Name: B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Öğrenin, fare dalak B lenfositlerinde rekombinant retroviral üretim ve enfeksiyon kullanarak AID geninin stabil kalıtsal ifadesini nasıl sağlayacağınızı. Bu yöntem, gen yapı ve fonksiyon analizleri için maliyet etkin bir alternatif sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

CK, Columbia Üniversitesi Yüksek Lisans programı tarafından desteklenmektedir. UB Amerika Lösemi ve Lenfoma Derneği, Yeni Araştırmacı Ödülü Lösemi Araştırma Vakfı alıcı üyesidir ve Columbia Üniversitesi New Fakültesi başlangıç ​​fonu tarafından destekleniyor.

1. Dalak B-Lenfosit İzolasyon ve Uyarım <ol><li> YARDIM-eksik fareler 12 yaş 2-3 ay arasında dalak Hasat. Dalak izolasyon steril şartlarda yapılır ve% 15 fetal sığır serumu (FBS) içeren soğuk fosfat buffer salin (PBS) organları geçici olarak tutulur. </li><li> Dalak sonra steril bir doku kültürü kaput aktarılır ve% 2.5 FBS ile takviye 5 ml PBS içinde homojenize edilir. Homojenat 15 ml şahin tüpüne aktarın. </li><li> 4 1000rpm 10 dakika homojenize dalak doku örneği Santrifüj ° C pelet hücreleri. </li><li> Süpernatant santrifüj sonra süzün. Kırmızı kan hücreleri tarafından kirlenmesini önlemek için, 10 ml kırmızı kan hücresi hücre pelet (RBC) 7 dakika boyunca oda sıcaklığında lizis tamponu tekrar </li><li> 1000 rpm'de 10 dakika ve süzün süpernatant örnek Santrifüj ve 10 ml PBS% 2.5 FBS içeren hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin. </li><li> 100 mcL kısım çıkarın ve ölü hücreleri hariç tripan mavi kullanarak standart bir hemasitometre kullanarak 1:1000 dilüsyon hücreleri saymak. Yaklaşık 20-30 milyon hücreler dalak başına elde edilebilir. </li><li> 1000rpm az 10 dakika boyunca örnek Santrifüj ve süpernatantı süzün. </li><li> % 0.5 'lik bir konsantrasyon 90 mcL başına 10 7 hücre BSA / PBS içeren 2mm EDTA pelletini tekrar. </li><li> Özellikle non-B hücreleri bağlamak için anti-CD43 antikor kaplı manyetik bilye hücrelere ekleyin. 90 mcL başına 10 mcL boncuk (10 7 hücreleri) kullanın. İyice karıştırın ve 4 ° C'de 20 dakika için. </li><li> Hücrelerin etiketli edildikten sonra,% 2.5 FBS / PBS tüp başına ekleyerek yıkayın. 1000 rpm'de 10 dakika boyunca örnek santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant Durusu. Ml başına 10x10 7 hücre konsantrasyonunda% 0,1 BSA / PBS hücrelerin tekrar </li><li> Mount bir manyetik ayırıcı bir manyetik sıralama sütun. Flow-through toplamak ve sütun BSA / PBS başbakan ve yıkama 3ml% 0.5 'yüklemek için konik bir tüp doğrudan sütun altına yerleştirin. </li><li> Yıkama sıvısı akardı sonra, yeni bir toplama tüpü ile değiştirin. Örnek 1 ml den az ise,% 0.5 'BSA / PBS / EDTA ile 1 ml numune hacmi ayarlamak ve sütunda örnek yük. Yük hücreleri kolon başına sadece 1 ml maksimum ve gerekirse birden çok sütun kullanabilirsiniz. </li><li> Hücreleri pasif sütunun altında sütun üzerinden akış ve konik tüp ilişkisiz hücreleri toplamak için izin verin. 3 mL% 0,5 BSA / PBS-through akış toplamaya devam ederken, sütun 4 kez yıkayın. </li><li> CD43 negatif dinlenme B hücreleri zenginleştirilmiş olacağı flow-through toplayın. Sütun atın. 1000 rpm'de 10 dakika flow-through santrifüjleyin. </li><li> Süpernatant boşaltın ve 10 ml orta (15% FCS / + glutamin, Pen / Strep, Sigara esansiyel amino asitler, 50 mcM Β-ME) </li><li> Ml'de 10 6 hücre kültürü, hücre ve güvenin . </li><li> B hücre büyüme ve çoğalmasını teşvik etmek için, sırasıyla, son konsantrasyonu 20 mcg / ml ve 1 mcg / mL olduğu gibi rekombinant IL-4 ve anti-CD40 antikoru ile orta takviyesi, ve hücreler bir kültür şişesi aktarmak. </li><li> Hücrelerin bir gecede Kültür. Hücre sayımı ve uygun olarak IL-4 ve CD40 ekleyerek ml'de 10 6 hücre seyreltik. </li><li> 72 saat önce viral enfeksiyon Kültür hücreleri. </li></ol> 2. Üretici Hücreler, Transfeksiyon Katyonik lipidler veya kalsiyum fosfat kullanarak transfeksiyon için kurulan protokolleri kullanın. Plaka başına 100 mikrogram plazmid DNA ile DNA inşa başına Transfect 10cm 3 tabak,. Biz rutin olarak kalsiyum fosfat transfeksiyon yöntemi 13, 14 ve klorokin ile desteklenmiş yüksek viral titresi unutmayın . <ol><li> Üretici hücreleri transfekte olarak% 60 -70% konfluent Phoenix hücreleri kullanın. Bu izdiham hücre sayısı az, 10 cm plaka başına 5 milyon hücre olmalıdır. </li><li> Transfeksiyon için bir saat önce, Phoenix hücre büyümesi için taze eksiksiz bir medya ortamı değiştirin. </li><li> Steril bir eppendorpf tüp, ambalaj inşa DNA, 0,5 M CaCl 2 250 mcL 100 mikrogram birleştirmek ve steril su ile 500 mcL son ses seviyesini ayarlamak </li><li> 1 ml pipet kullanarak, şiddetle 15 mL polipropilen tüp içinde 500 mcL 2X HNP ile bu çözüm karışımı </li><li> Bu karışımı oda sıcaklığında 8-10 dakika dinlenmek için izin verin. Bu süre zarfında bir çökelti oluşacaktır. </li><li> Boyunca karışımı eşit olarak dağıtmak için orta dönen hücrelere açılan akıllıca transfeksiyon karışımı ekleyin. </li><li> 37 hücreleri ° C'de 12 saat boyunca. </li><li> 12 saat sonrası transfeksiyon, 8 ml tam B hücre büyümesini orta orta değiştirin ve 37 ° C inkübatör hücreleri geri dönmek. </li></ol> 3. Uyarılmış Dalak B Hücreleri Enfeksiyon <ol><li> Post-transfe 48hr Phoenix hücrelerden süpernatantıction ve herhangi bir hücre enkaz kaldırmak için 0.2 mikron filtre ile süpernatantı geçmek. </li><li> 3 mL karıştırın virüs içeren önceden aktive B hücreleri (adım 1) 3 mL süpernatant. Hücrelerin viral adsorpsiyon artırmak amacıyla, ml başına 16 mikrogram final konsantrasyonda polybrene ekleyin. </li><li> 30 90 dakika 2500 rpm'de santrifüj hücreleri enfekte ° C </li><li> 37 az 48-72 saat daha inkübe spin ° C hücre büyümesi ve çoğalması için izin hemen sonra. </li></ol> 4. Akım Sitometri Analizi <ol><li> Kullanarak, B220 ve yüzey IgG1 yüzey ifade etmek için bir akış sitometresinde hücreleri analiz. Hücrelerinin yüzeyinde IgG1 varlığı sınıf anahtarı rekombinasyon başarılı kurtarma YARDIM gen retroviral tamamlama yoluyla bir sonucu olarak meydana gelmiştir gösterir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar Biz başarıyla YARDIM eksikliği (YARDIM-/ -) protein faktörü Etkinleştirme İndüklenmiş sitidinin Deaminaz (AID) eksikliği kurtarıldı retroviral transdüksiyon kullanarak B-lenfositleri. Kısaca, Çocuk ve kadınlarda Maid-GFP 15-18 ile Phoenix hücreleri transfecting fare AID (MAID) proteini rekombinant retrovirüsler ifade oluşturulur. Hasat virüsler, ex vivo sınıf anahtarı rekombinasyon (KSS) stimülasyon koşulları 19 YARDIM-eksik farelerde elde YARDIM eksikliği B hücreleri enfekte olmuş . Enfekte B hücreleri daha sonra kültür flow sitometri analizi kullanarak 72 saat sonra KSS IgG1 incelendi. Şekil 2 KSS YARDIM ifade kurtarma bir sonucu olarak meydana geldiğini belirten YARDIM değil boş bir yapı ile B hücrelerinin yüzeyinde IgG1 tespiti gösterir. <img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1: Üretici hücreleri içinde retroviral ambalaj şeması: Ψ tarafından temsil edilen, daha önce 15 açıklandığı gibi ilgi Gen, Çocuk ve kadınlarda IRES-GFP içine subcloned. Plazmid kullanılarak kalsiyum fosfat yöntemi, 13, 14, gag-pol ve zarf proteini (Phoenix, Orbigen) üretme kapasitesine sahip bir ecotropic viral ambalaj hücre hattı içine transfekte oldu. Transfeksiyon Kırk sekiz saat sonra, süpernatant içeren viral parçacıkların farelerden elde edilen hedef birincil B hücreleri içine enfeksiyon için toplandı. <img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2: YARDIM eksik B hücreleri, anti-CD40 ile uyarılan ve IL-4, Çocuk ve kadınlarda Maid-GFP veya tek başına, GFP ifade eden bir retrovirüs içeren bir retrovirüs ile enfekte edildi . IgG1 KSS FACS analizi ile değerlendirildi.

<ol><li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li>
<li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+during+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li>
<li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+plasticity+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation plasticity of hematopoietic cells.</a> Blood. 99, 3089-30101 (2002).</li>
<li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+in+the+immune+system%3A+basic+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li>
<li>Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420, 520-562 (2002).</li>
<li>Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffiths%2C+AJF+%22Introduction+to+Genetic+Analysis%22">Introduction to Genetic Analysis</a>. , W. H. Freeman. New York. (2000).</li>
<li>Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+targeting+in+the+mouse+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics.</a> BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).</li>
<li>Plachy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviruses+selected+for+high+and+stable+expression+of+transduced+genes+accumulate+in+broadly+transcribed+genome+areas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas.</a> J Virol. 84, 4204-4211 (2010).</li>
<li>Felice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+genetic+determinants+of+retroviral+integration+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome.</a> PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).</li>
<li>Karavanas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+targeting+by+murine+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Cell targeting by murine retroviral vectors.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).</li>
<li>Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+39-kDa+protein+on+activated+helper+T+cells+binds+CD40+and+transduces+the+signal+for+cognate+activation+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+switch+recombination+and+hypermutation+require+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+potential+RNA+editing+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme.</a> Cell. 102, 553-563 (2000).</li>
<li>Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+viral+DNA+in+optimal+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions.</a> J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413, 639-6343 (2001).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AID+antibody+diversification+enzyme+is+regulated+by+protein+kinase+A+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.</a> Nature. 438, 508-5011 (2005).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Barreto, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+from+bony+fish+catalyzes+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">AID from bony fish catalyzes class switch recombination.</a> J Exp Med. 202, 733-738 (2005).</li>
<li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE%3A+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li>
<li>Castigli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+expression+and+function+in+murine+B+cell+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40 expression and function in murine B cell ontogeny.</a> Int Immunol. 8, 405-411 (1996).</li>
<li>Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+of+a+switch+substrate+retrovector+in+CD40-+activated+B+lymphocytes%3A+implications+for+the+control+of+CH+gene+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination.</a> J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).</li>
</ol>

Şekil 1 burada tarif ve tasvir olarak dalak B hücreleri retroviral transdüksiyon lymphopoesis gelişimsel olayların birçok transkripsiyonel Kural 1, 2 kontrol edilir çünkü, B-lenfositleri çalışma yararlı genetik bir yaklaşımdır . CD40L üzerinden tetikleme B hücre olgunlaşması, daha sonraki aşamalarında, B hücre büyüme indüksiyon, hücre döngüsü içine giriş ve çoğalması 11, 20 için gereklidir . Şekil 2&#39;de görüldüğü gibi, B hücrelerinin çoğalması bu patlama geçmesi...

<table><tbody><tr><td>FCS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>Alyuvar (RBC) lizis tamponu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>CD43 boncukları</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B Hücresi Komple Besiyeri</td><td>Çeşitli</td><td>Çeşitli Bileşenler</td><td>RPMI, %15 FCS, %1 Temel Olmayan Amino Asitler, %1 Sodyum Piruvat, %1 HEPES, %1 Pen-Strep, 50&amp;#x03BC;M &amp;#946;-Merkapto&amp;#8211;etanol</td></tr><tr><td>IL-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD40</td><td>BD Biosciences</td><td>553787</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689 &amp;#8232;</td><td></td></tr><tr><td>Klorokin difosfat tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>100mM konsantrasyonda kullanıldı</td></tr><tr><td>Ph&amp;#8211;nix Eco hücreleri (Murine)</td><td>Orbigen</td><td>RVC-10002</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5-&amp;alpha;-mouse-CD45R (B220)</td><td>eBioscience</td><td>15-0452-81</td><td></td></tr><tr><td>PE-&amp;alpha;-mouse-IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>A85-1</td><td></td></tr></tbody></table>

b hücreleri rekombinant retroviral Üretim ve enfeksiyon

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Ökaryotik hücrelerde genlerin transgenik ifade ilgi bir gen ortaya çıkan fenotip analizi kolaylaştırmak için heterolog ifade sisteminin kontrolü altında ifade edildiği güçlü bir ters genetik bir yaklaşımdır. Bu yaklaşım, normal organizmada bulunan bir gen ifade etmek için bir gen ürünü bir mutant formu ifade etmek, ya da gen ürünü bir dominant-negatif bir form içinde ifade etmek için kullanılabilir. Transkripsiyonel yönetmelik 2-4 yorumlanan B hücreleri 1, gelişimi ve farklılaşmasında önemli bir kontrol mekanizması hematopoetik sistem, çalışmaya yararlıdır. Fare genetik, insan genlerini ve hastalıkların çalışma için güçlü bir araçtır. Fare ve insan genomu karşılaştırmalı bir analiz genom 5 üzerinden% 90 synteny korunması ortaya koymaktadır. Ayrıca, fare modellerinde kullanılan teknoloji, örneğin, gen kesintileri ve alel değiştirme 6 insan genlerinin çalışma için geçerli Ancak, transgenik fare yaratma, hem de mali ve teknik nitelikte kaynakların büyük bir anlaşma gerektirir . Fare suşlarının knock out kütüphaneleri (Komp, EUCOMM, NorCOMM) veya büyük ölçekli çabaları ve işbirliği 7 gerektiren mutagenez indüklenen suşları (RIKEN), derlemek için çeşitli projeler başladı. Bu nedenle, ilk önce bir fare modeli ilerleyen önce birincil hücrelerinin bir hücre kültürü modelinde istenen bir genin fenotipi çalışma arzu edilir. Retroviral DNA istikrarlı, tercihen içinde veya transkripsiyon birimleri veya CpG adaları yakınında, konak DNA&#39;sına entegre ve transkripsiyonel susturulması 8 9 kaçınarak faiz paketlenmiş gen ekspresyonu kalıtsal. Genler sonra, transkripsiyon ve protein üretimini yüksek verimlilik, yüksek verimlilik retroviral organizatörü kontrolü altında kopyalanır. Bu nedenle, retroviral ifade transfect için zor hücreleri kullanılan hücrelerin mitoz sırasında aktif bir devlet olabilir. Virüs yapısal genler ambalaj hücre hattı içinde yer olduğundan, ilgi gen klonu için kullanılan ifade vektörler viral revertants olasılığını ortadan kaldırır ve viral süpernatantlar ile çalışma güvenliğini artırır, virüs yapısal genleri içeren bulaşıcı virionlar 10 üretilmektedir. Burada rekombinant retroviral üretim ve dalak B hücreleri sonraki enfeksiyon için bir protokol mevcut. Izolasyondan sonra, kültürlü Th elde edilen lenfokinler ve B hücre çoğalması ve farklılaşması 11 bir patlama neden olur anti-CD40, dalak hücreleri ile uyarılır . Bu protokol, dalak plasmasitik farklılaşma ikna etmek için değil, antijenik stimülasyon önce ilk hematopoetik olaylar aşağıdaki B hücreleri izole olarak, geç B hücre gelişimi ve farklılaşmasında meydana gelen olayların çalışma için idealdir.

Bir gen yapısı ve fonksiyonu analizi verimli bir sistem<em&gt; Ex vivo</em&gt; Dalak B-lenfositleri kültür açıklanmıştır. Bu yöntem, bir yardımcı, ecotrophic ambalaj hücre hattı rekombinant retroviral üretim yararlanır. Kararlı, yüzey antikorların üretimi için önde gelen sınıf anahtarı rekombinasyon geçiren B hücreleri elde edilir birincil lenfositler içinde ilgi çekici bir gen ekspresyonu kalıtsal.

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

Eukaryotik hücrelerde genlerin transgenik ekspresyonu, ilgilenilen bir genin ... kontrolü altında eksprese edildiği güçlü bir ters genetik yaklaşımdır.

Bu prosedürün genel amacı, ilgilenilen bir genin stabil ve kalıtsal olarak ekspresyonunu sağlamaktır. Bu durumda, söz konusu gen sınıf geçiş regülatörü AID'dir; bu genin eksik olduğu farelerin primer B lenfositlerinden, dalak B hücreleri toplanır, saflaştırılır ve anti-CD 40 ve IL-4 kullanılarak aktive edilir. Geni içeren viral partikülleri üretmek için AID'i kodlayan bir yapı, bir paketleme hücre hattına transfekte edilir. Ardından, önceden aktive edilmiş B hücreleri, paketleme hücreleri tarafından üretilen rekombinant retrovirüs ile enfekte edilir.Hücreler daha sonra büyüme, proliferasyon ve aktarılan konstrüktun ekspresyonuna izin vermek için 47 ila 72 saat daha kültüre edilir. Son olarak, hücreler boyanır ve sınıf değiştirme yüzey antikorlarının varlığı açısından akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu tekniğin fare modelleme gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, dikkatli steril teknikler kullanılarak, ilgi duyulan bir genin yapı ve fonksiyon analizine yönelik verimli bir sistem sağlarken, çok daha az finansal ve teknik kaynak gerektirmesidir.Üç ila altı aylık ID eksikliği olan farelerin dalaklarını hasat edin, tüm dalaklar toplanana kadar organları buz üzerinde %15 FBS iç

recombinant-retroviral-production-and-infection-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Bu teknik, bir insan onkogen kodlama çoğaltma kusurlu retroviral stokları hazırlamak için etkin bir şekilde gösteriyor ve daha sonra fare modeli myeloproliferatif hastalığı indüksiyonu için kullanılır.

293T hücreleri geçici Transfeksiyon Çoğaltma-Arızalı Retrovirus Üretimi

Böcek hücreleri hazırlamak ve onları mCD1d tetramers üreten rekombinant mCD1d proteinand üretimi amacı bakülovirüs ile enfekte Bir Yöntem.

Rekombinant mCD1d Böcek Hücrelerde Protein Üretimi İçin Bir Yöntem.

Üretimi için hızlı, basit ve maliyet-etkin bir protokol, CMV, İlan EBV enfeksiyonları yakalanma riski altında allojeneik hematopoietik kök hücre nakli (HSCT) alıcıları infüzyon için donör kaynaklı multivirus spesifik CTL (rCTL). Bu üretim sürecine GMP uyumlu ve T-hücre immünoterapi uzmanlaşmış merkezlerde ötesinde daha geniş bir şekilde uygulanmasını sağlamak olmalıdır.

Multivirus-spesifik T hücrelerinin üretilmesi Allojenik Hematopoetik Kök Hücre Nakli sonra Viral Enfeksiyonlar önleme / tedavi etmek için

Kaynak: Zjablovskaja, P., et al., Proliferation and Differentiation of Murine Myeloid Precursor 32D/G-CSF-R Cells. J. Vis. Exp. (2018)Bu video, hedef hücrelere genetik modifikasyon, fonksiyonel analizler veya soy farklılaşma çalışmaları gibi sonraki uygulamalar için stabil gen aktarımını mümkün kılan, insan böbreği türevli paketleme hücrelerinin transfekte edilmesi yoluyla rekombinant retroviral partiküllerin üretimini göstermektedir.

Gen Transferi için Retroviral Partikül Üretimi

Enfekte hücrelerin genomik DNA'sından retroviral entegrasyon bölgelerini amplifiye etmek, amplifiye edilmiş virüs-konak bağlantılarını dizilemek ve daha sonra bu dizileri bir referans genoma eşlemek için bir protokol açıklıyoruz. Ayrıca, BEDTools kullanarak çeşitli genomik açıklamalara göre entegrasyon bölgelerinin dağılımını ölçmek için teknikler de açıklıyoruz.

Retroviral Entegrasyon Siteleri Amplifikasyon, Yeni Nesil Sıralama ve Genomik DNA Haritalama

Bu yazıda, mevcut bir TCR'nin TCRα ya TCRβ eşleştirme periferal T hücresi reseptör repertuvarının tamamlayıcı hemichain ile, ilgi konusu antijen spesifikliğini sahip antijen-spesifik T hücre reseptörleri (TCR'ler) oluşturmak için yeni bir metot açıklamaktadır. De novo oluşturulan TCRler afiniteye değişen antijen spesifikliğini muhafaza eder.

Yaratma<em&gt; De Novo</em&gt; Merkezli Hemichain retroviral transdüksiyonu ile antijen-özel insan T hücre reseptörleri

Bir çok deney sistemleri, bir immün yanıt olarak T hücresi gelişimini ve fonksiyonunu düzenlemek mekanizmaları anlamak için kullanılmıştır. İşte retroviral transdüksiyon kullanarak genetik yaklaşım düzenleyici yolları belirlenmesinde, ekonomik zaman verimli ve en önemlisi, son derece bilgilendirici olan tarif edilmektedir.

Eğitim için bir genetik Yaklaşım olarak yardımcı T hücrelerinin retroviral İletimi Mekanizmaları kendi Farklılaşma ve Kontrol Fonksiyonunun

Bu makalede, biz fare kemik iliğinde floresan füzyon proteinlerin ifade için detaylı bir protokol dendritik hücreleri ve makrofajlar elde sağlar. Bu yöntem dayanır kemik iliği iletim üzerinde ataları ile retroviral yapıları farklılaşma içine makrofajlar tarafından izlenen ve dendritik hücreleri vitro.

Kemik iliği türevi fare dendritik hücreleri ve makrofajlar floresan Fusion proteinlerin ifade

Hücre etkinliğinin infüzyon çalışmaları için yeterli sayıda ilgi genlerinin mükemmel bir şekilde ifade edilen hücreleri veren rhesus makak periferik kan mononükleer hücrelerinin transdüksiyonu ve genişlemesi için 9 günlük bir protokol özetliyoruz.

Merkezi Bellek Fenotip Bakımı ile Dokuz Günde Primer T Hücrelerinin Transdüksiyonu ve Genişlemesi

Burada in vivo B-1a hücre göçve lokalizasyonu incelemek için retroviral aşırı ekspresyon ve murine B-1a hücrelerinin benimsenen transferi için bir yöntem açıklıyoruz. Bu protokol, donör B-1a hücre lokalizasyonunun niceliği veya donör hücre kaynaklı salgılanan faktörlerin benimsenme sonrası salgılanan faktörlerin analizi de dahil olmak üzere çeşitli downstream fonksiyonel tahliller için uzatılabilir.

Murine B-1a Hücrelerinde CXCR4'ün Retroviral Aşırı Ekspresyonu ve Hedeflenen B-1a Hücre Nakliiçin Kemik İliği ve IgM Üretimine Geçişinde Benimsenmiş Transfer

Öğrenin, fare dalak B lenfositlerinde rekombinant retroviral üretim ve enfeksiyon kullanarak AID geninin stabil kalıtsal ifadesini nasıl sağlayacağınızı. Bu yöntem, gen yapı ve fonksiyon analizleri için maliyet etkin bir alternatif sunar.

B Hücreleri Rekombinant Retroviral Üretim ve Enfeksiyon

Daha fazla video keşfet