Yüksek çözünürlüklü Fiber-optik Mikroendoskopi In situ Hücresel Görüntüleme

Geleneksel olarak, hücresel düzeyde çözünürlükte mikroskobik analiz gerektiren biyolojik ve klinik çalışmalar, ışık mikroskobu ile değerlendirme için ardışık zaman noktalarında çalışmadan çıkarılan bireysel örneklerle paralel olarak birden fazla deney yürütülerek gerçekleştirilirken, konfokal, multifoton ve ikinci harmonik mikroskopi, yerinde görüntüleme için yararlı tekniklerdir. Gerekli altyapı, tarama lazer sistemlerini ve karmaşık ışık kaynaklarını içeren karmaşık ve pahalıdır. Burada, 5.000 ABD dolarının altında bir fiyata hazır bileşenleri kullanarak tek bir günde yüksek çözünürlüklü bir fiber optik mikro endoskop sisteminin nasıl oluşturulacağını gösteriyoruz.

Platform, görüntü çözünürlüğü, görüş alanı ve çalışma dalga boyu açısından esneklik sunar. İlk olarak, bir ışık kaynağı, optik filtreler, lensler, bir fiber optik demeti ve bir CCD kamerayı barındırmak için basit bir epi floresan mikroskop çerçevesi monte edilir. Daha sonra, CCD kameradaki fiber optik demetin büyütülmüş bir görüntüsünü oluşturan görüntüleme lensleri kurulur.

Daha sonra numuneye floresan uyarma ışığı sağlamak için aydınlatma optiklerine sahip bir LED kaynağı kurulur. Son olarak, monte edilmiş mikro endoskop ile gerçek zamanlı görüntüleme, in vitro kültürler, in vivo hayvan modelleri ve insan denekler dahil olmak üzere floresan olarak işaretlenmiş numunelerin hücresel düzeyde ayrıntılarını ortaya çıkarır. Bu tekniğin konfokal veya multifoton mikroskobu gibi mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında temel avantajı, çok çeşitli alanlarda çalışan araştırmacıların hızlı bir şekilde uygulayabilmeleri ve kendi özel ihtiyaçlarını karşılayacak şekilde özelleştirebilmeleri için yeterince basit ve ucuz olmasıdır.

Burada tarif edilen yüksek çözünürlüklü mikro endoskop, montaj ve uygulamada mümkün olan çeşitli varyasyonlara sahip bir temel konfigürasyon olarak düşünülmelidir. Belirli bir uygulama için bileşen seçerken, florol konsantrasyonu, fotoağartma aydınlatması, yoğunluk, kamera hassasiyeti, kazanç ve maruz kalma süresi arasındaki floresan mikroskobunda yer alan doğal ilişkileri göz önünde bulundurun. Bu platform, floresan kontrast madde olarak pro flavin ile birlikte kullanılmak üzere tasarlanmıştır, ancak diğer floresan boyalarla çalışacak şekilde yapılandırılabilir.

Pro flavin, sırasıyla 445 nanometre ve 515 nanometre tepe absorpsiyon ve emisyon dalga boylarına sahip parlak bir çekirdek boyasıdır. Diğer kontrast ajanların kullanımı, kullanıcının uyarma emisyonunu seçmesini ve mikro endoskop sistemini monte etmek için uygun şekilde dikroik filtrelerin başlamasını gerektirecektir, iki adet altı inçlik kafes çubuğunu iki adet 1,5 inçlik kafes çubuğuna bağlayarak bir çift 7,5 inç uzunluğunda çubuk oluşturur. Çubukları katlanır ayna ünitesinin bir yüzüne vidalayın, ardından bir inç çapında bir ayna takın.

Ardından, dört adet 0,5 inçlik çubuğu katlanır ayna ünitesinin karşı yüzüne vidalayın. Kafes küpünü, alttaki iki delikten 7.5 inçlik kafes çubuklarının üzerine kaydırın. İki inçlik çubukları kafes küpünün yan yüzüne vidalayın.

C montajlı bir SM one adaptörü kullanarak kamerayı bir kafes plakasına takın. Kafes plakasını, katlanır ayna ünitesinin yüzü ile aynı hizada olacak şekilde 0.5 inç kafes çubuklarına sabitleyin. Kameradaki fiber optik demetin bir görüntüsünü oluşturmak için bir inç çapında bir tüp lens seçin.

Lensin odak uzaklığı, fiber optik demetin nedeni en az iki piksel örneklenecek şekilde seçilmelidir. Kameraya görüntülendiğinde, lensi üç inç uzunluğunda bir lens tüpüne yerleştirin ve lensi bir tutma halkası ile sabitleyin. Bir anahtar anahtarı, tutma halkalarını uzun lens tüplerine vidalamak için yararlıdır.

Emisyon filtresini üç inçlik lens tüpüne, ilk tutma halkasının üstüne bırakın ve filtreyi yerine sabitlemek için başka bir halka ekleyin. Filtre yönünün, filtre üreticisi tarafından belirtilen kuralı karşıladığından emin olun. Lens tüpünü kafes küpünün CCD kameraya en yakın tarafına vidalayın.

Bu konum burada da gösterilir. Şemada, bu lens ve filtrenin üç inç lens tüpü olmadan gösterildiğini unutmayın. Netlik için kamerayı bir bilgisayara bağlayın ve görüntüyü ekranda görüntüleyin.

Kafes tertibatını uzaktaki bir nesneye yönlendirin ve nesnenin bir görüntüsü odakta görünene kadar kafes küpünü raylar boyunca kaydırın. Kafes küpünün yanlarında bulunan dört vidayı sıkmak için bir tornavida kullanın. Bu vidalar sıkıldığında küpü yerinde tutarak rayları kavrar.

Bu, tüp lenslerin, sonsuzluk düzeltmeli objektif lensi ile birleştirildiğinde kamera üzerindeki fiber demetinin odaklanmış bir görüntüsünü oluşturmasını sağlayacaktır. Ardından, dikey aynayı tutucuya yerleştirin ve kafes küpüne 45 derece açıyla yerleştirin. Objektif lensini bir RMS - SM tek dişli adaptör ve ayarlanabilir bir lens tüpü aracılığıyla tüp lens tutucusunun karşısındaki kafes küpünün yüzüne vidalayın.

Bundan sonra, bir SMA konektörünü bir kafes plakasına vidalayın ve bunu yaklaşık olarak objektif merceğin çalışma mesafesindeki çubuklara monte edin. Taban plakasını ve uç kapağı kafes küpünün açık taraflarına ekleyin. Ardından bir kafes plakasına bir LED monte edin ve iki inçlik çubukların ucuna kaydırın.

0,5 inçlik bir lens tüpüne, bu tüp kafes küpünün yan tarafına vidalandığında, objektif lensin arka diyaframını dolduran LED'in bir görüntüsünü oluşturacak şekilde bir lens ekleyin. Ayrıca, uyarma filtresini lens tüpüne ekleyin. Bu aşamada, epoksi kullanarak aydınlatıcı ışık yoğunluğunu kontrol etmek için bir LED sürücü kullanılabilir.

1030 mikron görüş alanına sahip fiber optik demetine 720 mikron fiber için bir SMA konektörü takın. Fiber optik konektörle ilgili ayrıntılar için T Thor laboratuvarları, parça numarası FN dokuz altı'ya bakın. Optik fiberlerin birleştirilmesi ve parlatılması için bir kılavuz.

SMA konektör göz demetini kafese monte edilmiş SMA yuvasına vidalayın: Çubuklar, demetin distal ucunu geniş bantlı bir ışık kaynağına yönlendirir, floresan aydınlatma yeterli olacaktır. Ardından, CCD kamerada demet proksimal yüzünün görüntüsünü gözlemleyin. Son olarak, kafes küpünü vidalayarak veya çıkararak objektif merceğin konumunu ayarlayın.

Elyaf demeti görüntüsü odakta görünene kadar, bireysel neden açıkça görülebilir olmalıdır. Mikro endoskopun uzamsal çözünürlüğü, lif demetinin distal ucuna bir mikro lens veya lens düzeneği takılarak artırılabilir. Bu optikler, demet ucunu doğrudan doku üzerine yerleştirmek yerine, uç doku yüzeyine dem büyütme ile görüntülenecek şekilde yapılandırılmıştır.

Böylece, fiber demetinin ışık yönlendirici nedeni tarafından uygulanan uzamsal örnekleme frekansını arttırır. Dem büyütme derecesi, uzamsal çözünürlükteki artışa ve aynı zamanda görüş alanındaki orantılı bir azalmaya karşılık gelir. Uygulamanız için istediğiniz büyütme ve çalışma mesafesine sahip bir sırıtma lensi seçin.

Lensin çapının fiber demetininkiyle eşleştiğinden emin olun. Siz ile çalışmayı planlıyorsunuz. Doğru hizalama için fiber demetini ve sırıtma lensini düşük güçlü bir mikroskop veya stereoskop altında ayrı üç eksenli manuel konumlandırma aşamalarına monte edin.

Ardından, lensin veya demet yüzünün üzerine bir damla optik yapıştırıcı yerleştirin. Manuel konumlandırıcıları kullanarak iki bileşeni temas ettirin. Yapıştırıcıyı sertleştirmek için üretici tarafından önerilen doz için arayüzü UV ışığına maruz bırakın.

Sırıtma merceğini ve bağlı arayüzü korumak için, eklemi kapatmak için kısa bir alüminyum kılcal boru kullanın. Boruyu bağlantının üzerine kaydırın ve borunun her iki ucunda epoksi damlası ile yerine sabitleyin, montajı bitirmek için ısıyla daralan makaron kullanın. Mikro endoskopik görüntülemeden önce, kontrast maddeyi görüntülenecek hücrelere veya dokuya, görüntü hücrelerine ve kültüre uygulayın.

İlk olarak, büyüme ortamını peppe ile çıkarın. Daha sonra kuyuya hafifçe pipetleyerek pro flavin solüsyonu ekleyin. Bir dakikaya kadar kısa bir inkübasyondan sonra, pro flavin çözeltisini peppe ile çıkarın ve atın.

Kuyuya taze PBS solüsyonu ekleyip çıkararak hücreleri durulayın, fiber demetinin distal ucunu stabilite için x, Y, Z ekseninde manuel konumlandırma aşamaları ile güvenli bir fikstüre monte edin. Boyanın hücrelere veya dokuya uygulanmasını takiben görüntüleme sırasında, fiber optik demeti numune ile hafif temas edecek şekilde yerleştirin. Kamera üreticisi tarafından sağlanan yazılımı veya geliştirmek isteyebileceğiniz herhangi bir özel yazılımı kullanarak fiber optik demetinin görüntüsünü bilgisayar ekranında görüntüleyin.

Kabul edilebilir parlaklıkta bir görüntü elde etmek için kameranın pozlama süresini ve kazanç ayarlarını yapın. Doğru bir şekilde monte edildiğinde, mikro endoskop, tutarlı bir fiber optik demet boyunca iletilen bir epi floresan mikroskobu olarak çalışacaktır. Optimum görüntüleme sonuçları için, üç temel koşulun karşılandığından emin olunmasına dikkat edilmelidir.

İlk olarak, sistemin tam çözünürlüğünü elde etmek için fiber demetinin proksimal yüzü odak kaybı olmadan CCD kamerada görüntülenmelidir. Burada. Bir fiber demetinin bir kısmı zayıf odak, hafif odak ve iyi odak ile görüntülenir. Optimum odak, objektif merceğin demet yüzüne göre gerçek konumu ayarlanarak bulunur.

İkinci olarak, fiber demetinin proksimal yüzü, tam çapı boyunca eşit şekilde aydınlatılmalıdır. Daha önce açıklandığı gibi, bu, kola aydınlatması için aydınlatma optiklerinin yapılandırılmasıyla elde edilir. Burada gösterilen görüntü, bu tercih edilen konfigürasyonda tek tip bir floresan numunesi aydınlatıldığında elde edilmiştir.

Kritik aydınlatma altında karşılık gelen sonuç burada gösterilmektedir. LED'in yapısı, fiber demeti yüzü üzerinde görüntülenir ve bu da gerçek numune yapısının üzerine bindirilmiş bu istenmeyen desenin ortaya çıkmasına neden olur. Üçüncüsü, lif demetinin hem proksimal hem de distal yüzlerinin temiz olduğundan ve çizik ve talaş içermediğinden emin olmak önemlidir.

Bu örnekte, demet yüzüne görüntü kalıntıları yapıştırılmış ve fiber çevresinde saat beşte küçük bir çip şeklinde hasar görülmüştür. Lens kağıdı ve izopropanol veya standart fiber optik temizleme araçları ile geleneksel fiber optik konektörlerle aynı şekilde temizlenerek demet yüzeylerindeki kalıntılar çıkarılabilir. 1483 hücre pro flavin ile etiketlendi ve çıplak lif demeti numuneye hafifçe yerleştirildi.

Burada in vitro görüntüleme, demet ucuna 2,5 x grin lens bağlandığında, uzamsal çözünürlükte bir iyileşme ve görüş alanında azalma elde edildiğinde gösterilmektedir. Dış çapı 0.5 milimetre olan bir lif demetinin 21 gauge iğneden geçirilerek fare meme yağ yastıkçığı dokusuna ilerletildiği in vivo görüntüleme, bu filmde görüldüğü gibi adipositlerin kardiyak siklus nedeniyle hareketle net bir şekilde görülebildiği görülmektedir. Bu örnekte, sağlıklı bir insan gönüllüde oral mukozanın görüntülenmesi, 1.5 milimetre dış çapa sahip daha büyük bir lif demeti kullanılarak gerçekleştirildi.

Tüm örneklerde, gösterilen pro flavin, nükleer etiketleme floresan kontrast maddesi olarak kullanılmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, hücrelerin ve dokuların C iki floresan görüntülemesi için bir fiber optik mikro endoskopun nasıl tasarlanacağını ve monte edileceğini iyi anlamış olmalısınız.