Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Optik görüntülemedeki ve genetik olarak kodlanmış grip kuvvetindeki atılımlar, bilim adamlarının ilgilendikleri biyolojik süreçleri, canlılarda ve hatta bazı durumlarda davranan organizmada bile incelemelerine olanak sağlamıştır. Memeli beyninin in vivo olarak incelenmesine çok önem verilmiş olsa da, laboratuvarımız oldukça basit bir model sistem olan trof nöromüsküler kavşağı kullanır ve aşağıdaki videoda, zaman içinde, saatler boyunca bireysel sinapsların gelişimini takip etmek için meyve deneme larvalarının nasıl uyuşturulacağını ve görüntüleneceğini açıklayacağız. gıdaların gelişimini incelemek için bir yöntem olarak günlere kadar. Avi var, sunulacak ve bir bırakma protokolü aşağıdaki temel özelliklerle karakterize edilir.

Her şeyden önce, çok yüksek bir analiz derecesi ile, yüksek görüntü kalitesi için gerekli olan kalp atışı bile durdurulur. İkincisi, %95'lik bir hayatta kalma oranı ve çok hassas görüntüler elde etme yeteneği ile. Aşağıdaki protokol, örneğin, GFP ile etiketlenmiş ve endojen promotörleri tarafından fizyolojik seviyelerde ifade edilen glutamat reseptörlerinin dinamiklerini incelememize izin verir.

Şimdi larvaları görüntüleme odasına nasıl yerleştireceğinizi, meyveyi larvalar için nasıl uyuşturacağınızı, kayıt merdivenini görüntülemek için larvalar içinde belirli bir pozisyonu nasıl bulacağınızı ve ardından larvaları izasyondan nasıl kurtaracağınızı öğreneceksiniz. İn vivo görüntülemeden önce larvaların yıkanması önemlidir. Bu işlem basit olsa da, larvalara zarar vermemeye özen gösterilmelidir ve bu nedenle onları hareket ettirmek için asla forseps kullanılmaz.

Bunun yerine, bir fırça ile yumuşak hareketleri tercih ediyoruz. Yıkama için kullanılan su oda sıcaklığıdır ve damıtılmamış veya herhangi bir deterjan içermeyen normal musluk suyudur. Seni görebiliriz.

İyi sonuçlar elde etmek için larvaları nazikçe yiyeceklerden ve taze musluk suyuna hareket ettirir. Larvaların suda mümkün olduğunca kısa süre tutulması da hayati önem taşır. Bu, nefes almayı ve ayrıca uyuşturma sürecini engelleyen soluk borusuna su girmesini önleyecektir.

Daha sonra görüntüleme odasını hazırlıyoruz. İlk olarak, odanın alt elemanına çok ince bir yağ tabakası yayıyoruz. Daha sonra larvaları bu yağ tabakasının üzerine yerleştiriyoruz.

Burada saç sonlarınızın yağa değmemesine dikkat etmek önemlidir. Yerleştirildikten sonra, burada larvaların üzerine bir ara ızgara yerleştiriyoruz. Üç kanalın yukarı bakması ve böylece larvalara hava getirilmesine izin vermesi ve yağ ile tıkanmaması önemlidir.

Şimdi ara parçanın üstüne bir kapak fişi koyuyoruz ve larvaların doğru şekilde yerleştirilip yerleştirilmediğini kontrol ediyoruz. Yani ventral taraf aşağı bakmaktadır ve trakeanın görebileceğimiz trakeal uçlu dorsal taraf yukarı bakmaktadır. Şimdi, lavın üstteki iki cam slayt arasına düzgün bir şekilde bastırılmasını sağlamak için plastik uyarlanabilir halkayı ve metal bir halkayı yerleştiriyoruz.

Şimdi görüntüleme odasını kapatıyoruz ve görüntülemeye başlamak için konfokal mikroskoba yerleştiriyoruz. Şimdi görüntüleme odasını monte edilmiş larvalarla yerleştirirsiniz. Konfokal mikroskobumuzun üstünde.

Görüntüleme odasından çıkan üç tüp vardır. Biri anestezizleştirici ajan dis flore bağlanır. Biri bir çıkış borusudur ve son tüp temiz havanın larvalara ulaşmasını sağlar.

Larva odasını anestezi cihazına bağladıktan sonra, larvaların doğru şekilde konumlandırıldığından emin olmak önemlidir. Yao daha sonra havanın pompa aracılığıyla anestezi sistemine girmesine izin verir. Bu sırada, haznedeki basıncın önerilen maksimum değeri aşmamasını sağlamak önemlidir.

Daha sonra hava akışı olduğundan emin olmak için çıkış borusunu suya koyar. Su şişesindeki kabarcıklar hava akışını gösterir. Şimdi valfi yavaşça açar ve dis florinin tüplerden kısa bir süre akmasına izin verir.

İlk anestezinin ardından, lavın nasıl tepki verdiğini kontrol etmek önemlidir. Kalp hala atıyorsa, görüldüğü gibi daha fazla anestezi uygulamak gerekir. Bir sonraki bölümde, size mikroskoptaki lavları göstereceğiz.

Şimdi anestezikleştirme işleminin kritik kısmını mikroskoptan görebiliyoruz. Başlangıçta larvaların hareketleri, kasların kasılmaya devam etmesiyle görülebilir. Hareketler yavaşlamaya başladığında, YA larvaları yukarı ve aşağı tarar ve anestezinin gerçekleşmesini izler.

Hareketler yavaşlar ve sonunda durur. Birden fazla anestezi darbesinin uygulanmasından sonra, lavın hareket etmeyi bıraktığını ve görülen tek hareketin mikroskopta yapılan değişikliklerden kaynaklandığını görebiliriz. Anestezinin derecesini belirlemek için kalp atışını kontrol etmek önemlidir.

He yao, esas olarak şişman vücudun görülebildiği lavın derinliklerine odaklanır. Daha da önemlisi, kalbi çevreleyen bölge görülebilir ve kalp atışının durduğu ve böylece larvaların görüntüleme için hazır olduğu açıktır. İn vivo görüntüleme ile ilgili en büyük zorluklardan biri, ilgilendiğiniz nöromüsküler kavşağın tanımlanmasıdır.

Bu konuda size yardımcı olmak için, larvaları tararken nasıl göründüğünü göstereceğiz. Daha sonra genellikle görüntüleme için kullandığımız bir nöromüsküler kavşak görebilirsiniz. Şimdi yavaş yavaş larvalara odaklanmaya başlıyoruz.

Kütikül yüzeyinden başlayarak, bazı kasların görünüp kaybolduğunu göreceksiniz. Bunlardan bazıları vurgulanmıştır. Film, CD sekiz transmembran alanını, GFP'yi ve Demir Kanal Çalkalayıcı proteininin C terminal bölgesini içeren yapay bir füzyon yapısını göstermektedir.

Bu yapı tüm kas zarlarına lokalize olur ve nöromüsküler kavşakta artmış mevcudiyet gösterir. Şimdi filmi daha yavaş oynatacağız ve ikinci ve üçüncü rakamların yardımıyla, tek tek kasları göründükleri ve kayboldukları gibi tanımlayabilirsiniz. Bu sinekler in vivo görüntülemeyi öğrenmek için özellikle yararlı olsa da, genellikle sinapsın yalnızca sinaptik sonrası veya sinaptik öncesi bölgelerini etiketleyen larva ifade eden belirteçler kullanırız.

Bunlar tüm kas yüzeyini işaretlemediğinden, larvalarda aynı pozisyonu tanımlamak çok daha zordur. Bu filmde, RFP etiket glutamat reseptörlerini gösteriyoruz. Film bize labe'ye odaklandığımızı gösteriyor ve bireysel nöromüsküler kavşakları vurguladık.

Filmi daha yavaş göstereceğiz ve size yardımcı olması için şekil dördünü kullanarak bireysel nöromüsküler kavşakları tanımlayabilirsiniz. Şimdi teorimiz var. Pratik bir örnek göstereceğiz.

Şimdi larvaları ifade eden MHC CD sekiz GFP çalkalayıcımızdaki nöromüsküler kavşak 27'ye odaklanacağız. Dijital yakınlaştırmayı artırdıktan sonra, nöromüsküler kavşağı yeniden konumlandırıyoruz ve ardından larvaların düzgün bir şekilde konumlandırıldığından ve aşırı veya doymamış piksellere sahip olmadığımızdan emin olmak için C yönünde merkezi bölgeye hareket ediyoruz. Aşırı doygun pikselleri kırmızı renkte görebilirsiniz ve karşılaştırmalı olarak doymamış pikseller mavi renkte görüntülenir.

Lazer gücünü azaltıyoruz ve yeniden tarıyoruz. Artık uygun bir kazanıma ve lazer gücüne sahibiz ve bu nedenle artık aşırı doymuş bölgelerimiz yok. Artık nöromüsküler kavşağın konumunu C yönünde işaretlemek önemlidir.

İlk olarak, tüm CST yığınının doğru bir şekilde kaydedilmesini sağlamak için alt tarama konumunu ve ardından üst tarama konumunu işaretliyoruz. Genellikle 100 nanometreye 100 nanometre piksel boyutu kullanırız ve C'deki mesafe 500 nanometredir. Resimlerimizi işlemek için görüntülemeden sonra dekonvolüsyonu tamamlamayı planlamıyorsak, kazançlar gürültüyü önlemek için uygun bir seviyeye ayarlanır, ancak aynı zamanda CST yığını tamamlandıktan sonra ağartmayı en aza indirmek için daha zayıf bir lazer kuvvetinin kullanılmasına izin verir.

M-H-C-C-D-H çalkalayıcı GFP yapısını ifade eden nöromüsküler kavşak uygun şekilde kaydedilir. Aşağıdaki bölümde, glutamat reseptörlerine odaklanan benzer bir işlemi tamamlıyoruz. RFP etiket glutamat reseptörlerini kaydetmek için tekrar kütikülden odaklanıyoruz ve şimdi segment A üç'teki bireysel nöromüsküler kavşakları görüyoruz.

Sağ nöromüsküler kavşağı yakınlaştırdıktan sonra, onu görüş alanının merkezine yeniden konumlandırıyoruz. Daha önce yapıldığı gibi, aşırı veya doymamış piksellere sahip olmadığımızdan emin olmamız gerekir. Yine, bazı piksellerin aşırı doygun olduğu ortaya çıkıyor ve bu nedenle ayarları yapıyoruz ve başka bir test taraması yapıyoruz.

Lazer gücündeki kazanımlar artık düzgün bir şekilde ayarlanmıştır. Artık üst konumu belirleyerek ve doğrulayarak ve ardından alt konumu belirleyerek CST yığın limitlerini ayarlamak önemlidir. Artık nöromüsküler kavşağın bireysel düzlemlerini taramaya başlayabiliriz.

Orada bulunan bazı sinapsların gözden kaçmasını önlemek için nöromüsküler kavşağın hemen altındaki ve üstündeki bölümlerin boş taramalarını yapmak önemlidir. Konfokaller taramayı bitirdikten sonra, in vivo görüntülemede elde edilen tipik bir sonucu görmek için nöromüsküler kavşağı yansıtacağız. Bu görüntüyü, nöromüsküler kavşağı yeniden tanımlamak için daha sonraki zaman noktalarında tamamlanan taramalarla karşılaştırmak için saklamak önemlidir ve yeni sinapslar veya sinaptik coplar gibi değişiklikler tanımlanabilir.

Başarılı bir şekilde görüntüledikten sonra. Lavları hızlı bir şekilde uyandırmak ve görüntüleme odasından hızla çıkarmak önemlidir. Yao şimdi lavları sürekli izlerken bunu tamamlıyor, anestezi cihazını sistemde sadece flor yerine temiz hava dolaşacak şekilde ayarlıyor.

Şimdi odanın çıkışını suya yerleştiriyor ve hava kabarcıkları havanın sistemden aktığını gösteriyor. Kalp atışının tekrar atmaya başladığından ve larvaların uyandığından emin olmak için larvaları sürekli olarak izler. Anestezi işlemine benzer şekilde, başarılı bir uyanmayı sağlamak için larvalara birden fazla hava darbesi sağlamak en iyisidir.

Artık mikroskopta ne yaptığınızı görebiliriz. Sisteme hava uygularken görebiliriz. Odada, larvalarda yapay hareketlere neden olan basınç değişiklikleri oluşur.

Sonunda, larvalar kendi kendine hareket etmeye başlar ve bu en iyi kalp hareketlerinin başlatılmasında gösterilir ve bu yüzden bu hareketleri daha net görebilmek için lavlara odaklanırız. Larvaların başarılı bir şekilde uyanmasını gösteren ritmik atımlar görülebilir. Larvaları başarılı bir şekilde uyandırdıktan sonra, görüntüleme odasından kurtarmak önemlidir.

Larvalar odanın alt kısmındadır ve bu nedenle üst kısım yana yerleştirilir. Yara metal ağırlığı ve plastik kapağı çıkarır. Daha sonra kapak sürgüsü çıkarılır ve ardından larvalarla birlikte plastik ara parça çıkarılır.

Larvaları fırça ile plastik ara parçadan dikkatlice çıkarır. Daha sonra kısa bir süre suya batırır ve fazla yağı çıkarmak için kurutur. Lav şimdi önceden ezilmiş bir yiyeceğe yerleştirilir ve tekrar ihtiyaç duyulana kadar orada bırakılır.