JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:30 dk • August 29th, 2025
Bakteriyel Legionella pneumophila dış zar veziküllerine veya OMV'lere maruz kalan önceden işlenmiş makrofajları içeren çok kuyulu bir plaka ile başlayın.
OMV ile tedavi edilen makrofajları enfekte etmek için tanımlanmış bir bakteri-konak hücre oranında Legionella pneumophila ekleyin.
Kuluçka sırasında, makrofajlar zara bağlı fagozomlar içindeki bakterileri içselleştirir.
OMV ön işlemi, makrofaj sinyalini değiştirerek fagozom olgunlaşmasını engeller.
Bu, bakterileri koruyan ve hücre içi replikasyona izin veren Lejyonella içeren bir vakuol oluşumunu kolaylaştırır.
Bir deterjan ekleyin ve makrofajları parçalamak için inkübe edin. Bu, hücre içi bakterileri ortama salar.
Seyreltilmiş lizatı besin açısından zenginleştirilmiş bir agar plakasına sürün.
Kuluçka sırasında bakteriler büyür ve görünür koloniler oluşturur.
Canlı bakteri sayısını temsil eden koloni oluşturan birimleri veya CFU'ları belirlemek için kolonileri sayın.
OMV ile tedavi edilen ve tedavi edilmeyen makrofajlar arasındaki CFU sayımlarını karşılaştırın.
OMV ile tedavi edilen makrofajlara kıyasla daha yüksek bir CFU, OMV'lerin makrofajlar içinde Lejyonella sağkalımını kolaylaştırdığını gösterir.
Önceden işlenmiş veya işlenmemiş THP-1 hücrelerini, hücrelerden ortamı değiştirmeden, vahşi tip L.pneumophila suşu, çekirdek B veya murin BMDM hücreleri ile bu suşun flagella içermeyen bir mutantı ile enfekte etmek.
Bakterileri 0.5'lik bir MOI'ye ekleyin, bu da kuyucuk başına 10 ila beşinci L.pneumophila'ya eşittir. Kültürleri sırasıyla 24 ve 48 saat inkübe edin. Hücreleri parçalamak için,% 0.1'lik bir son konsantrasyonda saponin ekleyin ve hücreleri beş dakika inkübe edin.
Daha sonra BCYE agar plakalarına gerekli seyreltmelerden 50 mikrolitre çizgi ve plakaları üç gün inkübe edin.
Oluşan kolonileri gözle görsel olarak sayın ve metin protokolüne göre hesaplamalar yapın.