Radyasyondan aşağıdaki γH2AX Mekansal Dağılımı Değerlendirilmesi

Merhabalar, ben Raja Ti, Baker IDI Kalp ve Diyabet Enstitüsü'nde doktoramı yapıyorum. Sizi, yeni bir kalp hücresinde DNA hasarını ve kromatik yoğunlaşmayı işaretleyen Doğu modifikasyonunun 3D çiziminde yer alan adımlardan geçireceğim. DNA nükleer bölgelerin etrafına sarılır.

Her nükleozom, H iki A, H iki b, H üç ve H dört yarıçap olmak üzere dört farklı histon türünden oluşur. DNA oluşumu kırılır ve bu, H iki X'in PHO ile işaretlenir. H iki X'in bu pho'su, esas olarak H, üç, K, dört'ün metilasyonu ile işaretlenen kreatinde meydana gelir. Şimdi, pho tabakası H iki X ve metillenmiş H Üç K dört ile hücre immün etiketinizdeki değişikliklerin 3D çizimine bakacağız.

Başlayalım. Hücre süspansiyonunun E rotasını 15 mil'e yerleştirerek başlıyoruz. Falcon tüpleri S, bir 50 G ve Resus'ta PB kokusu ile iki kez yıkanır.

Radyasyonun hücresel olaylar üzerindeki ani etkisini görmek için yeni Ortamda askıya alın. Radyasyondan önce ve radyasyon sırasında hücreleri beş ila 10 dakika boyunca gözlerde tutun. Hücreleri gama radyasyonuna veya x-ışınlarına maruz bırakın Radyasyondan sonra, her altı GU'ya üç mililitre hücre süspansiyonu dağıtın.

Tepe gama H için kuyu plakası iki X, hücreleri 37 derece santigratta 30 dakika ile bir saat arasında inkübe eder. Yapışık olmayan hücreleri cam slaytlara yerleştirmek için Sitozin misyonunu kullanıyoruz. Sitozin klipsini monte ederken, tüm filtre kablosunun huni ile çakıştığından emin olun.

Bir 50 mikrolitre dağıtın, bu hücre süspansiyonunu sürün, her bir sitozin finaline sitozin klipslerini Sitozin misyonuna yerleştirin ve beş dakika boyunca 500 RPM döndürün. Sitozin klipslerini çıkarın ve slaytları filtre kartından ayırın. Floresein boyamada Arka Planı etkileyebileceğinden hücrelerin çok uzun süre kurumasına izin vermeyin.

Sıvı engelleme pimi kullanarak daireler çizer Her lekenin etrafında, hücreleri oda sıcaklığında% 4 paraform kafa ile beş dakika boyunca sabitleriz. Etanol veya ol ile karşılaştırıldığında,% 4 paraform kafası ile daha iyi bir fiksasyon gözlendi. Triton X 100 ile PPS perme hücreleri ile oda sıcaklığında beş dakika boyunca rüzgar kayar.

İkiz 80 ile karşılaştırıldığında, Triton X 100 ile hücrelerde daha iyi bir sinyal gözlemledik. PP S3 ile hücreleri her biri beş dakika boyunca izleyin. Bir kişi BSA'daki hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca bloke edin ve bunu diğer bloke edici ajanlar ve sürelerle karşılaştırıldığında üç kez tekrarlayın.

BSA en etkiliydi Primer antikorların spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirmede, her slayta yaklaşık 50 mikrolitre primer antikorda %1 BSA ile 500'de bir seyreltilmiş iki primer antikor kullandık. Primer antikorun oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilmesi, dört santigrat derecede gece boyunca inkübasyona kıyasla arka plan lekelenmesini azaltır. Hücreleri PBS ile beş dakika boyunca üç kez yıkayın.

Alexa kat 4 88, iyi anti fare ve Alexa kat 5 46 kelime anti tavşan. İkincil antikorlar, aynı anda farklı belirteçleri tutmak için kullanıldı. Farklı türlerde yetiştirilen antikorları kullanın.

Her slayta yaklaşık 50 mikrolitre seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 90 dakika inkübe edin. Hücrelerin ve antikorun kurumasını önleyeceğinden, hücreleri nemli odanızda inkübe etmeniz önerilir, çünkü bu, slaytları PB S3 ile her biri beş dakika boyunca kurur.

Her slayta PBS'de 500'de bir topo üçünün 50 mikrolitre seyreltilmesi eklendi. Slaytları PBS ile her biri beş dakika boyunca üç kez yıkayın. Slaytlardaki fazla nemi alın ve Antifa solüsyonu ekleyin.

Antifa solüsyonu eklemeden önce hücrelerin tamamen kurutulmaması önerilir. Slaytın üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için K alınmalıdır.

Slaytları gece boyunca karanlık ve nemli bir odada bırakın. Hücrelerin kurumasını önlemek için slaydı oje ile kapatın. Elde edilen görüntüler konfokal bir mikroskop ile ortaya çıkar.

Daha iyi uzamsal çözünürlük gitti ve görüntü elde etmek için helyum lazer kullanıldı. 63 yağ emisyonu nesnesi, iki mercek daha yüksek veya daha düşük büyütmeli merceklere tercih edilir. Üç veya dört yakınlaştırma faktörü daha iyi çözünürlüklü bir görüntü üretecektir.

Birçok hücreden FO muhasebesi için, sekiz tarama hızı, 1024 ila 1024 piksel hücre arasında bir görüntü boyutu kullanılması tercih edilir. Birden fazla kanal için görüntüleme yaparken, çerçeve taramasına kıyasla sıralı bir satır taraması alımı önerilir. Numune ağartımını önlemek için, dedektör kazancı ve amplifikatör ofseti, fareleri ve sinyal doygunluğunu azaltacak şekilde ayarlanır.

Kama HX X four'un boyutu 0,5 mikrometreden daha düşük olabileceğinden, en az 0,5 mikrometre ile görüntü alınması önerilir. Jet ekseni görüntüleri boyunca adım boyutu, önce işaretle ve kayıp deseni işaretle kullanılarak bir jet serisi deseninde gereklidir. Farklı proteinler arasındaki uzamsal ilişkiyi göstermek için, görüntü boyutu 2048 olan altı tarama hızının kullanılması önerilir ve önce metamor kullanarak 2 48 piksel.

İkincisi sayılabilir Çeşitli konfokal mikroskoplarda elde edilen görüntülerden. Gamma hgx görüntü etiketlerini doğrudan dosya menüsünden veya fatura numaralarını kullanarak açın. Etiketler. İşlem menüsüne gidin ve Aritmatik yığını'nı seçin.

Maksimum projeksiyonu seçin ve dahil edilecek planları seçin. Ve Tamam'ı tıklayın. Şimdi silindir şapkayı seçin ve kaynak görüntü uygulaması olarak Gamma H iki X görüntüsünü seçin.

Üst şapka filtresi ve sonuçta elde edilen görüntü, daha az parazit ve odak yoğunluğunda azaltılmış varyasyon içeren ikili bir görüntü olacaktır. Bölgelere gidin ve bölge çizim aracını seçin ve çekirdeklerin etrafına bölgeler çizin. İşlem, menü ve satış eşiği resmine gidin.

Dahil etme eşiğini seçin ve daha düşük ve daha yüksek eşik değerlerini ayarlayın. Genellikle dört sayıyı etkileyen eşik değerlerdir. En uygun eşik değeri, arka planın dahil edilmesini en aza indiren ve baskın dahil edilmesini en üst düzeye çıkaran değerdir.

Bu, en iyi şekilde, farklı eşik değerleri kullanılarak baskın sayısını sayarak elde edilebilir. Ve sonra baskın numarasını çıplak gözle sayma ile karşılaştırın. DPI görüntüsünü seçin ve bölgeler menüsüne gidin ve bölgeleri aktar seçeneğini seçin.

Şimdi saymaya hazır ilgili baskın ve nükleer görüntülere sahibiz. Nükleer bölgelerin çoğu silindir şapkaya aktarıldı. Ölç'e gidin, menüye gidin ve entegre ary analizini seçin veya IMA'yı seçin, Tüm bölgeleri ölç'ü seçin ve FTE numarasını almak için ölç'e tıklayın.

Artık her bölgeden FTE numaraları, Günlük verileri seçeneği kullanılarak elektronik tabloya aktarılabilir. Her kanal için önceden oluşturulmuş jet projektör görüntülerini açın. Ekrana gidin ve renk hizalamayı seçin.

Her üç kanal için de bir görüntü görüntüsü oluşturmak üzere her kanal için ilgili kaynak görüntüleri seçin. Çizgi tarama analizi, çekirdekteki farklı belirteçlerin uzamsal konumunu göstermek için yapılır. Araç çubuklarını ölçme komutuna gidin ve hücre boyunca satır tarama analizi kuru çizgiyi seçin.

Bu, çizgi boyunca her kanalın floresan yoğunluğunu gösteren bir grafik oluşturacak ve farklı belirteçlerin birbirine göre mesafesini temsil edecektir. Yığından 3B görüntü oluşturmak için Yığına git menüsüne gidin ve 3B yeniden yapılandırma'yı seçin. Maksimum 3D rekonstrüksiyon türünü seçin.

Dönme planını seçin, jet kalibrasyon mesafesini seçin. Genellikle kullanıcı, bir 3D rekonstrüksiyon oluşturmak için Tamam'ı belirtir. Ve bu, İmmünoflor ve boyama ve görüntü analizi protokolümüzü tamamlıyor.

Özetle, immünofloresan konfokal mikroskop, hücre çekirdeğinde farklı C belirteçlerinin ve gama H iki X foy'un üç boyutlu görüntüsü için iki tekniktir. İzlediğiniz için teşekkürler.