JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Sinirbilim
0 görüntülenme • 1:30 dk. • March 4th, 2025
Nörodejeneratif hastalıkların bir biyobelirteci olan fosforile alfa-sinüklein dahil olmak üzere BOS proteinleri ile başlayın.
Bir deterjan, bir indirgeyici madde ve bir izleme boyası içeren bir yükleme tamponu ekleyin.
Proteinleri denatüre etmek için ısıtın, ardından bunları bir SDS-PAGE jeline yükleyin.
Proteinleri moleküler ağırlığa göre farklı bantlara ayırmak için elektroforez gerçekleştirin.
Jeli, çalkalama ile bir lekeleme tamponunda inkübe edin.
Daha sonra, protein bantlarını jelden zara elektro-transfer edin.
Proteini zar üzerinde tutmak için zara bir fiksatif uygulayın, ardından yıkayın.
Alfa-sinükleinin fosforilasyonunu korumak için birincil antikorlar ve fosfataz inhibitörleri içeren bir bloke edici çözelti ile inkübe edin.
Antikorlar sadece fosforile alfa-sinüklein ile etkileşime girer ve bloke edici reaktifler spesifik olmayan etkileşim bölgelerini bloke eder, ardından yıkanır.
Birincil antikorlarla etkileşime giren enzim konjuge ikincil antikorları tanıtın, ardından yıkayın.
Enzimlerle etkileşime giren ve bir kemilüminesans oluşturan bir kemilüminesan substrat ekleyin.
Bir kemilüminesan bant, fosforile alfa-sinükleinin varlığını doğrular.