Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

Bu prosedürün genel amacı, Deselülize karaciğer matrisi kullanarak selülize karaciğer greftleri hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle bir donör karaciğerin kanüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından organ, bir dizi deterjan çözeltisi ile perfüzyon yapılarak deselülize edilir.

Ardından, yetişkin primer hepatositlerin perfüzyonla yerleştirilmesi yoluyla deselülerize karaciğer matrisinin revaskülarizasyonu gerçekleştirilir. Son olarak, hücresel yapılı karaciğer greftini kültürlemek için in vitro bir perfüzyon sistemi kullanılır. Nihayetinde, perfüzyon ortamındaki albümin, üre ve toplam safra asidi sekresyonunun ölçümü aracılığıyla, yeniden boyutlandırılmış greftlerin in vitro hepatik fonksiyonlarını gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu tekniğin, sentetik biyomalzemeler kullanılarak yapılan iskele üretimi ve geleneksel doku mühendisliği teknikleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kanaatimce, dokuya özgü hücre dışı matriks kompozisyonunun mevcut olmasıdır. Perfüzyonla deselülarize edilmiş iskele, aynı zamanda vasküler yapı gibi dokuya özgü mikro mimariye de sahiptir. Vasküler yapının varlığı, hücrelerin iskeleye daha homojen bir şekilde yeniden yerleştirilmesine olanak tanır.

Ayrıca, hücre sağkalımını artırmak için nutrientlarla homojen şekilde perfüzyon yapmamıza olanak tanır. Protokolün yavaşlatma kısmı, laboratuvarımızdaki doktora sonrası araştırmacı Nima tarafından gösterilecektir. Rekristalizasyon kısmı ise yine bir doktora sonrası araştırmacı olan Gabriel Price tarafından gösterilecektir.

Çalışmaları, bu greftlerin endüstriyelleştirilmesine odaklanmaktadır. Perfüzyon deselülarizasyonunu gerçekleştirmek için, portal ven kanülasyonu ile bir sıçan karaciğerini hasat ederek başlayın. 18 gauge kateter kullanarak, inferior ve superior vena cava'yı açık bırakın. Organı, 10 santimetrelik bir petri kabı içerisinde fosfat tamponlu salin veya PBS ile nemli tutun.

Ardından, sekiz litrelik bir rezervuar, peristaltik pompa ve hava kabarcığı tutucudan oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. Perfüzyon sistemini fosfat tamponlu salin veya PBS ile doldurun ve 10 dakika boyunca çalıştırın. Daha sonra, 10 santimetrelik bir Petri kabını PBS ile doldurun ve tampon akış hızını dakikada 1,2 mililitreye düşürün.

Hasat edilen karaciğeri dikkatlice PBS içeren Petri kabına aktarın ve gece boyunca perfüzyona bırakın. Ertesi gün, karaciğeri distile su içinde %0,01 sodyum dodesil sülfat (SDS) ile beş dakika boyunca perfüze edin.

Ardından bir saat boyunca tekrar PBS'ye geçin. SDS ve PBS perfüzyon adımlarını, SDS perfüzyon süresini 10, 15 ve son olarak 20 dakikaya çıkararak üç kez daha tekrarlayın. Daha sonra karaciğeri şu serile perfüze edin: 24 saat boyunca %0,01 SDS.

24 saat boyunca %0.1 SDS. Üç saat boyunca %0.2 SDS, üç saat boyunca %0.5 SDS. 15 dakika boyunca distile su, bağlı nükleik asitlerin uzaklaştırılması için distile su içinde 30 dakika boyunca %1 Triton X 100.

Ve son olarak, perfüzyon tamamlandıktan sonra istenirse deselülerize karaciğer matrisini veya DLM'yi yıkamak için iki saat boyunca PBS uygulanır; orta lob hariç tüm loblar rezeke edilir. DLM'yi, kullanıma hazır olana kadar temiz ve kapalı bir Petri kabında, 4 °C'de PBS içinde saklayın. DLM'yi sterilize etmek için, 0,1% perasetik asit ve 4% etanol içeren steril PBS ile yıkayın ve 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.

Ardından, DLM'yi iki kez steril PBS ile yıkayın. Daha sonra %2 penisilin streptomisin (10 µg/mL) ve 2,5 µg/mL amfoterisin B içeren PBS ile yıkayın. Deselülerize karaciğeri, hücreleme deneyleri için hazır olana kadar aynı çözeltide 4 °C'de saklayın.

İkinci olarak, deselülarize edilmiş bir karaciğer matrisini doku kültürü önlemi altında hücrelendirmek için şu adımları izleyin. Karaciğerin deselülarizasyonu için kullanılan sisteme benzer bir perfüzyon sistemi ile başlayın. Perfüzyon sistemini; yüksek glukozlu DMEM, %10 fetal bovine serum, mililitre başına 100 ünite penisilin ve mililitre başına 100 mikrogram Streptomisin içeren 200 mililitre kültür ortamı ile doldurun.

DLM'yi perfüzyon odasına yerleştirin ve pompa dakikada beş mililitre hızda çalışırken portal ven kanülü aracılığıyla perfüzyon sistemine bağlayın. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, medyumun DLM'yi 30 dakika boyunca perfüze etmesine izin verin. Ardından, perfüzyon sistemindeki akışı durdurun ve yetişkin bir sıçandan izole edilmiş 50 milyon hepatositi hava kabarcığı tutucu (bubble trap) üzerinden perfüzyon sistemine yavaşça enjekte edin.

Akışı dakikada 10 mililitre hızında yeniden başlatın ve besiyerini 10 dakika boyunca resirküle edin. Besiyeri akışını tekrar durdurun. Ek olarak 50 milyon hepatosit enjekte edin.

Ardından akışı tekrar dakikada 10 mililitre hızında başlatın. Bu prosedürü, DLM'ye toplam 200 milyon hepatosit girene kadar tekrarlayın. Tüm hücreler DLM'ye enjekte edildikten sonra, bol miktardaki effluent'ı 50 mililitrelik santrifüj tüplerine toplayın ve beş dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjleyin.

Süpernatantları atın ve peletleri tek bir tüpte birleştirin. Tripan mavisi dışlama yöntemi ile hücre sayısını ve canlılığını belirleyin. Kültüre ekim verimliliğini saptayın.

Hücreselleştirilmiş bir karaciğer grefti. Oksijenatör içeren steril bir perfüzyon sistemi kurun. Perfüzyon sistemini, %5 PBS ve mililitre başına 0,5 ünite insülin içeren Williams E gibi 50 mililitre kültür ortamı ile doldurun.

mL başına 20 nanogram EGF, mL başına 14 nanogram glukagon, mL başına 7,5 mikrogram hidrokortizon, mL başına 100 ünite penisilin ve mL başına 100 mikrogram streptomisin. Pompa dakikada beş mililitre hızda çalışırken, hücreselleştirilmiş karaciğer greftini perfüzyon odasına yerleştirin ve portal ven kanülü aracılığıyla perfüzyon sistemine bağlayın.

Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, perfüzyon odasını aseptik olarak kapatın ve kültürleme sırasında herhangi bir sızıntıyı önlemek için sıkıca mühürleyin. Perfüzyon sistemini 37 °C'de %10 karbon dioksit ile inkübe edin ve perfüzyon akış hızını 15 mL/dakika'ya çıkarın. Oksijenatörü %95 oksijen ve %5 karbon dioksit içeren bir gaz karışımı tankına bağlayın ve gaz akış hızını 0,5 L/dakika olarak ayarlayın.

Bu işlemle yaklaşık 400 milimetre cıva oksijen kısmi basıncına ulaşılmalıdır. Kültür ortamını günlük olarak yenileyerek kültürü 10 güne kadar sürdürün. Kültür dönemi sonunda greftin karaciğer fonksiyonlarını izlemek için ortamdan günlük olarak albümin, üre ve toplam safra asidi sekresyonu örnekleri alın.

Moleküler ve histolojik analiz için hücresizleştirilmiş karaciğer greftinden örnek alın. Bir sıçan karaciğerinin tamamen hücresizleştirilmesi, açıklanan protokol kullanılarak yaklaşık 72 saat sürer.

Elde edilen matriks, doğal karaciğerdeki fibriler kolajenin %100'ünü, gliko amino glikanların %50'sini ve DNA'nın yalnızca %5'ini korumaktadır. Matriksin vasküler yapısının korunduğu, korozyon dökümü ve taramalı elektron mikroskobu analizi ile kanıtlanmıştır. DLM içindeki vasküler mikroarkitektürün varlığı, %96 verimlilikle hücrelerle yeniden popüle edilmesini ve ardından perfüzyonunu kolaylaştırır.

In vitro kültür için, fare karaciğer grefti in vitro ortamda 10 güne kadar kültüre edilebilir ve albumin, üre ve toplam safra asidi salınımı ile doğrulandığı üzere uygun karaciğer fonksiyonları sergiler. Bu videoyu izledikten sonra, tüm karaciğerin nasıl desellülarize edileceği ve resellülarize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.