Name: Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-14T17:35:00.000+00:00
Duration: 10 min 46 s
Description: Keşfedin, yenidoğan farelerden pulmoner endotel hücreleri izolasyon ve kültür yöntemini. Manyetik boncuklarla zenginleştirme ve jelatin kaplı flasklarda büyütme teknikleriyle yüksek saflıkta hücre elde edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu araştırma, Amerikan Kalp Birliği hibe 0950118G.to MC-W tarafından kısmen desteklenmiştir.

1. , Anti-PECAM-1 antikor konjuge manyetik boncuk hazırlanması (Dynabeads) <ol><li> PBS içinde% 0,1 BSA BSA eriyene kadar bir vorteks kullanarak 50 ml PBS içinde 50 mg BSA karıştırma hazırlayın. 0.22 mikron şırınga filtre ile filtreleme ile sterilize edin. 4 ° C saklayınız </li><li> TC kaput, 1.5 ml Eppendorf tüp içine yeniden süspanse koyun anti-fare IgG Dynabeads 200 ul transferi ve boncuklar yıkamak: Dağı tüp MPC ve tortu boncuk izin vermek için yaklaşık 1 dakika bekletin. Süpernatant aspire, MPC tüp kaldırmak ve 1 ml steril% 0,1 BSA / PBS boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. Boncuklar tekrar süspansiyon pipet ve aşağı yukarı. </li><li> Toplam dört yıkama, yıkama üç kez daha tekrarlayın. </li><li> MPC'den tüpünü çıkarın ve% 0,1 BSA / PBS 500 ul boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> Tüpüne 10 ul sıçan anti-fare PECAM-1 (CD-31) antikor ekleyin. </li><li> Soğuk oda veya oda sıcaklığında 2 saat 4 ° C'de gece Tumble. </li><li> Adım 1.2 dört kez açıklandığı gibi steril% 0,1 BSA / PBS ile boncuk yıkayın. </li><li> MPC'den tüpünü çıkarın ve 200 ul% 0,1 BSA / PBS boncuklar tekrar süspansiyon haline getirin. Mağaza, anti-PECAM-1 antikor konjuge Dynabeads 4 ° C 1 aya kadar. </li></ol> 2. Yenidoğan farelerin Yalıtımlı fare pulmoner endotel hücreleri Doku arıtma protokol geçmeden önce, işlemin IACUC Komitesi onayı gereklidir. <ol><li> Aşağıdakileri hazırlayın: <ul><li> DMEM 1 mg / ml 'C / D çözümü, 15 ml. 37 filtre ve sıcak 0.22 mikron şırınga ile Filtre ° C </li><li> 50 ml konik tüp 15 ml DMEM, buz üzerinde mağaza ile </li><li> DMEM% 20 FBS ve 1x penisilin / streptomisin içeren İzolasyon Media (IM) </li><li> Jelatin 2%. 100 ml, 4 gg su, otoklav 15 dakika ve mağaza ° C 2 g sığır cilt jelatin karıştırın Sıcak - 37 ° C kaplama TC şişeler önce sıvılaştığını. </li></ul></li><li> Ketamin (100 mg / kg) ve xylazine (10 mg / kg) bir IP enjeksiyon kullanarak üç 6-8 günlük yavrular anestezisi. Aşağıdaki gibi anestezi etkinliğini kontrol edin ve hayvanların tek tek teşrih: kuruluna Pin yavrular, steril diseksiyon makas ile göğüs bölgesinde cilt,% 70 Etanol ile deri emmek ve kaldırmak. Akciğerler maruz Vergi göğüs kafesi. </li><li> Aseptik tüketim bireysel akciğer lobları, dikkatli olmak, bronşlar ve akciğerlerin etrafında görünür bir bağ dokusu incelemek. Buz DMEM tüm akciğerler birleştirin. Yavrular Euthanize. </li><li> TC kaput, 100 mm TC çanak yer DMEM akciğer lobları kaldırmak ve aşırı DMEM aspire. </li><li> Steril makas kullanarak, ~ 100 kere keserek ince doku kıyma. Enzimatik sindirim için 15 ml sıcak C / D çözümü transfer. Rotator 37 ° C'de 45 dakika inkübe edin. </li><li> TC kaput, tek bir hücre süspansiyonu içine 14 gr kanül bağlı ve çiğnemek kümeleri, en az 12 kere, 20 ml şırınganın içine sindirilmiş doku süspansiyon aspire. </li><li> 70 mikron hücre süzgecinden doku süspansiyonu Pass ve süzgeç sindirim durdurmak için 15 ml IM ile yıkayın. </li><li> Pelet 400x g de 5 dakika santrifüj hücre süspansiyonu. </li><li> 3 ml% 0,1 BSA / PBS aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon pelet. </li><li> Hücre süspansiyonu 5 ml yuvarlak alt polistiren tüp transferi ve 22.5 ul anti-PECAM-1 antikor konjuge Dynabeads ekleyin. 12 dakika oda sıcaklığında Tumble. </li><li> Kat 2 ml% 2 jelatin ve aspirat fazla jelatin ile T75 şişesi. TC kaput kaplama öncesi hücreleri yaklaşık 30 dakika içinde kuru jelatin izin ver. </li><li> (Adım 2.10), boncuk inkübasyon tamamlandıktan sonra üç Eppendorf tüpleri içine eşit hücre süspansiyonu bölünmüş ve MPC monte. </li><li> Boncuklar, MPC (~ 1 dak.) Kullanarak tortulaşmış olduğunda, supernatant toplamak MPC'den tüp kaldırmak, boncuk yıkayın ~ 1 ml% 0,1 BSA / PBS, MPC ve sonra yeniden bağlayın. </li><li> Dört kez (toplam 5 yıkar) yıkamak tekrarlayın. </li><li> VascuLife 1 ml EnGS-Mv Yaşam Faktörler Kit ve tüp başına 1x penisilin / streptomisin (VL) ile yeniden süspanse boncuk, iyi karıştırma. </li><li> Bir ön-T75 balon kaplı Plaka ve her bir cam şişe içinde toplam hacim 10 ml VL getirmek. </li><li> Büyüme, 1 tam gün izin medya ertesi gün değiştirin ve sonra her gün medyanın yarısını değiştirmek. Hücreleri (genellikle 3-4 gün sonra kültür)&gt;% 70-80 konfluent veya daha fazla zaman, anti-ICAM-2 Dynabeads sıralanabilir. </li></ol> 3. Hazırlanması, anti-ICAM-2 antikor konjuge Dynabeads <ol><li> Anti-ICAM-2 antikor konjuge Dynabeads konfluent kadar anti-PECAM-1 Dynabeads antikor konjuge ve kültür ile seçilmiş olan hücreler daha fazla saflaştırmak için kullanılır. Bu prosedür, bu anti-fare ICAM-2 (CD-102) antikor, anti-PECAM-1 antikor yerine kullanılır dışında, anti-PECAM-1 antikor konjuge Dynabeads (1, yukarıda) anlatıldığı gibi yapılır. </li><li> Anti-ICAM-2 antikor konjuge Dynabeads ° C için 4 saklanabilir1 aya kadar. </li></ol> 4. Anti-ICAM-2 Dynabeads Fare Akciğer Endotel Hücreleri Sıralama <ol><li> % 2 jelatin ile Coat T75 doku kültürü şişesi. </li><li> Hücreleri ile balon konfluent T75 medya aspire ve 8 ml PBS ile yıkayın. </li><li> Aspire PBS, 2 ml% 0.05 tripsin / EDTA (yaklaşık 5 dakika) hücreleri ayırmak. Ayrılmakta yardım şişeler hafifçe dokunun. </li><li> Hücreleri müstakil, tripsin ve kazıma hücrelerini inhibe kalan yapışık hücreleri ayırmak için 2 ml IM ekleyin. 15 ml tüp Transfer hücre süspansiyonu ve 400x g. az 5 dakika aşağı doğru döndürün </li><li> 2 ml% 0,1 BSA / PBS medya ve tekrar süspansiyon hücre pelletini aspire edin. </li><li> 5 ml polistiren yuvarlak alt tüp transferi ve 10 ul anti-ICAM-2 Dynabeads ekleyin. RT 12 dakika Tumble. </li><li> MPC üzerinde iki adet 1,5 ml Eppendorf tüpleri ve montaj Split hücre süspansiyonu. </li><li> Boncuklar bir dakika süreyle uyulması sonra süpernatant aspire edin. MPC'den tüpler çıkarın ve 1 ml% 0,1 BSA / PBS her tüp tekrar süspansiyon haline getirin. PPK üzerinde tekrar bağlayın. </li><li> Dört kez (toplam 5 yıkar) yıkayın tekrarlayın. </li><li> Her tüpe 1 ml VL ile yeniden süspanse edin ve bir hücre sayımı gerçekleştirmek. </li><li> , T25, termos ve / veya T75 şişesi ortalama 750 bin-1 milyon hücre başına 250-350K hücreleri Plaka hücreleri. </li><li> T25 şişelerde 5 ml, VL ve T75 şişeler 10 ml hacim kazandırın. </li><li> Her gün medya değiştirin. Kültür genellikle 2-3 gün, yaklaşık 80% confluency ulaştığında Hücreler deneyler için kullanılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Tipik olarak, 6-7 gün sonra hücrelerin ilk hazırlık, yaklaşık 1,2 elde edebilmek üç 6-8 gün eski yavrular 1.5 x 10 6 pulmoner endotel hücreleri. Hücreler ışık mikroskobu altında tipik "arnavut kaldırımı" morfolojisi ekran ve endotel hücreleri (Şekil 1) için karakteristik olan VE-cadherin (CD144) hücre-hücre kavşaklarda boyama, göstermek. MLECs ifade VE cadherin ve VEGFR2 çoğunluğu FACS analizi (Şekil 2) göstermiştir. Genellikle, ilk MLEC izolasyon sonra iki hafta içinde deneyler için bunları kullanmak. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 konfluent MLEC tek tabaka mikroskobik analizi. (A) Işık mikroskobu görüntü endotel hücreleri için tipik kültür hücrelerinin arnavut kaldırımlı morfolojisi gösterir. Birçok hücre perinükleer alanda bulunan Tekdüzen yuvarlak yapılar MLEC izolasyonu için kullanılan manyetik boncuk. (B) Endotel özel VE-kaderin konfokal mikroskobi kullanarak gösterildiği gibi hücre-hücre kavşaklarda lokalize olur. Bar 20μm bir temsilcisidir. <img src="/files/ftp_upload/2316/2316fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2, endotel-spesifik belirteçler için spesifik antikorların etiketli kültürlü MLECs FACS analizi: fikoeritrin-konjuge sekonder antikor takip VE kaderin (CD144) veya VEGFR2 olarak suçlanan, izole MLECs endotel kimliğini doğruluyor . Kırmızı çizgi izotip özel kontrol gösterir, yeşil hat gösterir anti-VE-kaderin ya da anti-VEGFR2 özgü IgG.

<ol><li>Maruyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+endothelial+cell+in+tissue+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Z+Zellforsch+Mikrosk.+Anat%22%5BJournal%5D)">The human endothelial cell in tissue culture.</a> Z Zellforsch Mikrosk. Anat. 60, 69-79 (1963).</li>
<li>Lim, Y. C., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+murine+heart+and+lung+endothelial+cells+for+in+vitro+model+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of murine heart and lung endothelial cells for in vitro model systems.</a> Methods Mol Biol. 341, 141-154 (2006).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity+of+the+endothelium%3A+I.+Structure%2C+function%2C+and+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity of the endothelium: I. Structure, function, and mechanisms.</a> Circ Res. 100, 158-173 (2007).</li>
<li>Fehrenbach, M. L., Cao, G., Williams, J. T., Finklestein, J. M., Delisser, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+lung+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Lung+Cell+Mol+Physiol%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine lung endothelial cells.</a> Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 296, L1096-L1103 (2009).</li>
<li>Miebach, S., Grau, S., Hummel, V., Rieckmann, P., Tonn, J. C., Goldbrunner, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+gliomas+of+different+WHO+grades%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from gliomas of different WHO grades.</a> J. Neurooncol. 76, 39-48 (2006).</li>
<li>Demeule, M., Labelle, M., Régina, A., Berthelet, F., Béliveau, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+endothelial+cells+from+brain%2C+lung%2C+and+kidney%3A+expression+of+the+multidrug+resistance+P-glycoprotein+isoforms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of endothelial cells from brain, lung, and kidney: expression of the multidrug resistance P-glycoprotein isoforms.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 281, 827-834 (2001).</li>
<li>Kajimoto, K., Hossen, N., Hida, K., Ohga, N., Akita, H., Hyodo, M., Hida, Y., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+microvascular+endothelial+cells+from+murine+inguinal+and+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of microvascular endothelial cells from murine inguinal and epididymal adipose tissues.</a> J. Immunol. Methods. 357, 43-50 (2010).</li>
<li>Breviario, F., Caveda, L., Corada, M., Martin-Padura, I., Navarro, P., Golay, J., Introna, M., Gulino, D., Lampugnani, M. G., Dejana, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+human+vascular+endothelial+cadherin+%287B4%2Fcadherin-5%29%2C+an+endothelium-specific+cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional properties of human vascular endothelial cadherin (7B4/cadherin-5), an endothelium-specific cadherin.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 15, 1229-1239 (1995).</li>
<li>Zachary, I., Gliki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+transduction+mechanisms+mediating+biological+actions+of+the+vascular+endothelial+growth+factor+family%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Signaling transduction mechanisms mediating biological actions of the vascular endothelial growth factor family.</a> Cardiovasc Res. 49, 568-581 (2001).</li>
<li>Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+heart-derived+endothelial+and+smooth+muscle+cell+cultures%3A+isolation%2C+cloning+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Cell%22%5BJournal%5D)">Rat heart-derived endothelial and smooth muscle cell cultures: isolation, cloning and characterization.</a> Tissue Cell. 20, 477-492 (1988).</li>
<li>Petzelbauer, P., Bender, J. R., Wilson, J., Pober, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+dermal+microvascular+endothelial+cell+antigen+expression+and+cytokine+responsiveness+in+situ+and+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of dermal microvascular endothelial cell antigen expression and cytokine responsiveness in situ and in cell culture.</a> J Immunol. 151, 5062-5072 (1993).</li>
<li>Chrzanowska-Wodnicka, M., Kraus, A. E., Gale, D., White, G. C. 2nd, Vansluys, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+angiogenesis%2C+endothelial+migration%2C+proliferation%2C+and+MAPK+signaling+in+Rap1b-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Defective angiogenesis, endothelial migration, proliferation, and MAPK signaling in Rap1b-deficient mice.</a> Blood. 111, 2647-2656 (2008).</li>
</ol>

Protokolü AUA # 00001206 altında Wisconsin IACUC Komitesi Tıp Fakültesi tarafından belirlenen kurallara ve yönetmeliklere uygun olarak hayvanlar üzerinde deneyler yapıldı.

Mikrovasküler EC vasküler biyoloji birçok alanda yararlı bir model olduğu kanıtlanmış ve yaygın olarak incelenmiştir HUVECs 3 &#39;ünden (örneğin anjiyogenez) incelemek için daha fazla fizyolojik ilgili olduğu düşünülmektedir . Daha önce, bu mikrovasküler EC böbrek, kalp, deri, retina, beyin, gliomlar, yağ dokusu ve aynı zamanda akciğer 2, 4-7, 10, 11 elde edilebilir olduğu bildirilmiştir. Ancak, tutarlı ve güvenilir bir yöntemdir mikrovasküler EC izolasyonu için hala gereklidir. Burada sunulan yöntemle, daha önce yayınlanmış bir protokol 2 bir değişiklik; yavrular yerine yetişkin hayvanların kullandığı en yayınlanan prosedürleri farklıdır. Genç hayvanlardan elde edilen hücrelerin çoğalması potansiyeli yüksek ve dokulardan elde edilen kültürler, hücrelerin daha fazla sayıda verim eğilimi olarak bu izolasyon başarısı için çok önemlidir. Bir hafta eski hayvanların en iyi gibi görünüyor, ancak genç farelerde (4 gün eski) de kullanılabilir. Ayrıca, yavruların daha yüksek veya daha düşük sayıda bir yavru MLECs izole başarılı olduğu gibi, gerektiğinde kullanılan olabilir. Ancak, izolasyon işlemini ölçekleme veya aşağı iken, hücre kaplama yoğunluğu bu da hücre çoğalması için kritik olarak değişmeden kalmalıdır. Ilk anti-PECAM-1 konjuge manyetik boncuklar kullanarak MLECs ve anti-ICAM-2 antikorları daha 2 adım arınma süreci çok daha verimli, daha önce açıklanan tek bir adım arıtma işlemleri daha saf EC kültürler elde. Bu protokol, çok zahmetli bir el teknikleri, degrade santrifüj ve fibroblastlar, kan hücreleri ve düz kas hücreleri gibi atarak kirlenmesine neden olan hücreler için sıralama daha az verimli FACS kullanma ihtiyacı ortadan kaldırır. Anjiyogenik yanıtları, damar geçirgenliği ve lökosit göçüne in vitro analizi, iyileşme yanı sıra sinyal yolları biyokimyasal analiz yara sonucu MLEC nüfus kullanılabilir. Gerekirse, MLECs trans-endotelyal direnci (TER) ölçümleri için immünofloresan veya elektrod fibronektin veya jelatin kaplı lamelleri gibi farklı yüzeylerde kaplama olabilir. Elde edilen sonuçlar, giderek artan sayıda nakavt ve transgenik fare hatları bağlamında özellikle önemlidir in vivo gözlenen fenotipleri doğrudan mukayese edilebilir . In vitro analizi, in vivo gözlenen hatalarının altında yatan hücresel mekanizmaları için bu yöntemi başarılı bir şekilde uygulanması, zaten 12 sunulmuştur .

<table><tbody><tr><td>Yaylı makas</td><td>Fine Science Tools</td><td>15032-13</td><td></td></tr><tr><td>Pens</td><td>Fine Science Tools</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>14G kanül</td><td>Fisher Scientific</td><td>1482516N</td><td></td></tr><tr><td>20 ml şırınga</td><td>BD Biosciences</td><td>309661</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>anti-rat IgG Dynabeads</td><td>Invitrogen</td><td>110.35</td><td></td></tr><tr><td>Manyetik Partikül Konsantratörü (MPC)</td><td>Invitrogen</td><td>123-21D</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse PECAM-1 antikoru (CD-31)</td><td>BD Biosciences</td><td>553369</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse ICAM-2 antikoru (CD-102)</td><td>BD Biosciences</td><td>553326</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz/Dispaz (C/D)</td><td>Roche Group</td><td>11097113001</td><td>100mg/ml stok çözelti hazırlanabilir ve -20&amp;#x00B0;C'de saklanabilir</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Cellgro</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>Sığır Derisi Jelatini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>#G9391-100G</td><td></td></tr><tr><td>Vasculife EnGS-Mv tam kit (VL)</td><td>Lifeline Cell Technology</td><td>LL0004</td><td></td></tr><tr><td>0.05% Trypsin/EDTA</td><td>Mediatech, Inc.</td><td>25-052-CI</td><td></td></tr><tr><td>Hücre süzgeci 70 &amp;mu;m naylon</td><td>Falcon BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>doku kültürü flaskı 75 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Techno Plastic Products</td><td>90076</td><td></td></tr></tbody></table>

yenidoğan fareler pulmoner endotel hücreleri İzolasyon ve kültür

Isolation and Culture of Pulmonary Endothelial Cells from Neonatal Mice

Endotel hücreleri, damar biyoloji birçok alanda yararlı bir araştırma modeli sağlar. Ilk izolasyon 1 yılından bu yana, insan umbilikal ven endotel hücreleri (HUVECs) en çok araştırılan endotel hücreleri, böylece kolay elde etmek ve kültürüne uygun görüldüğü gibi, ve. Ancak, anjiyogenez, geçirgenlik ya da diğerleri gibi süreçler üzerinde odaklanan araştırma, mikrovasküler endotel hücreleri (EC) 2. çalışma çok daha önemli fizyolojik model . Ayrıca, nakavt fareler izole edilen EC protein fonksiyon ex vivo analizi için yararlı bir araç sağlar . Çeşitli yaklaşımlar izole etmek ve kültür mikrovasküler farklı kökenli EC tarihten 3-7 bildirilen, ancak saf EC tutarlı izolasyonu ve kültürü hala birçok laboratuvarda büyük bir teknik sorun var. Burada, biz bir adım-adım protokol yalıtma ve kültür fare akciğer endotel hücreleri (MLECs) güvenilir ve nispeten basit bir yöntem sağlar. Bu yaklaşımda, akciğer dokusu 6 elde edilen 8 gün eski yavrular ilk kollajenaz / dispase (C / D) çözümü ile sindirilmiş, parçalar halinde kesilir ve tek hücre süspansiyonu içine mekanik dağınık. MLECS Manyetik Parçacık Yoğunlaştırıcı (PPK) kullanarak Dynabeads konjuge anti-PECAM-1 antikoru ile pozitif seçim kullanarak hücre süspansiyonu arınmış. Konfluent olana kadar saflaştırılmış Böyle hücreleri (TC) yemekleri, jelatin kaplı doku kültürü kültüre. Bu noktada, hücrelerin daha fazla anti-ICAM-2 antikoru ile birleştiğinde Dynabeads kullanarak saflaştırılmış. Bu protokol ile elde MLECs bir arnavut kaldırımlı fenotip, sergi, faz-kontrast ışık mikroskobu olarak görünür ve kendi endotel fenotipi anti-VE-kaderin 8 ve anti-VEGFR2 9 antikorlar ve immunofluorescent VE kaderin boyama FACS analizi kullanılarak teyit edilmiştir. Bizim ellerde, bu iki adımlı bir izolasyon prosedürü, tutarlı ve güvenilir MLECs saf bir nüfus, daha kültürlü olabilir verir. Bu yöntem, araştırmacılar, eleme ve izole MLECs üzerinde gerçekleştirilen in vitro deneylerde sonuçları in vivo çalışmalar doğrudan ilişkilendirmek için transgenik fareler sayıları giderek artan yararlanmak ve bu nedenle in vivo gözlenen vasküler fenotipleri moleküler mekanizmaları ortaya çıkarmak için yardım sağlayacaktır.

Burada, fare pulmoner endotel hücrelerin izolasyonu ve kültürü için bir protokol açıklar. Bu yöntem, mekanik ve enzimatik akciğer dokusunda ayrılma yanı sıra anti-PECAM-1 ve çoğunlukla mikrovasküler kökenli saf bir endotel hücre popülasyonu üreten manyetik boncuk, konjuge anti-ICAM-2 antikorları kullanarak 2-aşamalı bir arınma süreci kapsar.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Endotel hücreler, vasküler biyolojinin birçok alanında kullanışlı bir araştırma modeli sunar. İlk izolasyonundan bu yana 1, insan göbek kordonu ven endotel hücreleri...

Bu prosedürün genel amacı, neonatal farelerden pulmoner endotelyal hücreleri izole etmek ve kültürlemektedir. Bu işlem, öncelikle taze olarak hasat edilen akciğerlerden homojen bir hücre süspansiyonu oluşturularak gerçekleştirilir. Son olarak doku ince kıyılır ve enzimatik sindirime tabi tutulur, ardından anti P chem one antikoru konjugeli manyetik boncuklar kullanılarak endotelyal hücreler açısından zenginleştirilir.CETA kültürü, endotel hücre popülasyonunu saflaştırır. Daha sonra anti ICAM-2 antikoru konjuge manyetik boncuklar kullanılarak bu hücreler jelatin kaplı bir flask içerisinde çoğaltılır. Elde edilen primer pulmoner endotel hücreleri çoğunlukla mikrovasküler kökenlidir ve TIE2 ve VEGF R2 gibi spesifik endotel hücre belirteçlerini eksprese ederler.Bu tekniğin irna gen susturma gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, genetik olarak modifiye edilmiş endotel hücreleri elde etmek için transgenik farelerin kullanımına olanak tanımasıdır. Ayrıca, bu teknikle elde edilen endotel hücreleri çoğunlukla mikrovasküler kökenlidir ve bu nedenle vasküler araştırmaların bazı alanları için daha uygun olabilir. Bu yöntemle elde edilen endotel hücreleri; anjiyogenezin moleküler mekanizmaları ve vasküler geçirgenliğe ilişkin olanlar gibi, vasküler biyoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Doku hasadı sindirimi ve boncukla bağlanmış hücre yıkama adımlarının öğrenilmesi zor olduğundan, bu tekniğin görsel gösterimi kritik önem taşır. Bu tekniğin hatalı uygulanması, endotel dışı hücre kontaminasyonuna ve düşük hücre verimi ile büyümesine yol açabilir. Bu dyna beads protokolü için, PBS içinde 50 mililitre %0,1 BSA hazırlayın ve BSA çözünene kadar vorteksleyerek karıştırın, ardından çözeltiyi 0,22 mikronluk bir şırıngadan geçirerek sterilize edin.Steril koşullar altında, doku kültürü kabininde koyun anti-rat IgG dyna-bead'leri resüspande edin ve 200 µL'sini 1,5 mL'lik bir eppendorf tüpüne aktarın. Boncukları yıkamak için tüpü manyetik partikül konsantratörüne (MPC) yerleştirin ve boncukların çökmesi için bir dakika bekleyip süpernatanı aspire edin. Tüpü MPC'den çıkarın ve boncukları 1 mL steril %0,1 BSA-PBS içinde yeniden süspande edin.Dördüncü yıkamadan sonra bu yıkama işlemini üç kez daha tekrarlayın. Tüpü MPC ve Resus'tan çıkarın. Boncukları 500 µL %0,1 B-S-A-P-B-S içinde süspande edin.Tüpe 10 µL sıçan anti-fare pcam one antikoru ekleyin ve daha önce gösterildiği gibi oda sıcaklığında iki saat boyunca takla döndürerek karıştırın. Boncukları steril %0,1 B-S-A-P-B-S ile dört kez yıkayın. Tüpü MPC'den çıkarın ve yeniden süspande edin.Boncuklar, 200 µL %0.1 B-S-A-P-B-S içinde saklanır. Anti P chem one antikoru ile konjuge edilmiş dyna beads hazırlığı dört °C'de muhafaza edilir. Primer hücreler elde etmek için üç adet altı ila sekiz günlük yavru fareyi anesteziye alın.Pensle kuyruklara sıkıştırarak anestezinin etkinliğini sağlayın. Hayvanları sırayla disseke edin. Önce yavruyu tahtaya iğneleyin ve göğüs bölgesindeki deriyi çıkarın.Diseksiyon makasları ile akciğerleri ortaya çıkarmak için göğüs kafesini kesin. Ardından, akciğer loblarını aseptik koşullarda tek tek çıkarın. Bu sırada bronşları veya akciğerlerin etrafındaki görünür bağ dokusunu kesmemeye dikkat edin.Tüm akciğerleri buz gibi soğuk DMEM içerisinde birleştirin ve yavruları ötanazi ile uyutun. Şimdi doku kültürü kabinine geçin. Akciğer loblarını DMEM'den çıkarın ve 100 milimetrelik bir doku kültürü kabına yerleştirin.Steril makaslarla dokuyu ince parçalara ayırarak fazla DMEM'yi aspire edin. Enzimatik sindirim için son olarak yaklaşık yüz kez kesin. Doku preparatını 15 mL ılık kolajenaz sindirim çözeltisine aktarın ve 14 gauge kanül bağlı 20 mL'lik bir şırınga ile rotatör üzerinde 37 °C'de 45 dakika inkübe edin. Sindirilmiş doku kümelerini tek hücre süspansiyonu haline getirmek için tritüre edin.Şimdi hücre süspansiyonunu 70 µm'lik bir hücre süzgecinden geçirin ve sindirim reaksiyonunu durdurmak için süzgeci 15 mL Im ile yıkayın. Akciğer hücrelerini toplamak için 400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin ve süpernatanı aspire ederek uzaklaştırın. Ardından hücre peletini 3 mL %0,1 BSA-PBS içinde yeniden süspande edin ve beş mililitrelik yuvarlak tabanlı bir polistiren tüpe aktarın.Endotel hücrelerini izole etmek için 22,5 µL dyna beads'e konjuge anti P chem one antikoru ekleyin ve oda sıcaklığında 12 dakika boyunca takla şeklinde karıştırın. Bu sırada, bir T 75 flask'ı 2 mL %2 jelatin ile kaplayın. Fazla jelatin solüsyonunu aspire edin ve doku kültürü kabini içinde yaklaşık yarım saat hava ile kurumaya bırakın. Boncuk inkübasyonu tamamlandığında, hücre süspansiyonunu üç fendor tüpüne eşit olarak paylaştırın ve MPC üzerine yerleştirin.MPC sistemini kullanarak, dyna bead'leri yaklaşık bir mililitre %0,1 B-S-A-P-B-S ile beş kez yıkayın. Son yıkamadan sonra, boncukları tüp başına bir mililitre VAs life içerisinde yeniden süspande edin. Tüm tüpleri birleştirerek iyice karıştırın. Dyna bead hücre preparatını önceden kodlanmış T 75 flask'ına ekleyin ve flask'taki toplam hacmi VAs life ile 10 mililitreye tamamlayın.Şimdi flaskları 37 °C, %5 CO2 inkübatöre yerleştirin. Ertesi gün medyayı değiştirin, bir tam gün boyunca büyümeye bırakın ve hücreler %70 ila %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar iki günde bir medyanın yarısını değiştirin. Primer hücre kültürünü daha fazla saflaştırmak için, daha önce gösterildiği gibi antikor konjuge dyna beads hazırlayın, ancak bu sefer CD 1 0 2 ve muse I chem iki antikoru kullanın.Ayrıca, daha önce gösterildiği gibi bir T 75 doku kültürü flaskını %2 jelatin ile kaplayın. Şimdi, içinde hücreler bulunan T 75 flaskını inkübatörden çıkarın. Besiyerini aspire edin ve primer hücreleri sekiz mililitre PBS ile yıkayıp aspire edin.PBS'den sonra, 0,05% tripsin EDTA'dan iki mililitre ekleyin ve hücrelerin ayrışması için yaklaşık beş dakika bekleyin. Hücrelerin ayrışmasını sağlamak için flaska hafifçe vurun. Tripsini inhibe etmek için iki mililitre IM ekleyin ve yapışık kalan tüm hücreleri sıyırın.Hücre süspansiyonunu 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 400 ×g'de beş dakika boyunca santrifüj ederek hasat edin, medyumu aspire ederek çekin ve hücre peletini iki mililitre %0,1 BSA-PBS içerisinde yeniden süspanse edin; ardından beş mililitrelik polistiren yuvarlak tabanlı bir tüpe aktarıp 10 µL anti-ICAM-2 DynaBeads ekleyin. Oda sıcaklığında 12 dakika boyunca takla attırarak karıştırın, hücre süspansiyonunu iki adet 1,5 mililitrelik eppendorf tüpüne bölün ve MPC sistemine yerleştirin.Daha önce yapıldığı gibi, boncukları beş kez toplamda bir mililitre %0.1 B-S-A-P-B-S-A ile yıkayın. Şimdi her tüpü bir mililitre VAs life içinde yeniden süspande edin ve hücre sayımı gerçekleştirin. Son olarak, hücreleri 10 mililitre VAs life içerisinde, her bir T 75 flask başına 800 ila 1000 K hücre olacak şekilde ekimleyin. Flaskları bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin.Kültürler yaklaşık %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar besiyerini gün aşırı değiştirin. Saflaştırılmış fare akciğer endotel hücreleri deneylerde kullanılmaya hazırdır. Genellikle, altı ila sekiz günlük üç yavrudan hazırlanan hücre örneği, bir haftalık kültür sonunda 1,2 ila 1,5 × 10⁶ pulmoner endotel hücresi sağlar.Beklendiği üzere, bu primer endotel hücreleri ışık mikroskobunda parke taşı morfolojisi sergilemekte ve aynı zamanda hücreler arası bağlantılarda VE coherent boyanması göstermektedir. Bu protokol kullanılarak, faks analizi ile gösterildiği üzere, fare akciğer endotel hücrelerinin çoğunluğu VE coherent ve VEGF R two eksprese eder. Kırmızı çizgi izotip spesifik kontrolü, yeşil çizgi ise anti VE veya anti-VEGF R two spesifik IgG'yi belirtmektedir.Bu prosedür uygulanırken, yalnızca hedef dokunun toplanması, hücrelerin aşırı sindirilmesinden kaçınılması ve boncuklara bağlanmış hücrelerin iyice yıkanması önemlidir. Endotelyal hücreler elde edilmiştir. Bu prosedürün kullanımı, anjiyogenez ve vasküler geçirgenlik ile ilgili yanıtları analiz etmek amacıyla vasküler biyoloji alanındaki fonksiyonel analizler için tercih edilebilir.Bu videoyu izledikten sonra, chem one antikoru ve chem two antikoru ile bağlanan dyna beeps kullanarak primer fare endotel hücrelerinin nasıl izole edileceği ve saf endotel hücre kültürlerinin nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

isolation-culture-pulmonary-endothelial-cells-from-neonatal

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu yöntem, fare beyin mikrovasküler endotel hücreleri izole etmek ve ölümsüzleştirmek açıklamaktadır. Biz beyin dokusu, sindirim adımları, tohumlama ve hücre ölümsüzlük ve homojenizasyon başlayarak adım adım protokol açıklar. Genellikle, homojen, ölümsüzleştirdi mikrovasküler endotel hücre hattı elde etmek için yaklaşık beş hafta sürer.

Bir olarak ölümsüzleştirdi murin Beyin Mikrovasküler Endotel Hücre Hattı Üretimi<em&gt; In Vitro</em&gt; Kan Beyin Bariyeri Modeli

Birincil fare kardiyomyosit kültürleri miyofibriler organizasyon ve fonksiyon soruşturma için önemli araçlardan biridir. Aşağıdaki protokol neonatal fare kalpleri birincil kardiyomiyositlerde izolasyonunu ve kültür açıklar. Elde edilen kültürler, daha sonra kardiyomiyosit biyomekanik, biyokimyasal ve hücre-biyolojik tahlillerin çeşitli için kullanılabilmektedir.

İzolasyon ve Kültür Yenidoğan Fare kardiyomiyositlerin

Biz, böylece yeni doğan düz kas hücresi kasılma ve gevşeme dahil sinyal yollarının daha iyi çalışma izin olarak, yeni ve P7 kadar küçük farelerden pulmoner arter düz kas hücrelerinin primer kültürleri (PASMC) izole etmek için kullanışlı bir teknik geliştirdik.

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Bu video 10-12 gün içinde embriyonik ön beyin endotel hücreleri saf kültürlerin hazırlanması için kolay ve güvenilir bir strateji gösterir ve serebral damar birçok açıdan odaklanmış araştırma için yararlı olacaktır.

Embriyonik ön beyin gelen Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültürü

Beyin mikrovasküler endotel hücreleri (BMEC), kan-beyin bariyeri (BBB) olarak adlandırılan, kanı ve merkezi sinir sistemini (CNS) ayıran yüksek düzeyde düzenlenmiş bir bariyer oluşturan spesifik bağlantı proteinleri ile birbirine bağlanır. Bu protokolde tartışıldığı gibi primer murin beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin izolasyonu, BBB'nin ayrıntılı in vitro çalışmalarını mümkün kılar.

İlköğretim Kemirgen Beyin mikrovasküler endotel hücreleri İzolasyonu

Vasküler endotel hücreleri birçok önemli kardiyovasküler hastalıkta önemli rol oynamaktadır. Bu makale, herhangi bir özel ekipman kullanmadan fare aortundan endotel hücrelerini izole etmek ve genişletmek için basit bir yöntemi açıklamaktadır. Protokolümüz, endotel hücre fizyopatolojisindeki mekanizmaları tanımlamak için etkili bir yol sağlar.

İzolasyon ve Fare aort endotel hücreleri İlköğretim Kültür

Bu protokol, fare koroner endotel hücrelerini görüntüleme veya moleküler biyolojik deneyler yapmak amacıyla izole etme yöntemimizi paylaşmak için hazırlanmıştır.

Fare Koroner Endotel Hücreleri İzolasyon

Bu makalede, primer akciğer endotel hücreleri yenidoğan farelerden izole edilmiş ve kültürlenmiştir.

Primer Fare Akciğer Endotel Hücrelerinin İzolasyonu

Zor olmasına rağmen, pulmoner endotel hücrelerinin izolasyonu, akciğer iltihabı ile ilgili çalışmalar için gereklidir. Bu protokol, makrovasküler ve mikrovasküler endotel hücrelerinin yüksek verimli, yüksek saflıkta izolasyonu için bir prosedürü tanımlamaktadır.

Akciğer Kaynaklı Örneklerden Mikrovasküler ve Makrovasküler Endotel Hücre İzolasyonu ve Saflaştırma

Bu protokol, yenidoğan, genç veya yetişkin fare akciğerlerinden (enfekte veya enfekte olmayan) canlı alveolar tip II epitel hücrelerini (AECII) izole etmek için akış sitometrisine dayalı bir yöntem sunar. Bu yaklaşım, AECII'nin akciğer iltihabı ve enfeksiyon sırasında rollerini belirlemeye yönelik moleküler ve/veya fonksiyonel çalışmaların ilerlemesini sağlar.

Yenidoğnan, genç ve yetişkin fare akciğerlerinden alveolar tip II epitel hücrelerinin enfeksîyonel deneysel ortamlara uyarlanabilir izolyasyonu

Beyin mikrovasküler endotel hücrelerinin (BMEC) neonatal fare beyin dokusundan izole edilmesi ve birincil kültürü için bir protokol sunulur; bu protokol kan-beyin bariyer fonksiyonunu fizyolojik ve patolojik koşullarda incelemek için sağlam bir in vitro model oluşturulur.

Fare Bin Mikrovasküler Endotel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü

Keşfedin, yenidoğan farelerden pulmoner endotel hücreleri izolasyon ve kültür yöntemini. Manyetik boncuklarla zenginleştirme ve jelatin kaplı flasklarda büyütme teknikleriyle yüksek saflıkta hücre elde edin.

Yenidoğan Fareler Pulmoner Endotel Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Daha fazla video keşfet