Name: Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-10T17:00:00.000+00:00
Duration: 17 min 51 s
Description: Öğrenin, desfluran kullanarak Drosophila melanogaster larvalarını anestezi altına alma ve konfokal mikroskopi ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu protokol sinir-kas kavşaklarındaki sinaptik gelişimi günler boyunca izlemeyi mümkün kılar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz Andreas Schönle, Biyofiziksel Kimya, Almanya ve David J. Sandström, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü, Sağlık, Bethesda, MD, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri teknik danışmanlık için Max-Plank Enstitüsü teşekkür ederim. Biz Kötting Frank, Avrupa Nörobilim Enstitüsü, Göttingen görüntüleme odasının inşa için ve anesthetization cihazı teşekkür ederiz. Bu çalışma, Alzheimer Forschung TMRYZ Girişimi hibeleri tarafından desteklenen, Çin Burs Kurulu, SBH Hücresel ve Moleküler Nörobilim, Tübingen Üniversitesi Graduate School of bir burs ile bir dostluk tarafından desteklenen oldu.

A) Meclis görüntüleme odası <ol><li> Larva seçilmiş evre (yaklaşık 24 saatlik bir gözlem aralığı bırakarak 25 ° C örneğin sahne dolaşıp kadar erken 3. instar larva) seçin. </li><li> Larva, kültür ortamı ve dab kuru temiz su ile durulayın. </li><li> Halokarbon yağı ince bir film tabakası ile odasının alt elemanı, larva yüz bölgenin merkezinde, Coat. </li><li> Larva odasında mikroskop objektif bakan ventral yüzü koyun (nöromüsküler bileşke (NMJ) 26 ve 27 görüntülü sağlar) (Şekil 1 AE). </li><li> Grid bakmalıdır (Şekil 1 A) hava deliklerini, yağ tabakası üzerine plastik ara yerleştirin. Bu aşamada kontrol edin: spacer yüksekliği kabaca yarısı larva çapı, yarık genişliği larva çapının yaklaşık iki katı olmalıdır. </li><li> Mikroskop görüntüleme odasının yerleştirin </li></ol> B) Anesthetization larva <ol start="7"><li> Uygun bir anesthetization cihaz / buharlaştırıcı odasının iki girişler bağlayın. Up-front kontrol edin: Oda hava desfluran konsantrasyonu etkin güvenlik yönetmeliklerine belirtilen asla aşmamalıdır! Desfluran, sadece çok küçük bir toplam hacmi larvaları uyutmak için gerekli. 1 desfluran% 15 uygulaması (v / v) bir deneyde kullanılmak üzere ideal konsantrasyonu belirlemek için iyi bir başlangıç ​​noktası olarak kanıtlamıştır. Güvenlik nedenleri için buharlaştırıcı in vivo görüntüleme 2-4 saat için gerekli daha asla desfluran içermesi gerektiğini öneriyoruz. </li><li> Diğer ucunda bir bardak su odasının prizine takılı tüp daldırın sonra yaklaşık beş saniye süreyle odasına anestezi akışını kontrol vanalarının açık. Bu aşamada kontrol edin: Hava kabarcıkları su yükselirken musunuz? Değilse odasına sızdıran. </li><li> Yaklaşık üç saniye vanalarını kapatın. </li><li> Mikroskop kalıntı larva hareketleri izleyin. Kalp atışı ve kas hareketleri de kontrol edin. Larva anesthetization tamamlanana kadar gerekli açık ve yakın vanalar adım 8 ve 9 olarak açıklanan, daha sonra tüm vanaları kapatın ve görüntüleme başlayın. Bu aşamada kontrol edin: Artık kas hareketi ya da kalp atışı, larva düzgün anestezi olmadığını gösterir. Komple anesthetization yüksek çözünürlüklü görüntüler için hayati önem taşımaktadır. Larva normalde belirli bir zamanda daha uzun bir süre 15-20 dakika narkoz olmamalıdır. </li></ol> C) Görüntüleme <ol start="11"><li> Doğru pozisyonu ve görüntü faiz yapısı (Şekil 2-4) belirleyin. </li></ol> Den D) Kurtarma anesthetization <ol start="12"><li> Görüntüleme odasına hava izin tamamlandıktan sonra. Bu aşamada kontrol edin: Iletilen halojen ışık ile larva kalp atışı ve kas kasılmaları kontrol edin. Kasları sözleşme başlangıç ​​olarak görüntüleme odasından larva kaldırmak için güvenlidir. </li><li> Anesthetization cihazdan oda ayırın ve mikroskop çıkarın. Odanın dikkatlice sökün ve püresi sinek ekimi orta larva. </li><li> Bir kuluçka çanak uygun sıcaklıkta saklayın. </li></ol> E) Zaman serileri <ol start="15"><li> Yeterli zaman noktalarında elde edilmiştir kadar 2-14 adımları tekrarlayın. Alternatif protokolü: Larva, 30 dakikalık zaman aralığı içinde bir kereden fazla yansıması ise, bir sonraki anesthetization noktaya kadar görüntüleme odasında bırakmak için pratik olabilir. Yeterli zaman noktalarında elde edilmiştir kadar 7-14 adımları tekrarlayın. Bu aşamada kontrol edin: Larva, bir defada iki saatten fazla görüntüleme odasında tutulması, ne de bir seferde 15-20 dakika daha uzun süre narkoz için değildir. </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Görüntüleme odasının Şekil 1 Meclisi. (A) larva ve plastik ayırıcı yağ tabakası üzerine yerleştirin. (B) yerleştirin ve ayırıcı bir 22 x 22 mm kapak kayma (C) metal halka ile larva pozisyonunu düzeltmek ve (D) odasına yakın odasına pleksiglas kılavuz yüzük takmak. (E) Şimdi odanın mikroskop üzerine monte edilmek üzere hazırdır. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Drosophila larvaları Vücut duvarı kasları. Kaslar ve NMJs CD8-GFP-Sh füzyon proteini 8 ifade görüntülendi. Larva haline manikür ventral tarafında odaklanarak zaman görüldüğü gibi, kaslar gösterilmektedir. (AC) en yüzeysel kas, 27, gösterilir, (KL) en iç kasları, 6 ve 7 gösterilir. Ölçek Bar: 100 mikron, dilimler arasında ΔZ 2 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 Drosophila larvaların vücut duvarı kasları Kimlik. L3 Drosophila larvaları, segment A3 kasları kimliği gösterilir. Kaslar ve NMJs CD8-GFP-Sh füzyon proteini 8 ifade görüntülendi. Larvaları manikür ventral tarafında odaklanarak zaman görüldüğü gibi, kaslar görüntülenir. En yüzeysel kas, 27, AC gösterilir KL en iç kasları, 6 ve 7 gösterilir. Ölçek Bar: 100 mikron, ΔZ dilimleri arasında 2 mikron. <img src="/files/ftp_upload/2249/2249fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 Kimlik Drosophila larvaların nöromüsküler kavşak. (AD) NMJs DGluRIIA-MRFP füzyon proteini 1 ifadesi ile görüntülendi. NMJs larva haline manikür ventral tarafında odaklanarak zaman gözlemlediği gibi gösterilmiştir. (AB) en yüzeysel NMJ, 27, gösterilen, en iç NMJs, 6 ve 7, CD gösterilmiştir. Ölçek Bar: 100 mikron, ΔZ dilimleri arasında 5 mikron. (E) ve (F) yüzeysel (E) ve (F) daha iç NMJs kimliği referans verilir.

<ol><li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate+receptor+dynamics+organizing+synapse+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Glutamate receptor dynamics organizing synapse formation in vivo.</a> Nat Neurosci. 8, 898-905 (2005).</li>
<li>Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22In+vivo+imaging+of+long-term+changes+in+the+Drosophila+neuromuscular+system+%5B%5D%22">In vivo imaging of long-term changes in the Drosophila neuromuscular system [dissertation]</a>. , Georg-August-University Göttingen. (1988).</li>
<li>Fuger, P., Behrends, L. B., Mertel, S., Sigrist, S. J., Rasse, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+imaging+of+synapse+development+and+measuring+protein+dynamics+using+two-color+fluorescence+recovery+after+photo-bleaching+at+Drosophila+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Live imaging of synapse development and measuring protein dynamics using two-color fluorescence recovery after photo-bleaching at Drosophila synapses.</a> Nat Protoc. 2, 3285-3298 (2007).</li>
<li>Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+axonal+transport+of+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Imaging axonal transport of mitochondria.</a> Methods in enzymology. 457, 319-333 (2009).</li>
<li>Vinegoni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesoscopic+fluorescence+tomography+for+in-vivo+imaging+of+developing+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mesoscopic fluorescence tomography for in-vivo imaging of developing Drosophila.</a> J Vis Exp. , (2009).</li>
<li>Lin, C. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+Drosophila+larva+by+multiphoton+autofluorescence+and+second+harmonic+generation+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biomedical+optics%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of Drosophila larva by multiphoton autofluorescence and second harmonic generation microscopy.</a> Journal of biomedical optics. 13, 050502-050502 (2008).</li>
<li>Levitan, E. S., Lanni, F., Shakiryanova, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+vesicle+motion+and+release+at+the+Drosophila+neuromuscular+junction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of vesicle motion and release at the Drosophila neuromuscular junction.</a> Nat Protoc. 2, 1117-1125 (2007).</li>
<li>Zito, K., Parnas, D., Fetter, R. D., Isacoff, E. Y. &amp, Goodman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Watching+a+synapse+grow%3A+noninvasive+confocal+imaging+of+synaptic+growth+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Watching a synapse grow: noninvasive confocal imaging of synaptic growth in Drosophila.</a> Neuron. 22, 719-729 (1999).</li>
</ol>

Sunulan yöntem başlangıçta Drosophila melanogaster larvaların vücut duvarı kasları glutamaterjik sinapsların çalışma için geliştirilmiştir. Drosophila nöromüsküler bileşke (NMJ), kas ve nöronlar basmakalıp bir sito-mimarisi ile karakterizedir ve bu nedenle in vivo görüntüleme için ideal uygundur . Ancak, açıklanan anesthetization protokol görüntüleme NMJ sınırlı değil; Drosophila larvaların şeffaflık, organların gelişimini incelemek için açıklanan protokol adaptasyon, hücre göçü, hücre içinde aksonal kargo ve alt-hücresel yeniden yapılanma taşınması kolaylaştırır .

Reaktifler: <ul><li> Desfluran (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Almanya) </li><li> Halokarbon yağı (örneğin Voltalef H10S yağ / Atofina, Puteaux, Fransa) </li><li> Fly kültür ortamı </li></ul> Ekipman: <ul><li> Ters konfokal mikroskop </li><li> Binoküler mikroskop (örneğin STEMI 2000, Carl Zeiss Jena, Almanya) </li><li> Sıralamak olarak kullanılan küçük bir fırça uçar </li><li> Kuvöz </li><li> Özel inşa görüntüleme odası (mekanik çizimler için bakiniz Ref 3) </li><li> Buharlaştırıcı / anesthetization cihazı (Ayrıntılı bilgi için Referans 3) </li></ul>

alt hücresel Çözünürlük bozulmamış drosophila larva in vivo görüntüleme

In vivo Imaging of Intact Drosophila Larvae at Sub-cellular Resolution

Istenen transgenik hayvan hatlarının verimli kurulması sağlayan optik görüntüleme, genetik olarak kodlanmış fluorophores ve genetik araçları son gelişmeler bir yaşam bağlamında incelenecek biyolojik süreçlerin etkin ve hatta bazı durumlarda organizma davranıyor. Bu protokolde, alt hücresel çözünürlük 1-3 sinaptik popülasyonlarının geliştirme ve plastisite takip desfluran uçucu anestezik kullanarak sağlam Drosophila larvaları, uyutmak nasıl anlatacağız . Drosophila melanogaster larvaları uyutmak için diğer yararlı yöntemler, daha önce açıklanan 4,5,6,7,8 alınmış olsa da, burada sunulan protokol kombine aşağıdaki temel özellikleri nedeniyle önemli gelişmeler göstermektedir: (1) anesthetization çok yüksek derecede, hatta kalp atışı gün 2 (beşten fazla zaman puan saatlik bir süre içinde kayıt izin&gt; anesthetization siklus başına% 90 (2), yüksek hayatta kalma oranı, 150 nm ye kadar 1 lateral çözünürlük izin tutuklandı 3) 2 durumlarda bize sağlayan, yüksek hassasiyetli fizyolojik düzeyde ifade edilen proteinlerin dinamiklerini incelemek için. Ayrıntılı olarak GluR-IIA istikrarlı transgenik hatları endojen organizatörü 1 ve ekzon tuzak hattı FasII-GFP 1 ile ifade postsinaptik glutamat reseptör altbirim görselleştirmek için başardık. (4) 4,7 larvaları diğer yöntemlerin aksine sadece hayatta değil görüntülü, aynı zamanda sağlam olabilir (yani olmayan disseke) gözlem gün 1 bir dizi üzerinden gerçekleşmesini sağlar. Ekteki video, in vivo görüntüleme odasının 2,3 bireysel parçaların fonksiyonu, larvaları, anesthetization prosedürü nasıl bir larva içinde belirli konumlarda yeniden tanımlamak için ve larvalarının güvenli kaldırma doğru montaj görüntüleme odası.

Bu protokol, bozulmamış anesthetization ve görüntüleme için güvenilir bir yöntem açıklanır<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Larvaları. Biz bir kaç gün öncesine kadar volatil anestetik desfluran yapıların alt hücresel çözünürlük ve yeniden tanımlama tekrarlayan görüntüleme için izin kullanmış olması<sup&gt; 1</sup&gt;.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Optik görüntülemedeki son gelişmeler, genetik olarak kodlanmış floroforlar ve istenen transgenik hayvanların etkili bir şekilde oluşturulmasına olanak tanıyan genetik araçlar...

Optik görüntüleme ve genetik olarak kodlanmış floresan proteinlerdeki gelişmeler, bilim insanlarının ilgilendikleri biyolojik süreçleri canlı ve bazı durumlarda davranış sergileyen organizmalar üzerinde incelemelerine olanak sağlamıştır. Memeli beyninin in vivo incelenmesine çok fazla vurgu yapılmış olsa da, laboratuvarımız oldukça basit bir model sistem olan Drosophila nöromüsküler kavşağını kullanmaktadır; takip eden videoda, bireysel sinapsların gelişimini saatler hatta günler süren zaman seyri boyunca izlemek amacıyla meyve sineği larvalarının nasıl anestezi edileceğini ve görüntüleneceğini açıklayacağız. Drosophila gelişimini incelemek için mevcut yöntemler olsa da, sunulacak olan anestezi protokolü aşağıdaki temel özelliklerle karakterize edilmektedir.Öncelikle, çok yüksek derecede analize bağlı olarak kalp atışı bile durdurulur ki bu durum yüksek görüntü kalitesi için esastır. İkinci olarak, %95'lik bir sağkalım oranı ve çok hassas görüntüler elde etme yeteneği sağlanır. Aşağıdaki protokol, örneğin, GFP ile işaretlenmiş ve endojen promotörleri aracılığıyla fizyolojik seviyelerde eksprese edilen glutamat reseptörlerinin dinamiklerini incelememize olanak tanır.Şimdi larvaların görüntüleme haznesine nasıl yerleştirileceğini, larvaların nasıl anestezi edileceğini, larvalar içerisinde görüntüleme için belirli bir konumun nasıl bulunacağını ve ardından larvaların anestezi sonrası nasıl geri kazanılacağını öğreneceksiniz. In vivo görüntüleme öncesinde larvaların yıkanması önemlidir. Bu işlem basit olsa da, larvalara zarar vermemek için dikkatli olunmalı ve bu nedenle onları taşımak için asla pens kullanılmamalıdır.Bunun yerine, bir fırça ile nazik hareketler yapmayı tercih ediyoruz. Yıkama için kullanılan su, oda sıcaklığında, distile edilmemiş ve herhangi bir deterjan içermeyen normal musluk suyudur. Görebilirsiniz.İyi sonuçlar elde etmek amacıyla, larvaları yiyeceklerden nazikçe çıkarıp taze musluk suyuna aktarıyor. Larvaları suyun içinde mümkün olduğunca kısa süre tutmak da hayati önem taşımaktadır. Bu işlem, solunumu ve anestezi sürecini engelleyen suyun trakeなどに girmesini önleyecektir.Ardından, görüntüleme haznesini hazırlıyoruz. Öncelikle, haznenin alt elemanına çok ince bir yağ tabakası yayıyoruz. Daha sonra larvaları bu yağ filminin üzerine yerleştiriyoruz.Burada, uçların yağa temas etmemesine dikkat etmek önemlidir. Konumlandırma işlemi tamamlandıktan sonra, larvaların üzerine buradaki ara parçalı ızgarayı yerleştiriyoruz. Üç kanalın yukarıya bakması, böylece larvalara hava ulaşmasını sağlaması ve yağla tıkanmaması önemlidir.Şimdi ara parçanın üzerine bir lamella yerleştiriyoruz ve larvanın doğru konumlandırıldığını kontrol ediyoruz. Yani, ventral taraf aşağı bakmalı ve trakeaların görülebildiği trakeal uçlu dorsal taraf yukarı bakmalıdır. Şimdi, larvanın üstteki iki cam lam arasında düzgünce preslendiğinden emin olmak için plastik adaptör halkasını ve metal halkayı yerleştiriyoruz.Şimdi görüntüleme haznesini kapatıyoruz ve görüntülemeye başlamak için konfokal mikroskoba taşıyoruz. Şimdi, montajlanmış larvaların bulunduğu görüntüleme haznesini konfokal mikroskobumuzun üzerine yerleştiriyoruz.Görüntüleme haznesinden çıkan üç tüp bulunmaktadır. Bunlardan biri anestezi maddesi olan diflorin'e bağlıdır. Bir diğeri çıkış tüpüdür ve son tüp ise taze havanın larvalara ulaşmasını sağlar.Larva haznesi anestezi cihazına bağlandıktan sonra, larvanın doğru şekilde konumlandırıldığından emin olmak önemlidir. Ardından Yao, pompa aracılığıyla anestezi sistemine hava girmesini sağlar. Bu aşamada, haznedeki basıncın önerilen maksimum değeri aşmadığından emin olmak önemlidir.Ardından, hava akışının olduğundan emin olmak için çıkış borusunu suyun içine yerleştirir. Su şişesindeki kabarcıklar hava akışını göstermektedir. Şimdi valfi yavaşça açar ve diflorin gazının kısa bir süre borulardan akmasına izin verir.İlk anestezi işleminin ardından, lavanın nasıl tepki verdiğini kontrol etmek önemlidir. Eğer kalp hâlâ atıyorsa, görüldüğü üzere daha fazla anestezi uygulamak gerekir. Bir sonraki bölümde, lavayı mikroskop altında size göstereceğiz.Şimdi, anestezi sürecinin kritik kısmını mikroskop altından görebiliriz. Başlangıçta, kasların kasılmaya devam etmesiyle larvaların hareketleri görülebilir. Hareketler yavaşlamaya başladığında, anestezi gerçekleşirken larvalar boyunca yukarı ve aşağı tarama yapılır ve süreç izlenir.Hareketler yavaşlar ve sonunda durur. Birden fazla anestezi darbesi uygulandıktan sonra, lavanın hareketinin durduğunu ve görülen tek hareketin mikroskopta yapılan ayarlamalardan kaynaklandığını görebiliriz. Anestezinin derecesini belirlemek için kalp atışını kontrol etmek önemlidir.He yao, ağırlıklı olarak yağ vücudunun görülebildiği lavanın derinliklerine odaklanır. Önemli bir nokta olarak, kalbi çevreleyen bölge görülebilmekte olup kalp atışının durduğu ve dolayısıyla larvaların görüntüleme için hazır olduğu açıkça görülmektedir. In vivo görüntülemedeki temel zorluklardan biri, ilgilenilen nöromüsküler bileşkenin tanımlanmasıdır.Size bu konuda yardımcı olmak için, larvaları tararken görüntünün nasıl göründüğünü göstereceğiz. Ardından, görüntüleme için genellikle kullandığımız bir nöromüsküler kavşağı görebilirsiniz. Şimdi yavaşça larvaların içine odaklanmaya başlıyoruz.Kütikül yüzeyinden başlayarak, bazı kasların görünüp kaybolduğunu göreceksiniz. Bunların bazıları vurgulanmıştır. Film; CD sekiz transmembran alanını, GFP'yi ve Iron Channel Shaker proteininin C terminal bölgesini içeren yapay bir füzyon konstrüktünü göstermektedir.Bu yapı tüm kas membranlarına lokalize olur ve nöromusküler kavşakta artmış varlık gösterir. Şimdi videoyu daha yavaş oynatacağız ve iki ile üç numaralı şekillerin yardımıyla, tekil kasları göründükçe ve kayboldukça tanımlayabilirsiniz. Bu sinekler in vivo görüntülemeyi öğrenmek için özellikle yararlı olsa da, biz genellikle sinapsın yalnızca post-sinaptik veya pre-sinaptik bölgelerini işaretleyen markerlar eksprese eden larvaları kullanırız.Bunlar tüm kas yüzeyini işaretlemediği için, larvalarda aynı konumu belirlemek çok daha zordur. Bu videoda, RFP ile işaretlenmiş glutamat reseptörlerini gösteriyoruz. Video, loba odaklanmamızı göstermektedir ve bireysel nöromüsküler kavşakları vurguladık.Videoyu tekrar daha yavaş oynatacağız ve şekil dört'ten yararlanarak tekil nöromüsküler bileşkeleri tanımlayabileceksiniz. Teorik kısmı tamamladık. Şimdi pratik bir örnek göstereceğiz.Şimdi, MHC CD sekiz GFP shaker eksprese eden larvalarımızdaki nöromüsküler bileşke 27'ye odaklanacağız. Dijital zumu artırdıktan sonra, nöromüsküler bileşkeyi yeniden konumlandırıyoruz ve ardından larvanın doğru şekilde yerleştirildiğinden ve herhangi bir aşırı veya doygunlaşmamış piksel bulunmadığından emin olmak için C yönünde merkezi bölgeye doğru ilerliyoruz. Aşırı doygun pikselleri kırmızı renkte ve buna karşılık doygunlaşmamış pikselleri mavi renkte görebilirsiniz.Lazer gücünü düşürüp yeniden tarama yapıyoruz. Artık uygun bir kazanç ve lazer gücüne sahibiz, dolayısıyla aşırı doygun bölgeler kalmadı. Şimdi, nöromüsküler kavşağın C yönündeki konumunu işaretlemek önemlidir.İlk olarak, tüm CST yığınının doğru şekilde kaydedilmesini sağlamak için alt tarama konumunu ve ardından üst tarama konumunu işaretleriz. Genellikle 100 nanometre x 100 nanometre piksel boyutu kullanırız ve C mesafesi 500 nanometredir. Görüntüleme sonrası resimleri işlemek için dekonvolüsyon yapmayı planlamıyorsak, kazançlar gürültüyü önleyecek uygun bir seviyeye ayarlanır; aynı zamanda CST yığını tamamlandığında ağarmayı en aza indirmek için daha düşük lazer gücünün kullanılmasına olanak tanınır.M-H-C-C-D-H shaker GFP konstrüktunu eksprese eden nöromüsküler bileşke uygun şekilde kaydedilmiştir. Bir sonraki bölümde, glutamat reseptörlerine odaklanarak benzer bir işlemi tamamlıyoruz. RFP etiketli glutamat reseptörlerini kaydetmek için tekrar kütikül üzerinden odaklanıyoruz ve şimdi segment A üçteki bireysel nöromüsküler bileşkeleri görüyoruz.Sağ nöromüsküler kavşağa yakınlaştıktan sonra, onu görüş alanının merkezine yeniden konumlandırıyoruz. Daha önce yapıldığı gibi, aşırı doygun veya doygunluğa ulaşmış piksel bulunmadığından emin olmamız gerekir. Bazı piksellerin aşırı doygun olduğu tekrar belirgin hale gelir, bu nedenle ayarları düzenleyip bir test taraması daha gerçekleştiririz.Lazer gücündeki kazançlar artık uygun şekilde ayarlanmıştır. Şimdi, üst konumu belirleyip doğrulayarak ve ardından alt konumu belirleyerek CST istif sınırlarını ayarlamak önemlidir. Artık nöromüsküler kavşağın münferit düzlemlerini taramaya başlayabiliriz.Orada konumlanmış bazı sinapsların gözden kaçmasını önlemek için nöromüsküler kavşağın hemen altından ve üstünden bazı boş taramalar yapmak önemlidir. Konfokal taramalar tamamlandıktan sonra, in vivo görüntülemede elde edilen tipik bir sonucu görmek için nöromüsküler kavşağı projekte edeceğiz. Nöromüsküler kavşağı yeniden tanımlamak ve yeni sinapslar veya sinaptik batonlar gibi değişiklikleri belirleyebilmek için bu görüntünün, sonraki zaman noktalarında tamamlanan taramalarla karşılaştırmak üzere saklanması önemlidir.Görüntüleme başarıyla tamamlandıktan sonra, lavayı hızla uyandırmak ve görüntüleme haznesinden süratle çıkarmak önemlidir. Yao, lavayı sürekli olarak izlerken şu an bu işlemi gerçekleştirmekte ve anestezi cihazını, sistemden sadece flor yerine temiz hava sirküle edecek şekilde ayarlamaktadır.Şimdi haznenin çıkışını suyun içine yerleştiriyor ve hava kabarcıkları, sistemden hava akışı olduğunu gösteriyor. Kalp atışlarının yeniden başlamasını ve larvaların uyanmasını sağlamak için larvaları sürekli olarak izliyor. Anestezileme sürecine benzer şekilde, başarılı bir uyanma sağlamak için larvalara birden fazla hava darbesi verilmesi en iyisidir.Artık mikroskop aracılığıyla ne yapıldığını görebiliyoruz. Sisteme hava uyguladığını görebiliyoruz. Oda içerisinde basınç değişiklikleri oluşmakta ve bu da larvalarda yapay hareketler meydana getirmektedir.Sonunda larvalar kendi başlarına hareket etmeye başlar; bu durum en iyi kalp hareketlerinin başlamasıyla gözlemlenir, bu nedenle bu hareketleri daha net görebilmek için larvaya odaklanırız. Ritmik atışlar, larvanın başarıyla uyandırıldığını gösterir. Larva başarıyla uyandırıldıktan sonra, onu görüntüleme odasından çıkarmak önemlidir.Larvalar haznenin alt bölümündedir, bu nedenle üst kısım yana yerleştirilmiştir. Yara, metal ağırlığı ve plastik kapağı çıkarır. Ardından kapak lamı ve sonrasında larvaların bulunduğu plastik ara parçası çıkarılır.Larvaları fırça yardımıyla plastik ara parçadan dikkatlice çıkarır. Ardından, fazla yağı gidermek için larvaları kısaca suya batırır ve kurular. Larva daha sonra önceden ezilmiş gıdaya yerleştirilir ve tekrar ihtiyaç duyulana kadar orada bırakılır.

in-vivo-imaging-of-intact-drosophila-larvae-at-sub-cellular-resolution

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Bu protokol, canlı diseksiyonu tartışıyor.

Drosophila Larvaların segmental Aksonlar içinde Sinaptik veziküller in vivo Görselleştirme

Bu kağıdı doğrudan puparium aracılığıyla görüntü hücre davranışı hızlı bir tarama konfokal mikroskop kullanımını gösterir. Sağlam pupa davayı bırakarak, bu yöntem doğrudan çalışma zordur Drosophila bir gelişme aşamasında gözlem ve dinamik hücre süreçlerinin ölçülmesini sağlar.

Ve Pupa Durumunda sayesinde görüntüleme<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Bu protokol, dokunulmamış larva beyin bağlamında canlı hücre görüntüleme yapmak için kullanılan akıcı bir yöntem göstermektedir. Canlı hücre görüntüleme yaklaşımları sürekli daha önce gözardı mekanizmaları ortaya çıkarılması, asimetrik nöral kök hücre bölünmeleri çalışmanın yanı sıra diğer nörolojik ve gelişimsel süreçleri için paha biçilmezdir.

Canlı Görüntüleme<em&gt; Drosophila</em&gt; Larva nöroblastomun

Bu protokol, canlı Drosophila pupa göz nöroepitelini görüntülemek için etkili bir yöntem sunar. Bu yöntem, doku hareketini ve düzensiz topolojiyi telafi eder, birden fazla GFP etiketli bağlantı proteininin kullanılması yoluyla hücre sınırlarının görselleştirilmesini geliştirir ve kolayca monte edilebilen bir görüntüleme teçhizatı kullanır.

Canlı-görüntüleme Drosophila Pupa Göz

Burada biz göstermek tek molekül fotoğraf-harekete geçirmek yerelleştirme mikroskobu canlı Drosophila melanogaster motor sinir terminal üzerinde yürütülen olabilir nasıl üçüncü larva biçim.

Vivo Tek molekül Drosophila Presynaptic Motor sinir Terminal izleme

Mikro bilgisayarlı tomografi kullanılarak gelişimin herhangi bir aşamasında bozulmamış Drosophila melanogaster'ın görselleştirilmesine izin veren bir protokol sunulmaktadır.

Mikro bilgisayarlı Tomografi kullanılarak Drosophila melanogaster'ın Tüm Hayvan Görüntülemesi

Burada sunulan mikroenjekte etmek ve aynı anda görüntü birden fazla Drosophila embriyoembriyonik gelişim sırasında bir plaka tabanlı, yüksek içerik görüntüleyici kullanarak bir protokoldür.

Drosophila Embriyo Hazırlama ve Canlı Hücre Mikroskopisi Için Mikroenjeksiyon Otomatik Yüksek İçerik Analizörü Kullanılarak Gerçekleştirildi

Burada, konvansiyonel lazer taramalı konfokal mikroskop kullanılarak süper çözünürlüklü görüntüleme elde etmek için erken Drosophila embriyolarında genişleme mikroskobunun uygulanması için bir protokol sunulmaktadır.

Süper Çözünürlüklü Görüntüleme için Tam Montajlı Drosophila Embriyolarını Fiziksel Olarak Büyütmek için Genişleme Mikroskobunun Kullanılması

Öğrenin, desfluran kullanarak Drosophila melanogaster larvalarını anestezi altına alma ve konfokal mikroskopi ile yüksek çözünürlüklü görüntüleme yöntemini. Bu protokol sinir-kas kavşaklarındaki sinaptik gelişimi günler boyunca izlemeyi mümkün kılar.

Alt hücresel Çözünürlük bozulmamış Drosophila Larva in vivo Görüntüleme

Daha fazla video keşfet