JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:12 dk • August 29th, 2025
Kalın bir peptidoglikan hücre duvarına sahip bir bakteri olan Staphylococcus aureus'un bir kültürünü alın.
Kültürü antibiyotik içeren taze ortamda seyreltin ve bakteri üremesini teşvik etmek için çalkalayarak ılık bir sıcaklıkta inkübe edin.
Kültürü bir tüpe aktarın ve bakterileri peletlemek için santrifüjleyin.
Süpernatanı atın ve bakterileri hasardan korumak için peleti buzun üzerine yerleştirin.
Peleti lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve silika boncukları içeren bir tüpe aktarın.
Tüpü mekanik bir hücre lizis cihazına yerleştirin ve çalkalamayı başlatın.
Bakteriler ve boncuklar arasındaki hızlı çarpışmalar, kesme kuvvetleri oluşturur. Bu, bakterileri parçalayarak DNA, RNA ve RNA-protein komplekslerini serbest bırakır.
Lizis tamponundaki iyonlar RNA yapılarını stabilize ederken, tampondaki indirgeyici ajanlar RNA'yı parçalayan enzimleri etkisiz hale getirir.
Şimdi, kalıntıları peletlemek için karışımı tekrar santrifüjleyin.
Daha fazla analiz için nükleik asitler ve proteinler içeren süpernatanı toplayın.
Üç mililitre BHI ortamında pCN51 P3 MS2 sRNA veya pCN51 P3 MS2 plazmitlerini taşıyan bir suş kolonisini büyütün, kopyalar halinde mikrolitre eritromisin başına 10 mikrogram ile desteklenmiştir.
Her gece kültürünü, 0.05'lik bir OD 600'e ulaşmak için eritromisin ile takviye edilmiş 50 mililitre taze BHI ortamında seyreltin. Kültürleri altı saat boyunca 180 RPM'de çalkalayarak 37 santigrat derecede büyütün. Her kültürü 50 mililitrelik bir santrifüj tüpüne aktarın ve tüpleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 2.900 kez G'de santrifüjleyin, daha sonra süpernatanı atın, dondurun ve eksi 80 santigrat derecede saklayın veya peletleri buz üzerinde tutun ve doğrudan mekanik hücre lizizi gerçekleştirin.
Mekanik hücre lizizini gerçekleştirmek için, peletleri beş mililitre tampon A'da yeniden süspanse edin ve yeniden süspanse edilmiş hücreleri 3.5 gram silika boncuklu 15 mililitrelik santrifüj tüplerine aktarın. Tüpleri mekanik bir hücre lizis cihazına yerleştirin ve saniyede dört metrede 40 saniyelik bir döngü çalıştırın. Tüpleri 15 dakika boyunca 2.900 kez G'de santrifüjleyin, ardından süpernatanı geri kazanın ve buz üzerinde tutun.
Süpernatantın berrak olduğundan emin olun, değilse santrifüjlemeyi tekrarlayın.