Gram Negatif Bakterilerin İç ve Dış Zar Fraksiyonlarının Ayrılması

Gram negatif bir bakterinin, yapısal bütünlüğü koruyan düşük yoğunluklu bir sükroz içinde asılı kalan iç ve dış zar vezikülleri dahil toplam zar fraksiyonu ile başlayın.

Membran veziküllerini ayırmak için, sırayla bir ultrasantrifüj tüpüne yüksek yoğunluklu ve orta yoğunluklu sükroz çözeltileri ekleyin.

Ardından, süreksiz bir sükroz gradyanı oluşturmak için zar fraksiyonunu ve düşük yoğunluklu sükrozu ekleyin.

Vezikülleri yoğunluklarına göre ayırmak için ultrasantrifüj.

Daha az yoğun iç zar vezikülleri üstte bir tabaka oluşturur.

Lipopolisakkaritler ve proteinler açısından zengin daha yoğun dış zar vezikülleri, orta ve yüksek yoğunluklu sükroz çözeltilerinin arayüzünde bir bant oluşturur.

İç zar tabakasını toplayın ve gradyan çözeltisini atın, küçük bir miktar bırakın.

Ardından dış zar tabakasını toplayın.

Stabilizasyon için her fraksiyona bir depolama tamponu ekleyin.

Vezikülleri ayırmak ve süpernatanı çıkarmak için santrifüjleyin.

Saflaştırılmış membran veziküllerini yeniden süspanse edin, homojenize edin ve daha fazla analiz için düşük sıcaklıklarda saklayın.

Sükroz gradyanını hazırlamak için polipropilen veya Ultra şeffaf bir Üstü Açık tüpü hafif eğimli bir konumda tutun.

Yavaşça iki milil