Bakterilerde İnorganik Polifosfat Miktarının Belirlenmesi için Bir Test
JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:16 dk. • August 29th, 2025
İnorganik polifosfat (poliP), sitoplazmik granüller olarak depolanan, bakteriyel virülans ve stres tepkisinde yer alan doğrusal bir fosfat polimeridir.
PoliP'yi ölçmek için, artan konsantrasyonlarda inorganik fosfat standartlarına sahip çok kuyulu bir plaka alın.
Boş bir kuyuya saflaştırılmış bakteriyel poli P özü ekleyin.
Her oyuğa ekzopolifosfataz enzimi içeren bir reaksiyon tamponu verin ve inkübe edin.
Enzim, poliP'yi serbest inorganik fosfata bölerek onu ölçülebilir bir forma dönüştürür.
Molibdat ve askorbik asit içeren bir tespit reaktifi ekleyin ve inkübe edin.
Molibdat, askorbik asit tarafından mavi renkli komplekslere indirgenen fosfomolibdat kompleksleri oluşturmak için fosfat ile reaksiyona girer.
Renkli kompleksin emilimini ölçün. Ölçülen absorbans, fosfat konsantrasyonu ile doğru orantılı olan mavi renk yoğunluğuna karşılık gelir.
Standart eğriyi oluşturun ve bakterinin orijinal poliP içeriğini yansıtan numunenin fosfat seviyelerini hesaplayın.
50 milimolar pH sekiz tris-hidroklorürde sıfır, beş, 50 veya 200 mikromolar potasyum fosfat içeren standartlar hazırlayarak başlayın.
Her fosfat standardından 100 mikrolitre ve 100 mikrolitre ekstrakte edilmiş poliP numunesini, 96 oyuklu
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin