JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:16 dk. • August 29th, 2025
İnorganik polifosfat (poliP), sitoplazmik granüller olarak depolanan, bakteriyel virülans ve stres tepkisinde yer alan doğrusal bir fosfat polimeridir.
PoliP'yi ölçmek için, artan konsantrasyonlarda inorganik fosfat standartlarına sahip çok kuyulu bir plaka alın.
Boş bir kuyuya saflaştırılmış bakteriyel poli P özü ekleyin.
Her oyuğa ekzopolifosfataz enzimi içeren bir reaksiyon tamponu verin ve inkübe edin.
Enzim, poliP'yi serbest inorganik fosfata bölerek onu ölçülebilir bir forma dönüştürür.
Molibdat ve askorbik asit içeren bir tespit reaktifi ekleyin ve inkübe edin.
Molibdat, askorbik asit tarafından mavi renkli komplekslere indirgenen fosfomolibdat kompleksleri oluşturmak için fosfat ile reaksiyona girer.
Renkli kompleksin emilimini ölçün. Ölçülen absorbans, fosfat konsantrasyonu ile doğru orantılı olan mavi renk yoğunluğuna karşılık gelir.
Standart eğriyi oluşturun ve bakterinin orijinal poliP içeriğini yansıtan numunenin fosfat seviyelerini hesaplayın.
50 milimolar pH sekiz tris-hidroklorürde sıfır, beş, 50 veya 200 mikromolar potasyum fosfat içeren standartlar hazırlayarak başlayın.
Her fosfat standardından 100 mikrolitre ve 100 mikrolitre ekstrakte edilmiş poliP numunesini, 96 oyuklu şeffaf bir plakanın ayrı kuyucuklarına alıkoyun. Numune başına 30 mikrolitre 5X ScPPX reaksiyon tamponu, 19 mikrolitre su ve bir mikrolitre saflaştırılmış ScPPX içeren bir ana karışım hazırlayın. 96 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre ana karışım ekleyin.
Ve 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Tespit gününde, 9.12 mililitre tespit solüsyonu bazında 88 mililitre bir molar askorbik asit ile karıştırarak yeni bir çalışma tespit solüsyonu stoğu hazırlayın ve kullanmadan önce oda sıcaklığına gelmesine izin verin. Her numuneye 50 mikrolitre algılama çözeltisi ekleyin ve 96 oyuklu plakadaki standartları ekleyin.
Renk gelişimine izin vermek için, plakayı oda sıcaklığında yaklaşık iki dakika inkübe edin. 882 nanometrede absorbansı ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın ve potasyum fosfat standart eğrisiyle karşılaştırarak her bir numunenin fosfat konsantrasyonunu hesaplayın. Daha sonra fosfat konsantrasyonlarını her hücre lizatında poliP türevi fosfatın nanomollerine dönüştürün ve hücresel poliP içeriğini, el yazmasında açıklandığı gibi toplam hücresel proteine normalleştirin.