Name: Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Keşfedin tam karaciğer dehüllerizasyon ve rehüllerizasyon tekniklerini rejeneratif tıp için. Bu yöntem, hepatositlerle yeniden doldurulmuş fonksiyonel karaciğer greftleri oluşturmayı amaçlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, in vitro perfüzyon odasında tasarımı için Jack Milwid teşekkür etmek istiyorum . Bu çalışma, KU, ABD NSF CBET KU ve BEU Çocuklar için Shriners Hastaneler-0853569 MY, R00DK080942 R01DK59766 ve R01DK084053 ABD NIH, hibe (hibe hiçbir 8503) tarafından desteklenmiştir. Biz de destek ve Çocuklar için Shriners Hastaneler kabul etmiş sayılırsınız.

1. Karaciğer Decellularization <ol><li> Portal ven kanülasyonu ve 18-gauge kateter ile sıçan karaciğer Hasat. Inferior ve superior vena kava açık bırakın. Organ sulu tutun fosfat tamponlu salin (PBS) 10 cm'lik petri. </li><li> 8-litrelik rezervuar, peristaltik pompa ve bir baloncuk kapanı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. </li><li> Perfüzyon sistemi doldurun fosfat tamponlu salin ve 10 dakika boyunca çalışmaya devam. 10 cm'lik petri kaplarına PBS doldurun ve fosfat akış hızı 1 ml / dk tamponlu salin azaltmak. </li><li> Dikkatlice hasat karaciğer transferi fosfat tamponlu tuzlu su dolu 10 cm'lik petri. </li><li> Gecede PBS perfüzyon ile devam edin. </li><li> Distile su içinde 5 dakika boyunca% 0,01 (w / v) sodyum dodesil sülfat (SDS) ile perfüzyon başlayın. </li><li> PBS ile 1 saat serpmek. </li><li> Her seferinde 10, 15 ve 20 dakika SDS perfüzyon süresi artan adımları 1.6 ve 1.7 üç kez daha tekrarlayın. </li><li> 24 saat boyunca% 0,01 (w / v) SDS ile perfüzyon devam edin. </li><li> 24 saat boyunca% 0.1 (w / v) SDS ile perfüzyon devam edin. </li><li> 3 saat boyunca% 0.2 (w / v) SDS serpmek. </li><li> 3 saat boyunca% 0.5 (w / v) SDS serpmek. </li><li> Distile su ile 15 dakika boyunca serpmek. </li><li> % 1 (w / v) distile su ile Triton X-100 ile bağlı herhangi bir nükleik asitlerin kaldırmak için 30 dakika boyunca serpmek. </li><li> Decellularized karaciğer matrisi (DLM), 2 saat süreyle PBS ile serpmek yıkayın. </li><li> İsteğe bağlı: median lob dışında bütün lobları rezeke. </li><li> Kullanmak için hazır (Şekil 1) kadar 4 o C'de PBS batırılmış temiz ve mühürlü bir Petri kabındaki DLM saklayın . </li><li> DLM sterilize etmek için: 1) steril PBS 4 o C'de% 0.1 (v / v) perasetik asit ve% 4 (v / v) etanol ve 3 saat inkübe içeren DLM yıkayın 2) steril PBS 2 kez yıkayın. 3)% 2 penisilin-streptomisin, 10ug / ml gentamisin ve 2.5 ug / ml amfoterisin B Store recellularization deneyler için kullanmaya hazır olana kadar 4 o C'de aynı çözüm decellularized karaciğer içeren steril PBS ile yıkayın. </li></ol> 2. Decellularized Karaciğer Matrix, Recellularization <ol><li> Perfüzyon odası, peristaltik pompa ve steril koşullar altında bir baloncuk tuzağı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. 200 ml kültür ortamı, örneğin, yüksek glukoz DMEM (Sigma),% 10 fetal sığır serumu (Hyclone), 100 U mL -1 penisilin ve 100 mg ml -1 streptomisin (Invitrogen) ile perfüzyon sistemi doldurun. </li><li> Perfüzyon odasında decellularized karaciğer matris yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için 5 ml / dak pompa çalışırken portal ven kanül aracılığı ile perfüzyon sistemine DLM bağlamak. </li><li> 30 dakika boyunca DLM yoluyla orta perfüzyon izin verin. </li><li> En az% 90 canlılığı ile yetişkin bir fare primer hepatositlerde izole edin. </li><li> Perfüzyon sistemi akışını durdurun ve perfüzyon sistemine yavaş yavaş balonu tuzak üzerinden 50 milyon hepatositler (1-3 ml kültür ortamı) enjekte edilir. </li><li> 10 ml / dk akış başlayın ve 10 dakika boyunca orta sirküle. </li><li> DLM (Şekil 2) 6 olmak üzere toplam 200 milyon hücre içine tanıtıldı kadar 2.5 ve 2.6 adımları tekrarlayın. </li><li> Bir kez tüm hücreleri DLM perfüze olan, 10 dakika boyunca 600 rpm'de dört adet 50-ml santrifüj tüplerine ve santrifüj perfüzat toplamak. Süpernatantlar atın ve tek bir tüp içine pelet toplamak. Tohumlama verimliliği belirlemek tripan mavi dışlama yoluyla hücreler ve canlılığı sayısını belirler. </li></ol> 3 Recellularized Karaciğer Greft Vitro Kültür <ol><li> Perfüzyon odası, steril koşullar altında (Şekil 3) peristaltik pompa, oksijenatör ve bir baloncuk kapanı oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. 50 ml kültür ortamı ile perfüzyon sistemi doldurun, örneğin, Williams 'E (Sigma),% 5 fetal sığır serumu (Hyclone), 0.5 U mL -1 insülin (Eli Lilly), 20 ng mL-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng ml -1 glukagon (Bedford Laboratories), 7.5 mg mL -1 hidrokortizon (Pharmacia), 100 U mL -1 penisilin, ve 100 mg mL -1 streptomisin (Invitrogen). </li><li> Perfüzyon odasında recellularized karaciğer greft yerleştirin ve herhangi bir hava kabarcığı oluşumunu önlemek için 5 ml / dak pompa çalışırken portal ven kanül aracılığı ile perfüzyon sistemine DLM bağlamak. </li><li> Aseptik perfüzyon odasına yakın ve kültür sırasında herhangi bir sızıntıyı önlemek için sıkı bir şekilde yapışması. </li><li> 37 o C ve% 10 CO bir kuluçka perfüzyon sistemi Transfer 2 ve 15 ml / dak perfüzyon akım hızı artırmak. </li><li> % 95 O 2 ve% 5 CO 2 gaz karışımı tankı oksijenatör bağlayın ve gaz debisi 0.5 litre / dakikaya kadar ayarlayabilirsiniz. Bu approxima bir oksijen kısmi basıncı eldetely 400 mmHg. </li><li> Kültür, kültür ortamı günlük değişiklikler ile 10 gün kadar devam edebilir. Kültür ortamı, albümin, üre ve toplam safra asit salgılanması gibi greft, karaciğer fonksiyonlarının izlenmesi için günlük numune olabilir. Recellularized karaciğer greft kültür dönemi sonunda, moleküler ve histolojik analiz için numune olabilir. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Sıçan karaciğer decellularization açıklanan protokolünü kullanarak yaklaşık 72 saat sürer. Ortaya çıkan matris,% 100, fibriler kollajen glikozaminoglikanlar% 50 ve sadece% 5 yerli karaciğer DNA (Tablo 1) 6 korur . Matrisin vasküler yapı korozyona döküm ve taramalı elektron mikroskobu analizi (Şekil 4) 6 kanıtladığı gibi korunur. DLM içinde vasküler mikromimarisinin varlığı,% 96 verimlilik ve in vitro kültür için bir sonraki perfüzyon hücreleri ile repopulation kolaylaştırır. Recellularized karaciğer greft in vitro olarak 10 gün kadar kültürlü ve albümin, üre ve toplam safra asit salgılanması (Şekil 5) 6 üzerinden teyit uygun karaciğer fonksiyonları görüntüler olabilir. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 decellularization süreç sonunda karaciğer matris Decellularized. (A) tüm karaciğer rezeksiyonu sonrası (b), medyan lobu. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 DLM recellularization şematik. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 recellularized karaciğer greft in vitro kültürü Perfüzyon sistem kurulumu. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4 mikrovasküler yapıyı decellularized karaciğer matris korunur. A) normal karaciğer b) decellularized karaciğer, portal (kırmızı) ve venöz (mavi) damarsal Korozyon döküm görüntüler. Tarama elektron mikroskobu görüntüleri DLM c) Bir gemi, d) safra kanalı gibi küçük damarlarda (oklar), Ölçek çubukları (a, b) 5 mm (c, d) 20 mikron bir bölüm. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5 in vitro perfüzyon kültür sırasında recellularized karaciğer greft Karaciğer özel fonksiyonlar . a) albümin sekresyon (p = 0,5249), b) üre üretimi (p = 0,5271) ve c) toplam safra asit salgılanması (p = 0,0114). A = 0.01 Friedman testi ile 10 gün kültür dönemi boyunca deney ve kontrol arasındaki fark istatistiksel analizi yapıldı. Hata çubukları sem (n = 3) temsil eder. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Taze livera </td><td> Decellularized karaciğer matris </td><td rowspan="2"> p-değerleri </td><td rowspan="2"> % Taze karaciğer </td></tr><tr><td></td><td> n = 4 </td><td> n = 8 </td></tr><tr><td> Kollajen </td><td rowspan="2"> 0.07 ± 0.01 </td><td rowspan="2"> 0.08 ± 0.03 </td><td rowspan="2"> 0,56 </td><td rowspan="2"> % 114 </td></tr><tr><td> (G karaciğer mg) </td></tr><tr><td> Glikozaminoglikanlar </td><td rowspan="2"> 73.1 ± 6.7 </td><td rowspan="2"> 34.2 ± 2.9 </td><td rowspan="2"> 0,004 </td><td rowspan="2"> % 47 </td></tr><tr><td> (G karaciğer mg) </td></tr><tr><td> DNA </td><td rowspan="2"> 14.9 ± 5.6 </td><td rowspan="2"> 0.44 ± 0.08 </td><td rowspan="2"> 3.3 10 -5 </td><td rowspan="2"> % 2.9 </td></tr><tr><td> (G karaciğer mg) </td></tr></tbody></table> (Tablo 1). Decellularized karaciğer matris biyokimyasal bileşimi yerli karaciğer göre. Değerler ortalama ± sem olarak temsil edilir

<ol><li>Kulig, K. M., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepatic tissue engineering.</a> Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+native+and+engineered+arterial+scaffolds+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation.</a> Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+a+vascularized+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Engraftment of a vascularized human skin equivalent.</a> FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. , (2010).</li>
</ol>

Burada açıklanan perfüzyon decellularization yöntemi aynı brüt yapısı ve yerli karaciğer vasküler mikromimarisini bir bütün karaciğer iskele üretir. Iskele yerli karaciğer benzer bir ekstrasellüler matriks kompozisyonu vardır. Recellularization yöntemi, yüksek verimliliği ve hücrelerin hücreleri in vitro kültür dönemde test sırasında uygulanabilir ve işlevsel kalır iskele repopulation ulaşır . Recellularized karaciğer dokusuna nonparenchymal hücrelerinin yanı sıra, biz recellularized karaciğer greft, i...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=2394">Decellularization and Recellularization of Whole Livers</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.

Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers

<table><tbody><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Dijital Sürücü</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>Masterflex L/S Standart pompa başlığı</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW- 07013-81</td><td></td></tr><tr><td>Hava kabarcığı tutucu</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr></tbody></table>

tüm karaciğerleri decellularization ve recellularization

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

Karaciğer, 1 hayatta kalmak için besin ve oksijen ve atıkların uzaklaştırılması teslimat için sürekli perfüzyon gerektiren karmaşık bir organdır . , Karaciğer mikroyapı, doku mühendisliği ve imalat teknikleri kullanarak bir yaklaşım gerekçeleri ile birlikte yeniden ya da taklit etmek için çabaları şimdiye kadar bu tasarım sorunu nedeniyle başarılı olamamıştır. Buna ek olarak, karaciğer doku mühendisliği uygulamaları için iskeleler oluşturmak için kullanılan sentetik biyomateryaller uygun hücre fonksiyonlarını 2 neden belirli bir hücre bağlayıcı motifleri eksikliği nedeniyle büyük ölçüde doku rejenerasyonu ve onarım inducing sınırlı kalmıştır. Diğer taraftan Decellularized doğal dokular, kan damarları 3 ve 4 cilt, doku mühendisliği birçok uygulama var ve zorlukların bazı pratik bir çözüm sağladı . Decellularized yerli matris avantajı dolayısıyla hücre eki ve yeniden yapılanma 5 artırılması, bir ölçüde, orijinal kompozisyon ve mikroyapı korumasını. Bu çalışmada biz büyük kan damarlarının yapısını korur sağlam bir karaciğer bioscaffold elde olduğu gibi, karaciğer perfüzyon decellularization, gerçekleştirmek için yöntemler açıklanmaktadır. Ayrıca, in vitro fonksiyonel bir karaciğer grefti yetişkin birincil hepatositler bu bioscaffolds recellularize yöntemleri tarif ve in vivo nakli için gerekli damar erişimi vardır.

Perfüzyon decellularization organ ekstraselüler matriks kompozisyonu ve mikromimarisini korur tüm karaciğer iskeleleri üretmek için yeni bir tekniktir. Burada, hepatositler ile perfüzyon decellularization ve sonraki repopulation kullanarak tüm organı iskeleleri hazırlama yöntemi açıklanmıştır. Fonksiyonel ve transplante karaciğer greft tekniği kullanılarak oluşturulabilir.

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

Karaciğer, hayatta kalabilmek için besinlerin ve oksijenin iletimi ile atıkların uzaklaştırılması amacıyla sürekli perfüzyon gerektiren karmaşık bir organdır1. ... için yapılan çalışmalar...

Bu prosedürün genel amacı, Deselülize karaciğer matrisi kullanarak selülize karaciğer greftleri hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle bir donör karaciğerin kanüle edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından organ, bir dizi deterjan çözeltisi ile perfüzyon yapılarak deselülize edilir.Ardından, yetişkin primer hepatositlerin perfüzyonla yerleştirilmesi yoluyla deselülerize karaciğer matrisinin revaskülarizasyonu gerçekleştirilir. Son olarak, hücresel yapılı karaciğer greftini kültürlemek için in vitro bir perfüzyon sistemi kullanılır. Nihayetinde, perfüzyon ortamındaki albümin, üre ve toplam safra asidi sekresyonunun ölçümü aracılığıyla, yeniden boyutlandırılmış greftlerin in vitro hepatik fonksiyonlarını gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin, sentetik biyomalzemeler kullanılarak yapılan iskele üretimi ve geleneksel doku mühendisliği teknikleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kanaatimce, dokuya özgü hücre dışı matriks kompozisyonunun mevcut olmasıdır. Perfüzyonla deselülarize edilmiş iskele, aynı zamanda vasküler yapı gibi dokuya özgü mikro mimariye de sahiptir. Vasküler yapının varlığı, hücrelerin iskeleye daha homojen bir şekilde yeniden yerleştirilmesine olanak tanır.Ayrıca, hücre sağkalımını artırmak için nutrientlarla homojen şekilde perfüzyon yapmamıza olanak tanır. Protokolün yavaşlatma kısmı, laboratuvarımızdaki doktora sonrası araştırmacı Nima tarafından gösterilecektir. Rekristalizasyon kısmı ise yine bir doktora sonrası araştırmacı olan Gabriel Price tarafından gösterilecektir.Çalışmaları, bu greftlerin endüstriyelleştirilmesine odaklanmaktadır. Perfüzyon deselülarizasyonunu gerçekleştirmek için, portal ven kanülasyonu ile bir sıçan karaciğerini hasat ederek başlayın. 18 gauge kateter kullanarak, inferior ve superior vena cava'yı açık bırakın. Organı, 10 santimetrelik bir petri kabı içerisinde fosfat tamponlu salin veya PBS ile nemli tutun.Ardından, sekiz litrelik bir rezervuar, peristaltik pompa ve hava kabarcığı tutucudan oluşan bir perfüzyon sistemi kurun. Perfüzyon sistemini fosfat tamponlu salin veya PBS ile doldurun ve 10 dakika boyunca çalıştırın. Daha sonra, 10 santimetrelik bir Petri kabını PBS ile doldurun ve tampon akış hızını dakikada 1,2 mililitreye düşürün.Hasat edilen karaciğeri dikkatlice PBS içeren Petri kabına aktarın ve gece boyunca perfüzyona bırakın. Ertesi gün, karaciğeri distile su içinde %0,01 sodyum dodesil sülfat (SDS) ile beş dakika boyunca perfüze edin.Ardından bir saat boyunca tekrar PBS'ye geçin. SDS ve PBS perfüzyon adımlarını, SDS perfüzyon süresini 10, 15 ve son olarak 20 dakikaya çıkararak üç kez daha tekrarlayın. Daha sonra karaciğeri şu serile perfüze edin: 24 saat boyunca %0,01 SDS.24 saat boyunca %0.1 SDS. Üç saat boyunca %0.2 SDS, üç saat boyunca %0.5 SDS. 15 dakika boyunca distile su, bağlı nükleik asitlerin uzaklaştırılması için distile su içinde 30 dakika boyunca %1 Triton X 100.Ve son olarak, perfüzyon tamamlandıktan sonra istenirse deselülerize karaciğer matrisini veya DLM'yi yıkamak için iki saat boyunca PBS uygulanır; orta lob hariç tüm loblar rezeke edilir. DLM'yi, kullanıma hazır olana kadar temiz ve kapalı bir Petri kabında, 4 °C'de PBS içinde saklayın. DLM'yi sterilize etmek için, 0,1% perasetik asit ve 4% etanol içeren steril PBS ile yıkayın ve 4 °C'de üç saat boyunca inkübe edin.Ardından, DLM'yi iki kez steril PBS ile yıkayın. Daha sonra %2 penisilin streptomisin (10 µg/mL) ve 2,5 µg/mL amfoterisin B içeren PBS ile yıkayın. Deselülerize karaciğeri, hücreleme deneyleri için hazır olana kadar aynı çözeltide 4 °C'de saklayın.İkinci olarak, deselülarize edilmiş bir karaciğer matrisini doku kültürü önlemi altında hücrelendirmek için şu adımları izleyin. Karaciğerin deselülarizasyonu için kullanılan sisteme benzer bir perfüzyon sistemi ile başlayın. Perfüzyon sistemini; yüksek glukozlu DMEM, %10 fetal bovine serum, mililitre başına 100 ünite penisilin ve mililitre başına 100 mikrogram Streptomisin içeren 200 mililitre kültür ortamı ile doldurun.DLM'yi perfüzyon odasına yerleştirin ve pompa dakikada beş mililitre hızda çalışırken portal ven kanülü aracılığıyla perfüzyon sistemine bağlayın. Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, medyumun DLM'yi 30 dakika boyunca perfüze etmesine izin verin. Ardından, perfüzyon sistemindeki akışı durdurun ve yetişkin bir sıçandan izole edilmiş 50 milyon hepatositi hava kabarcığı tutucu (bubble trap) üzerinden perfüzyon sistemine yavaşça enjekte edin.Akışı dakikada 10 mililitre hızında yeniden başlatın ve besiyerini 10 dakika boyunca resirküle edin. Besiyeri akışını tekrar durdurun. Ek olarak 50 milyon hepatosit enjekte edin.Ardından akışı tekrar dakikada 10 mililitre hızında başlatın. Bu prosedürü, DLM'ye toplam 200 milyon hepatosit girene kadar tekrarlayın. Tüm hücreler DLM'ye enjekte edildikten sonra, bol miktardaki effluent'ı 50 mililitrelik santrifüj tüplerine toplayın ve beş dakika boyunca 800 RPM'de santrifüjleyin.Süpernatantları atın ve peletleri tek bir tüpte birleştirin. Tripan mavisi dışlama yöntemi ile hücre sayısını ve canlılığını belirleyin. Kültüre ekim verimliliğini saptayın.Hücreselleştirilmiş bir karaciğer grefti. Oksijenatör içeren steril bir perfüzyon sistemi kurun. Perfüzyon sistemini, %5 PBS ve mililitre başına 0,5 ünite insülin içeren Williams E gibi 50 mililitre kültür ortamı ile doldurun.mL başına 20 nanogram EGF, mL başına 14 nanogram glukagon, mL başına 7,5 mikrogram hidrokortizon, mL başına 100 ünite penisilin ve mL başına 100 mikrogram streptomisin. Pompa dakikada beş mililitre hızda çalışırken, hücreselleştirilmiş karaciğer greftini perfüzyon odasına yerleştirin ve portal ven kanülü aracılığıyla perfüzyon sistemine bağlayın.Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için, perfüzyon odasını aseptik olarak kapatın ve kültürleme sırasında herhangi bir sızıntıyı önlemek için sıkıca mühürleyin. Perfüzyon sistemini 37 °C'de %10 karbon dioksit ile inkübe edin ve perfüzyon akış hızını 15 mL/dakika'ya çıkarın. Oksijenatörü %95 oksijen ve %5 karbon dioksit içeren bir gaz karışımı tankına bağlayın ve gaz akış hızını 0,5 L/dakika olarak ayarlayın.Bu işlemle yaklaşık 400 milimetre cıva oksijen kısmi basıncına ulaşılmalıdır. Kültür ortamını günlük olarak yenileyerek kültürü 10 güne kadar sürdürün. Kültür dönemi sonunda greftin karaciğer fonksiyonlarını izlemek için ortamdan günlük olarak albümin, üre ve toplam safra asidi sekresyonu örnekleri alın.Moleküler ve histolojik analiz için hücresizleştirilmiş karaciğer greftinden örnek alın. Bir sıçan karaciğerinin tamamen hücresizleştirilmesi, açıklanan protokol kullanılarak yaklaşık 72 saat sürer.Elde edilen matriks, doğal karaciğerdeki fibriler kolajenin %100'ünü, gliko amino glikanların %50'sini ve DNA'nın yalnızca %5'ini korumaktadır. Matriksin vasküler yapısının korunduğu, korozyon dökümü ve taramalı elektron mikroskobu analizi ile kanıtlanmıştır. DLM içindeki vasküler mikroarkitektürün varlığı, %96 verimlilikle hücrelerle yeniden popüle edilmesini ve ardından perfüzyonunu kolaylaştırır.In vitro kültür için, fare karaciğer grefti in vitro ortamda 10 güne kadar kültüre edilebilir ve albumin, üre ve toplam safra asidi salınımı ile doğrulandığı üzere uygun karaciğer fonksiyonları sergiler. Bu videoyu izledikten sonra, tüm karaciğerin nasıl desellülarize edileceği ve resellülarize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

decellularization-and-recellularization-of-whole-livers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

Hızla ve tamamen retrograd perfüzyon yoluyla sağlam bir domuz kalbinden hücresel bileşenleri kaldırmak için bir yöntem tarif edilmiştir. Bu yöntem, çoklu klinik uygulamalarda kullanım için potansiyele sahip bir site spesifik kardiyak ekstraselüler matriks iskele verir.

Retrograd Koroner Perfüzyon tarafından Domuz Kalp Decellularization Prosedürü

Makalede, sıçan bağırsaktan bir hücresel olmayan matrisinin üretimi için bir yöntem anlatılmaktadır. Bağırsak iskelelerinin türetme hücre biyolojisi ve uyuşturucu testi kök, doku mühendisliği gelecekteki uygulamalar için önemlidir.

Doğal Aselüler Bağırsak Matrix&#39;in üretimi için bir Decellularization Metodoloji

Tüm organ hücresizleştirme, rejeneratif tıp için kullanılabilecek doğal biyolojik iskeleler üretir. Tüm akciğerlerin hücrelerden arındırıldığı ve daha sonra vasküler dolaşımı ve sıvı ortam ventilasyonunu kolaylaştıran bir biyoreaktörde yetişkin kök hücreler ve endotel hücreleri ile tohumlandığı insan dışı bir primat akciğer rejenerasyonu modelinin tanımı sunulmaktadır.

Özel Bir Büyük Organ Biyoreaktörü Kullanılarak İnsan Dışı Primat Akciğerinin Hücreden Arındırılması ve Yeniden Hücreselleştirilmesi

Tescilli cihazımızı kullanarak karaciğer toplama, kanülasyon ve perfüzyon için sunulan teknikler, sıçan karaciğerlerinde hücre giderme ve yeniden hücreselleştirme deneylerini iyileştirmek için karmaşık perfüzyon kurulumlarını mümkün kılar.

Bir Salınım basınçlı perfüzyon Aygıt Sıçan karaciğerinin decellularization Prosedürü

Bu protokol, Sprague Dawley sıçan böbreklerinin, deterjanların vaskülatür yoluyla antegrad perfüzyonu yoluyla hücreden arındırılmasını tanımlar ve insan böbrek epitel hücreleri ile yeniden popülasyon için şablon görevi gören aselüler renal hücre dışı matrisler üretir. Büyümeyi izlemek için resazurin perfüzyon testinin yeniden hücreselleştirilmesi ve kullanımı, özel olarak tasarlanmış perfüzyon biyoreaktörleri içinde gerçekleştirilir.

Epitel Hücre Repopulation ve Böbrek Doku Kalkınma Kemirgen Ekstrasellüler Matriks iskelelerinin hazırlanması

Decellularized bir sıçan karaciğerinin hücreselleştirilmiş hücre dışı matrisi, bir virüsün veya viral vektörün dağılımını ve transgen ekspresyonunu incelemek için insanlaştırılmış, üç boyutlu bir ex vivo model olarak kullanılabilir.

Insan hepatoselüler karsinoma hücre hattı HepG2 ile üç boyutlu Karaciğer modeli yeniden doldurulur Viral Vektörler Study

Burada, deterjanlar ve recellularization tarafından periferik kan ve endotel orta perfüzyon kullanarak safen ven decellularization için bir protokol açıklayın.

Decellularization ve Recellularization metodoloji insan safen damarlar için

Biz daha fazla vivo içinde kısmi karaciğer gelecekte mühendislik eğitimi için bir önkoşul olarak köstebeğiyle vivo içinde tek karaciğer lob perfüzyon modeli için yeni bir cerrahi teknik kurmak.

Sıçan Vivo içinde kısmi karaciğer Dairesi'nde için bir temel olarak yeni bir cerrahi teknik

Bu yöntem, decellularization karmaşık bir solid organ ozmotik şok ve perfüzyon en az organ matris bozulma ile iyonik deterjan dayalı basit bir protokol kullanarak sağlar. Gerçek zamanlı akış dinamiği ve hücresel enkaz çıkış izleme ile basınçlı bir kese içinde insan kalpleri bir roman decellularization tekniği oluşmaktadır.

Decellularization ters yönde bir basınçlı bir kese içinde bütün insan kalp

Bu protokol farelerin kalbini ve akciğerlerini hücreden çıkarmayı amaçlamaktadır. Elde edilen hücre dışı matris (ECM) iskeleleri, bileşenlerinin konumunu ve topolojisini haritalamak için immünostain edilebilir ve görüntülenebilir.

Murine Kardiyopulmoner Kompleksinin Hücreden Arındırılması

Keşfedin tam karaciğer dehüllerizasyon ve rehüllerizasyon tekniklerini rejeneratif tıp için. Bu yöntem, hepatositlerle yeniden doldurulmuş fonksiyonel karaciğer greftleri oluşturmayı amaçlar.

Tüm karaciğerleri Decellularization ve Recellularization

Daha fazla video keşfet