Memeli MSS Optik Sinir transeksiyonu sonra Deneysel İşlemler Yöntemleri

Retinal ganglion hücreleri veya RG cs, görsel bilgiyi optik sinir yoluyla retinadan beyne ileten merkezi sinir sistemi nöronlarıdır. Eşlik eden videoda, yetişkin merkezi sinir sisteminde apoptotik nöral hücre ölümünün bir modeli olarak tüm RGC popülasyonunun aksonlarını sodomize etmek veya kesmek için bir yöntem gösterildi. İşte bu yöntem, doğrudan nörotrofik faktörleri, kısa enterferans yapan RNA'ları, plazmitleri veya retinayı küresel olarak retinayı hedeflemek için yaralı retinal ganglion hücrelerine veya retinaya anti ATO proteinlerini kodlayan viral vektörleri hedef alan prosedürlerle birleştirilir.

Bir göz içi enjeksiyon aparatı monte edilir ve özellikle retinal ganglion hücrelerini hedeflemek için gözün vitreus odasına maddeler enjekte etmek için kullanılır. Ya Jel Köpük yerleştirilir ya da optik sinire madde enjekte etmek için bir Hamilton şırıngası kullanılır. Güdük görüntüleme sonuçları, anti-apoptotik faktörlerin verilmesi ile retinal ganglion hücre sağkalımının artırılabileceğini göstermektedir.

Bu teknikleri kullanarak, Bu yöntem, merkezi sinir sistemindeki yetişkin nöron apoptozunda rol oynayan proteinleri tanımlamak için kullanılabilir. Bu tekniğin etkileri, merkezi sinir sistemi hastalığının tedavisine veya teşhisine kadar uzanır, çünkü optik sinir transeksiyonu erişkin CNS'de nöronal apoptoz için tekrarlanabilir bir modeldir Genel olarak, bu tekniğe yeni olanlar, cam pipeti gözün vitreus odasına yerleştirirken merceğe zarar verdikleri için mücadele ederler. Şırınga sistemini göz içi enjeksiyonlara hazırlamak için herhangi bir iğne veya RN somununu çıkararak başlayın.

10 mikrolitrelik rn gast sıkı 1701 Hamilton şırınga üzerinde bulunur. PFA feralini, sıkıştırma bağlantısının tepe fincan feraline yerleştirin. Ardından tam bağlantı parçasını şırınganın ucuna yerleştirin ve RN somununu üstüne gevşek bir şekilde vidalayın.

16. inçlik bir tepe borusunun bir ucunu, RN somunundaki açıklıktan sıkıştırma bağlantısına yerleştirin. Tepe borusunun tam olarak oturduğundan emin olun. Tepe borusunu kapatacak olan yabani hayvani sıkıştırmak için RN somununu sıkın.

Bu işlemi çift RN cam kuplörün her iki ucunda da tekrarlayın. RN somun desteğini sıkarak tepe borusunun serbest ucunu çift RN cam kuplörün bir ucuna takın. Cam mikro pipet, enjeksiyon sistemi için iğne ve namluyu oluşturacaktır.

Cam pipeti çift RN cam kuplörün serbest ucuna yerleştirin. Pipeti yerine sabitlemek için RN somununu sıkın. Diseksiyon mikroskobu altında, çekilmiş bir mikro pipeti belirli bir açıyla tutarak ve bir kırılma oluşturmak için ucu bir cam sürgünün cam buzu boyunca ovalayarak uygun çapta bir uç oluşturun.

İdeal olarak, son uç hafifçe eğimli olmalıdır. Daha sonra, Hamilton Şırınga Şirketi'nden şırınga, tepe boru bağlayıcısı, çift RN cam kuplör ve kullanım için mineral yağ içeren cam mikro pipet ile doldurulmuş bir astarlama kiti kullanarak. Hidrolik enjeksiyon sistemi ile iğneyi bir Hamilton 9 0 0 3 0 iğnesi ile değiştirin.

Ardından, mineral yağı enjekte ederken bir sızdırmazlık sağlamak için Hamilton 9 0 0 3 0 iğnesinin üzerine kauçuk bir septum yerleştirin. Astar şırıngasının Hamilton 9 0 0 3 0 iğnesini, enjeksiyon sisteminin 10 mikrolitrelik Hamilton şırıngasının namlusunun arkasına yerleştirin. Bir sızdırmazlık oluşturmak için septumu şırınganın ucuna sıkıca bastırın.

Pistona yavaşça bastırın, mineral yağ enjeksiyon sisteminin cam elemanlarından geçecektir. Cam pipetin doldurulması. Kanal boyunca herhangi bir hava kabarcığı çıkarmak için tüm yağı enjeksiyon sisteminden itin.

Doldurma şırıngasında mineral yağ bitiyorsa, sürekli yağ dağıtırken iğneyi yavaşça geri çekin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, astar şırıngasını tekrar doldurun ve tekrar enjekte edin. Tüm sistem mineral yağ ile doldurulduğunda, 10 mikrolitrelik orijinal pistonu yerleştirin.

Hamilton şırıngası, sistemden ek mineral yağı çıkarmak için pistonu tamamen bastırır. Cam mikro pipeti ve şırınganın ucunu silerek temizleyin. % 70 etanol ile pistonu namlu üzerindeki iki mikrolitre işaretine kadar çekin.

Cam mikro pipetin ucu hava ile dolacak ve mineral yağ ile enjekte edilecek sıvı arasında bir tampon bölge sağlayacaktır. Mikro pipetin ucunu istenen solüsyona yerleştirerek ve Hamilton şırıngasının pistonunu çekerek pipet haznesini doldurun. Göz içi enjeksiyonu gerçekleştirmek için yetişkin bir sıçan gözüne dört ila beş mikrolitreden fazla çözelti enjekte edilmeyecektir.

Gaz akışını stereotaksik çerçeve için gaz maskesi ekine geçirerek başlayın. Daha sonra stereotaksik aparata flor anestezi uygulanmış bir sıçan yerleştirin. Flor konsantrasyonunu %2'ye düşürün ve anesteziyi izleyin.

Hayvanı cerrahi bir battaniye ile örtün. Ameliyat boyunca vücut ısısını korumak için göz kapaklarını açın ve bir damla akan anestezik solüsyon yerleştirin. Kornea enjeksiyonunun yüzeyinde, biri cam pipeti vitreus odasına yerleştirmek ve pipet pozisyonunu korumak için iki kişi gerekir.

Ve bir diğeri, istenen çözeltiyi sağlayan şırınga üzerindeki pistona bastırmak için. Cerrahi mikroskop altında, cam mikro pipeti ve çift RN cam kuplörü kavrayın, göz kapaklarını enjeksiyon bölgesinin karşısında V şeklinde olacak şekilde açın Parmaklarınızla göz yörüngeden çıkacaktır. Cam mikro pipetin ucunu kan damarı olmayan bir alana ve skleranın içinden aşağı doğru bir açıyla nazikçe sokun.

Pipet skleraya girdiğinde, küçük bir patlama hissedilir. Şırıngayı tutan kişi şimdi pistonu şırınga üzerindeki iki mikrolitre işaretine bastırarak dört mikrolitre çözelti enjekte etmelidir. Enjeksiyon yaklaşık bir ila iki saniye sürmelidir.

Başarılı bir şekilde enjekte edilen çözelti vitreus odasından akacak, mikro pipeti yaklaşık beş saniye boyunca sabit tutacak ve daha sonra aynı yönde geri çekilecektir İğne yerleştirildiği gibi, konjonktiva küçük açıklığın üzerinden geri dönerek skleral ponksiyonu kapatmaya yardımcı olacaktır. Ameliyat tamamlandıktan sonra, flor izini kapatın ve hayvanın birkaç dakika oksijen solumasına izin verin. Korneanın yüzeyini oftalmik göz merhemi ile örtün İyileşme sırasında kornea kurumasını önlemek için, hayvanı stereotaksik cihazdan çıkarın ve kurtarma kafesine geri koyun.

Eks otomi sonrası retrograd taşıma yoluyla retinal ganglion hücrelerini manipüle etmek. Öncelikle eşlik eden video optik sinir transeksiyon protokolündeki talimatlara göre optik sinir transeksiyonu yapın, 2, 2, 4, 1 izleyici ilaçlar. Plazmitler, siRNA'lar veya viral vektörler optik sinir kütüğüne uygulanabilir.

Bu işlemi gerçekleştirmek için jel köpük veya optik sinire doğrudan enjeksiyon kullanılarak iki ana yöntem vardır. Jel köpük yöntemi kullanılıyorsa, taksonomiden bir hafta önce superior colliculus'a retrograd izleyiciler enjekte ederek retinal ganglion hücrelerinin önceden etiketlendiğinden emin olun. Optik sinir kesildikten hemen sonra, kesilen optik sinir kütüğü üzerine deneysel çözeltiye batırılmış küçük bir jel köpük parçası yerleştirilir, orbital içerik daha sonra önceki konuma geri döndürülür.

Göz nötr bir konuma döndüğünde, jel köpük parçasını yörüngeye doğru itmek için forseps kullanın ve optik sinirin ucunda kalmasını sağlayın. Enjeksiyon tekniği, op plazmik akışla retro olarak büyük ölçüde taşınması için aksonun sitoplazmasına erişmesi gereken maddelerin verilmesi için daha etkilidir, İstenen çözeltiyi kesilen optik sinire enjekte etmek için sızdırmaz 10 mikrolitrelik bir Hamilton şırınga kullanılır. Kısa eğimli bir iğne arzu edilir.

Şırıngaya enjekte edilecek çözeltinin 10 mikrolitresini yükleyin. Tipik olarak irna plazmitleri veya viral vektörler enjekte etmek için optik sinirin kenarını ince uçlu dumont forseps ile kavrar. İğnenin ucunu sinire paralel olarak optik sinire sokun.

Eğim artık görünmeyene kadar, yerleştirilen iğne sinir tarafından her taraftan sarılacaktır. İğne yerleştirildikten sonra, ince uçlu forseps ile sinirin kenarlarını hafifçe sıkın ve şırıngayı döndürürken çözeltinin dörtte birini enjekte edin. Saat yönünde veya saat yönünün tersine çeyrek dönüş.

İğnenin tam dönüşü tamamlanana ve şırınganın tüm içeriği enjekte edilene kadar bu adımları tekrarlamaya devam edin. Şırınganın ucunu sinirden çıkarın. Sinirden geri akışı olan enjekte edilen herhangi bir sıvıyı yörünge içinde bırakın, çünkü bu, aksonların uçları tarafından alım için ek bir havuz oluşturacaktır.

Yörünge içeriğini orijinal konumlarına geri getirin, yarayı kapatın ve hayvanın iyileşmesine izin verin. Hayvanlar ameliyattan sonra bağımsız olarak barındırılmalıdır. Cerrahi sonrası analjezikler, hayvan bakımınızın yönergelerine göre uygulanmalıdır.

Ameliyattan sonra yetkililer ve hayvanlar dikkatle izlenmelidir. Bu videoda gösterildiği gibi, RGC, kesilen optik sinir kütüğüne peptitler, ilaçlar, vektörler, plazmitler veya siRNA'lar verilerek doğrudan hedeflenebilir. Bu temsili örnekte, floro altın retrograd etiketleme yapıldı ve SI üç etiketli peptitler hemen optik sinire enjekte edildi.

Daha sonra peptitlerin fiksasyon sırasında dokudan sızmasını önlemek için retinanın canlı görüntülemesi yapıldı, burada görülebileceği gibi, optik sinire enjekte edilen SI üç etiketli peptitler retro idi ve büyük ölçüde retinadaki RGC somato'ya geri taşındı. Bu örnekte, optik sinir kütüğüne SI üç etiketli siRNA enjekte edildi. Retinanın takotomisi ve canlı görüntülemesi tekrar yapıldıktan hemen sonra, optik sinire enjekte edilen SI üç etiketli siRNA'lar retrograd idi ve kolokalizasyonları ile gösterildiği gibi RG CS tarafından taşındı.

Florgold retrograd etiketleme ile Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa saniyeler içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü denerken, lense zarar vermemek için dikkatli olmak önemlidir. Viral partiküllerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyolojik tehlikelerle çalışmak için kurumsal yönergelere her zaman uyulması gerektiğini unutmayın.