JoVE Encyclopedia of Experiments
Sinirbilim
0 görüntüleme • 1:22 dk • March 4th, 2025
Bir lizis tamponundaki bir insan beyin dokusu ile başlayın.
Beyin fonksiyonu için gerekli olan glutamik asit dekarboksilaz veya GAD enzim izoformları dahil olmak üzere proteinleri serbest bırakmak için dokuyu bir homojenizatör ile homojenize edin.
Homojenatı buz üzerinde inkübe edin, ardından kalıntıları peletlemek için santrifüjleyin. Protein içeren süpernatanı toplayın.
Proteinleri denatüre etmek için bir deterjan ve bir indirgeyici madde içeren bir yükleme tamponu ekleyin.
Proteinleri farklı bantlara ayırmak için bu numuneyi ve bir moleküler işaretleyiciyi gradyan bir SDS-PAGE jel ve elektroforez üzerine yükleyin.
Proteinleri jelden bir zar tabakasına elektroblotlayın.
Spesifik olmayan bağlamayı önlemek için bir engelleme aracısı ekleyin.
Alıcı GAD izoformlarına bağlanan GAD izoformuna özgü birincil antikorlarla inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları çıkarmak için yıkayın.
Floresan etiketli ikincil antikorlarla inkübe edin.
Tekrar yıkayın ve protein bantlarını bir görüntüleme sisteminde görselleştirin.
Floresan yoluyla GAD bantlarını tespit edin ve işaretleyiciyi kullanarak moleküler ağırlık farklılıklarını doğrulayın.