farklılaşma ortamına tohumlayın.

Prosedürün üçüncü adımı, nöronları ayırt etmek ve korumaktır ve son olarak, hücreler analiz için sabitlenir veya tedavi edilir ve sabitlenir. Sonuç olarak, bir GS nöronal progenitörlerinin iki haftalık farklılaşma, bakım ve hatta iskemik koşullar altında bölünmeye devam ettiğini gösteren sonuçlar elde edilebilir. Nöron sayıları, nöron oranlarını ölçen boyama ve floresan mikroskopi teknikleri ile belirlenir.

Bu tekniğin etkileri, inme ve kalp durması için tedavilerin keşfine kadar uzanır. Arktik yer sincabı olduğundan, farklılaşmış nöronlar tüm iskemik hakaretlere toleranslıdır Bu işleme başlamadan önce, A-G-S-N-S-C genişlemesinde kullanılacak şişeyi poliol ornitin ile kaplayarak hazırlayın. Polyol Ornitin çalışma solüsyonunu inkübatörde bırakarak takip edin.

Çözüldükten sonra, çözelti iki ila sekiz santigrat derecede bir aya kadar saklanabilir. Havalandırmalı bir T 75 şişesine sekiz mililitre Poliol ornitin çalışma çözeltisi ekleyin ve çözeltiyi şişenin tüm kültür yüzeyine eşit olarak dağıtın. Şişeyi 37 santigrat derecede en az 24 saat, tercihen kullanmadan önce CO2 eklenmemiş bir inkübatörde inkübe edin.

Poliol ornitin çalışma solüsyonunu şişeden aspire edin ve steril doku kültürü ile iki kez yıkayın. Kutup yer sincabı nöral kök hücrelerini çözmek ve tohumlamak için kullanmadan önce şişe neredeyse kuruyana kadar sıvıyı aspire edin. İlk olarak, sıvı nitrojen doerinden bir A-G-S-N-S-C şişesini çıkarın ve şişe kapağının güvenli bir şekilde kapatıldığını kontrol edin.

Alt yarısını yaklaşık 60 ila 90 saniye boyunca 37 santigrat derece su banyosunda bırakırken şişenin üst kısmını tutun. Olası kontaminasyonu önlemek için flakon kapağını sudan uzak tutun. Neredeyse tamamen çözüldüğünde şişeyi su banyosundan çıkarın.

Az miktarda buz hala görünür olmalıdır. Hücrelere zarar verebileceğinden aşırı çözdürmeyin. Şişenin dışına% 70 etanol veya izopropanol püskürtün ve ardından şişeyi biyolojik bir güvenlik kabinine götürün.

Kirlenmeyi veya sıçramayı önlemek için kapağı dikkatlice çıkarın. Steril bir pipet kullanarak. Şişeye bir mililitre bazal ortam ekleyin ve yavaşça yeniden canlandırın.

Hücreleri askıya alın. Yeniden süspanse edilmiş hücreleri 50 mililitrelik bir santrifüj tüpünde 25 mililitre ılık bazal ortama aktarın. Hücreler dönerken hücreleri altı dakika boyunca 150 G'de santrifüjleyin.

Kuru poli L ornitin kaplı T 75 şişeye 10 mililitre genleşme ortamı ekleyin ve ardından santrifüjleme tamamlandığında 40 mikrolitre Rh FGF bazik ekleyin. Peleti aspire etmeden sate ve sıvıyı dikkatlice aspire edin. Resus. Hücreleri 10 mililitre genleşme ortamında askıya alın.

Yeniden süspanse edilmiş hücreleri T 75 şişesindeki ortama aktarın. Hücreleri kap içinde eşit olarak dağıtmak için şişeyi hafifçe yan yana sallayın. Tohumlanmış şişeyi 37 santigrat derece %5 karbondioksit inkübatörüne yerleştirin.

Hücreler şişeye yapışmalı ve aşılamayı takip eden gün tohumlamadan sonraki iki saat içinde süreçler oluşturmaya başlamalıdır. A-G-S-N-S-C şişesini 40 mikrolitre Rh FGF basic ile doldurun. Çözülme ve tohumlamadan iki gün sonra, hücreler, aşılamadan sonraki üçüncü veya dördüncü günde 20 mililitre genleşme ortamı artı 40 mikrolitrelik bir RH FGF basic artışı kullanarak tam bir orta replasman gerçekleştirir.

AGSN-SNC, T 75 şişesi için ortamı aspire etmeli ve tüm hücrelerin tripsin ile kaplandığından emin olmak için 2.5 mililitre tripsin EDTA girdabı eklenmelidir. EDTA ve ayrılmayı teşvik etmek için kültür kabına birkaç taraftan hafifçe vurun. Hücreler ayrıldıktan sonra, şişeye 10 mililitre bazal ortam ekleyin, tüm tripsin çözeltisinin nötralize edildiğinden emin olmak için hafifçe döndürün.

Hücreleri 10 mililitre bazal ortam içeren steril bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Daha sonra şişeyi ilave 10 mililitre bazal ortamla yıkayın ve ilk yıkama ile birleştirin, hücreleri altı dakika boyunca 150 G'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, hücreler temiz, gevşek bir pelet oluşturmalı, S natin'i santrifüj tüpünden aspire etmelidir.

Daha sonra 10 mililitrelik bir pipet kullanarak, 10 mililitre önceden ısıtılmış bazal ortam ekleyin ve yeniden ısıtın. İki kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek hücre peletini askıya alın. Bu yöntem yakından takip edilirse, yaklaşık 500.000'lik bir başlangıç sayısından 4 milyondan fazla hücreden oluşan bir popülasyon veren üç veya daha fazla ikiye katlama verimi beklenebilir, bu prosedür için herhangi bir çok kuyulu format kullanılabilse de, farklılaşma için bir poli L lizin kaplı 96 Kuyulu plakaya A-G-S-N-S-C'nin aşılanmasını göstereceğiz.

İlk olarak, deneyiniz için gereken hücre süspansiyon hacmini ve %2'lik bir FBS nihai konsantrasyonu elde etmek için AGSNC farklılaşma ortamına eklenecek FBS miktarını belirleyin. Bu hesaplamaların bir örneği, bir biyogüvenlik kabininde bir sonraki protokol metninde gösterilmektedir. FBS ve farklılaşma ortamını karıştırın.

Daha sonra hücreleri hesaplanmış bir hacimde farklılaşma ortamı ile FBS ile dikkatlice karıştırın ve ortamdaki hücreleri steril bir kombi ucu rezervuarına aktarın. Çok kanallı bir pipet ve büyük delikli uçlar kullanarak, 200 mikrolitre seyreltilmiş hücre süspansiyonunu rezervuardan poli L lizin kaplı 96 oyuklu plakadaki her bir oyuğa dağıtın, plakayı 37 santigrat derecede,% 5 karbondioksitte bir buçuk ila iki saat inkübe edin. Ortam.

Değişim, bu tekniğin zorlu bir parçası olabilir, çünkü normal boyutlu pipet uçları kullanarak hücrelere gerçekten zarar verebilirsiniz. Bu nedenle, ortam sırasında hücrelere zarar vermemek için büyük delikli pipet uçları kullanıyoruz. Değiştirin: Hücreler bağlandığında, büyük delikli pipet uçları kullanarak her bir kuyucuğun, bu durumda ortamın 100 mikrolitre olan% 50'sini dikkatlice çıkarın.

Çıkarılan hacmi dikkatlice sıcak farklılaşma ortamı ile değiştirin. Yine, büyük delikli pipet uçları kullanarak. Plakayı aşılamadan iki gün sonra 37 santigrat derece,% 5 karbondioksitte inkübe edin.

Farklılaştırma, orta ve büyük delikli pipet uçlarını kullanarak %50 orta düzeyde bir değişiklik gerçekleştirin. Nöronların bakımı için nöronal bakım ortamı, üreticinin talimatlarına göre haftalık olarak hazırlanmalıdır. Son farklılaşmadan iki gün sonra.

Orta değişim. Nöronal bakım kullanarak% 50 orta replasman gerçekleştirin. Medium: Büyük delikli pipet uçları kullanarak her bir kuyucuktan 100 mikrolitre farklılaşma ortamını dikkatlice çıkarın ve 100 mikrolitre nöronal bakım ortamı ile değiştirin.

Her iki ila üç günde bir nöronal bakım ortamı kullanarak% 50 orta replasman yapmaya devam edin. Nöronal süreçler, nöronal bakım ortamına geçildikten sonraki birkaç gün içinde ortaya çıkmalıdır. Hücre, nöronal bakıma aktarıldıktan sonraki üç hafta içinde kullanılmalıdır.

Orta kutup yer sincabı. Yetişkin nöral kök hücreler, 75 santimetrekare şişe başına 500.000 ila 600.000 hücreye oturduğunda en az iki geçiş için her 24 saatte bir üç ila beş gün boyunca iki katına çıkmaya devam edecektir. Bu 100 x foto mikrograf, A-G-S-N-S-C'de üç günlük büyümeden sonra bir GS yetişkin hipokampal nöro kök hücrelerini göstermektedir.

Poliol ornitin kaplı şişelerde FBS ve RH FGF bazik olarak bazal besiyerleri çıkarılır. A GS nöro kök hücreleri, yaklaşık yarım nöronlara ve yarı astrositlere farklılaşacaktır. Nöronlar, bu floresan mikrografta gösterildiği gibi 14 ila 21 gün içinde T tuj bir pozitif olacaktır.

Burada hücreler %4 paraform, aldehit ve yeşil ile tanımlanan nöronlarla sabitlendi. TJ bir primer antikor ve LOR 5 68 sekonder antikor kullanılarak, tüm çekirdekler kanca kalıbı ilavesiyle maviye boyandı. Nöronların toplam hücrelere oranı, kültürün yaşına bağlı olarak% 40 ila 60 arasında değişecektir.

Bu grafik, nöronların sayısını ve nöron oranlarının, aşılamadan 16, 19 ve 21 gün sonra bir GS nöro kök hücresini farklılaştırdığını göstermektedir. Farklılaşma için, nöronlar, oturmadan 12 gün sonrasından en az 21 gün sonrasına kadar deney için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, iskemi deneylerinde kullanılmak üzere kutup yer sincabı nöronlarının nasıl hazırlanacağını iyi anlamış olmalısınız.