Memeli MSS Optik Sinir transeksiyonu sonra Deneysel İşlemler Yöntemleri

Retinal ganglion hücreleri veya RG hücreleri, görsel bilgiyi retina üzerinden optik sinir aracılığıyla beyne ileten merkezi sinir sistemi nöronlarıdır. Eşlik eden videoda, yetişkin merkezi sinir sistemindeki apoptotik nöral hücre ölümü modeli olarak tüm RGC popülasyonunun aksonlarının eksodonomize edilmesi veya kesilmesi yöntemi gösterilmiştir. Burada bu yöntem; nörotrofik faktörleri, kısa müdahale edici RNA'ları, plazmidleri veya anti-ATO proteinlerini kodlayan viral vektörleri doğrudan hasarlı retinal ganglion hücrelerine veya retinayı küresel olarak hedeflemek için retinaya yönlendiren prosedürlerle birleştirilmiştir.

Retinal gangliyon hücrelerini özel olarak hedeflemek amacıyla, gözün vitreus boşluğuna madde enjekte etmek için bir intraoküler enjeksiyon düzeneği kurulur ve kullanılır. Optik sinire madde enjekte etmek için ya Gelfoam yerleştirilir ya da Hamilton şırıngaları kullanılır. Stump görüntüleme sonuçları, anti-apoptotik faktörlerin iletimiyle retinal gangliyon hücresi sağkalımının artırılabileceğini göstermektedir.

Bu teknikler kullanılarak, merkezi sinir sistemindeki yetişkin nöron apoptozuna dahil olan proteinler tanımlanabilir. Optik sinir transversiyonu, yetişkin MSS'de nöronal apoptoz için tekrarlanabilir bir model olduğundan, bu tekniğin etkileri merkezi sinir sistemi hastalıklarının tedavisine veya teşhisine kadar uzanmaktadır. Genellikle, bu tekniğe yeni başlayanlar, cam pipeti gözün vitreus boşluğuna yerleştirirken lensine zarar verdikleri için zorluk yaşarlar. İntraoküler enjeksiyonlar için şırınga sistemini hazırlamak amacıyla, önce herhangi bir iğneyi veya RN somununu çıkararak başlayın.

10 µL'lik bir RN gast sıkı 1701 Hamilton şırıngası hazırlayın. PFA ferrülünü, sıkıştırma bağlantısının uç kadeh ferrülüne yerleştirin. Ardından, tamamlanmış bağlantı aparatını şırınganın ucuna takın ve RN somununu üzerine gevşekçe vidalayın.

Bir adet 16'lık inç PEEK borunun bir ucunu, RN somunundaki açıklıktan geçerek sıkıştırma bağlantısına yerleştirin. PEEK borunun tamamen oturduğundan emin olun. PEEK boruyu sızdırmaz hale getirmek için ferrülü sıkıştıracak şekilde RN somununu sıkın.

Bu işlemi çift RN cam kuplörünün her iki ucunda da tekrarlayın. Peak borusunun boşta kalan ucunu, RN somun tutucuyu sıkarak çift RN cam kuplörünün bir ucuna sabitleyin. Cam mikro pipet, enjeksiyon sistemi için iğne ve gövdeyi oluşturacaktır.

Cam pipeti, çiftli RN cam bağlayıcısının boş ucuna yerleştirin. Pipeti sabitlemek için RN somunu sıkın. Bir diseksiyon mikroskobu altında, çekilmiş bir mikro pipeti belli bir açıyla tutarak ve ucunu bir lamın buzlu cam yüzeyine sürterek uygun çapta bir uç oluşturun.

İdeal olarak, uç kısmı hafifçe eğimli olmalıdır. Ardından, Hamilton Syringe Company'den alınan bir hazırlama kiti kullanılarak; şırınga, uç boru bağlantı parçası, çift RN cam kuplör ve cam mikropipet mineral yağ ile doldurularak kullanıma hazır hale getirilir. Hidrolik enjeksiyon sisteminde, iğne bir Hamilton 9 0 0 3 0 iğne ile değiştirilir.

Ardından, mineral yağı enjekte ederken sızdırmazlık sağlamak için Hamilton 9 0 0 3 0 iğnesinin üzerine kauçuk bir septum yerleştirin. Hazırlama şırıngasının Hamilton 9 0 0 3 0 iğnesini, enjeksiyon sisteminin 10 µL'lik Hamilton şırıngasının gövdesinin arka kısmına yerleştirin. Sızdırmazlık oluşturmak için septumu şırınganın ucuna sıkıca bastırın.

Pistonu yavaşça bastırın; mineral yağ, enjeksiyon sisteminin cam elemanlarından geçecektir. Bu işlem cam pipeti doldurur. Hat boyunca oluşmuş tüm hava kabarcıklarını gidermek için yağın tamamını enjeksiyon sisteminden geçirin.

Eğer doldurma şırıngasındaki mineral yağ bitiyorsa, sürekli yağ verirken iğneyi yavaşça geri çekin. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için hazırlama şırıngasını yeniden doldurun ve tekrar enjekte edin. Tüm sistem mineral yağ ile dolduğunda, 10 microliter orijinal pistonu yerleştirin.

Sistemden fazla mineral yağı uzaklaştırmak için Hamilton şırıngasının pistonunu tamamen bastırın. Cam mikro pipeti ve şırınganın ucunu temizleyin. %70 ethanol ile pistonu, gövde üzerindeki iki mikrolitre işaretine kadar geri çekin.

Cam mikro pipetin ucu hava ile dolacak ve böylece mineral yağ ile enjekte edilecek sıvı arasında bir tampon bölge oluşacaktır. Mikro pipetin ucunu istenen çözeltiye yerleştirip Hamilton şırıngasının pistonunu geri çekerek pipet gövdesini doldurun. İntraoküler enjeksiyonu gerçekleştirmek için yetişkin bir sıçan gözüne 4-5 µL'den fazla çözelti enjekte edilmemelidir.

Gaz akışını stereotaksik çerçeve için gaz maskesi aparatına yönlendirerek başlayın. Ardından, izofluran ile anestezi uygulanmış sıçanı stereotaksik cihaza yerleştirin. İzofluran konsantrasyonunu %2'ye düşürün ve anesteziyi izleyin.

Hayvanı cerrahi bir örtü ile örtün. Ameliyat boyunca vücut sıcaklığını korumak için göz kapaklarını açın ve bir damla lokal anestezik solüsyon damlatın. Kornea yüzeyine yapılan enjeksiyon iki kişi gerektirir; kişilerden biri cam pipeti vitreus boşluğuna yerleştirmeli ve pipet konumunu korumalıdır.

Bir diğeri ise, istenen çözeltiyi veren şırıngadaki pistonu bastırmak için kullanılır. Cerrahi bir mikroskop altında, cam mikro pipeti ve çift RN cam bağlayıcıyı kavrayın, göz kapaklarını enjeksiyon bölgesinin karşısında V şeklinde açın. Parmaklarla göz orbitadan yukarı kaldırılacaktır. Cam mikro pipetin ucunu, damarların bulunmadığı bir bölgeden ve sklera üzerinden aşağı doğru bir açıyla nazikçe yerleştirin.

Pipet sklera içerisine girdiğinde küçük bir patlama hissi oluşacaktır. Şırıngayı tutan kişi, pistonu şırınga üzerindeki iki mikrolitre işaretine kadar bastırarak dört mikrolitre çözelti enjekte etmelidir. Enjeksiyon işlemi yaklaşık bir ila iki saniye sürmelidir.

Başarıyla enjekte edilen solüsyon vitreus odasını yıkayacaktır; mikropipeti yaklaşık beş saniye boyunca sabit tutun ve ardından iğnenin yerleştirildiği yönün aynısında geri çekin. Konjunktiva küçük açıklığın üzerine tekrar kapanarak skleral ponksiyonun sızdırmaz hale getirilmesine yardımcı olacaktır. Cerrahi işlem tamamlandığında, izofluranı kapatın ve hayvanın birkaç dakika boyunca oksijen solumasını sağlayın. İyileşme sürecinde kornea kurumasını önlemek için kornea yüzeyini oftalmik göz pomadı ile kaplayın, ardından hayvanı stereotaktik cihazdan çıkarıp iyileşme kafesine geri koyun.

Ekstomi sonrası retrograd taşıma yoluyla retinal ganglion hücrelerini manipüle etmek için. Öncelikle, eşlik eden optic nerve transection protocol, 2, 2 4, 1 tracers drugs videosundaki talimatlara göre bir optik sinir kesisi gerçekleştirin. Plazmitler, siRNA'lar veya viral vektörler optik sinir güdüğüne uygulanabilir.

Bu prosedürü gerçekleştirmek için jel sünger kullanımı veya optik sinire doğrudan enjeksiyon olmak üzere iki ana yöntem vardır. Jel sünger yöntemi kullanılıyorsa, taksonomiden bir hafta önce superior colliculus'a retrograd izleyiciler enjekte edilerek retinal ganglion hücrelerinin önceden işaretlendiğinden emin olun. Optik sinir kesildikten hemen sonra, deneysel çözeltiye batırılmış küçük bir jel sünger parçası kesilen optik sinir güdüğünün üzerine yerleştirilir ve ardından orbital içerikler eski konumuna geri getirilir.

Göz nötr konuma getirildiğinde, jel sünger parçasını optik sinirin ucunun üzerinde kaldığından emin olacak şekilde forseps kullanarak orbit içine itin. Enjeksiyon tekniği, plazmik akış yoluyla retrograd olarak taşınmak için aksonun sitoplazmasına erişmesi gereken maddelerin iletiminde daha etkilidir. Transekte edilmiş optik sinire istenen çözeltiyi enjekte etmek için sızdırmaz 10 µL Hamilton şırıngası kullanılır. Kısa eğimli bir iğne tercih edilir.

Enjekte edilecek çözeltiden 10 µL miktarında şırıngaya çekin. Genellikle enjekte edilen irna plazmitleri veya viral vektörler için, optik sinirin kenarını ince uçlu Dumont pensle kavrayın. İğnenin ucunu optik sinire, sinirle paralel olacak şekilde yerleştirin.

Bisel görünmez hale gelene kadar, yerleştirilen iğne her iki yandan sinir tarafından sarılacaktır. İğne yerleştirildikten sonra, ince uçlu forsepsle sinirin yanlarını nazikçe sıkıştırın ve şırıngayı döndürerek solüsyonun dörtte birini enjekte edin. Saat yönünde veya tersi yönünde dörtte bir tur döndürün.

İğnenin tam bir dönüşü tamamlanana ve şırınganın tüm içeriği enjekte edilene kadar bu adımları tekrarlamaya devam edin. Şırınga ucunu sinirden çıkarın. Sinirden geri sızan enjekte edilmiş sıvıyı orbit içerisinde bırakın; çünkü bu sıvı, akson uçları tarafından emilim için ek bir havuz oluşturacaktır.

Orbital içeriği orijinal konumuna geri getirin, yarayı kapatın ve hayvanın iyileşmesine izin verin. Hayvanlar cerrahi işlem sonrası bağımsız olarak barındırılmalıdır. Ameliyat sonrası analjezikler, hayvan bakım kılavuzlarınıza uygun olarak uygulanmalıdır.

Ameliyat sonrası hayvanlar ve yetkili personeller tarafından dikkatle izlenmelidir. Bu videoda gösterildiği üzere, kesilmiş optik sinir güdüğüne peptitler, ilaçlar, vektörler, plazmitler veya siRNA'lar ileterek RGC'ler doğrudan hedeflenebilir. Bu temsili örnekte, fluoro gold retrograd etiketleme yapılmış ve SI three etiketli peptitler hemen optik sinire enjekte edilmiştir.

Peptitlerin fiksasyon sırasında dokudan sızmasını önlemek amacıyla retinada canlı görüntüleme gerçekleştirilmiştir; burada görülebileceği üzere, optik sinire enjekte edilen SI three işaretli peptitler retrograd olarak retinadaki RGC somalarına büyük oranda taşınmıştır. Bu örnekte, optik sinir güdüğüne SI three işaretli siRNA'lar enjekte edilmiştir. Taksonomiyi takiben retinada tekrar canlı görüntüleme yapılmış ve optik sinire enjekte edilen SI three işaretli siRNA'ların, kolokalizasyonlarının gösterdiği üzere RGC'ler tarafından retrograd olarak taşındığı belirlenmiştir.

Fluorgold retrograd etiketleme ile, bu teknik bir kez kavrandığında, doğru şekilde uygulandığı takdirde saniyeler içinde gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, lense zarar vermemeye özen göstermek önemlidir. Viral partiküllerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini unutmayın ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyotehlikelerle çalışma konusundaki kurumsal kılavuzlara her zaman uyulmalıdır.