Küçük Düzenleyici RNA'ya Bağlı Bakteriyel Hedef RNA'nın Afinite Saflaştırması Kullanılarak İzolasyonu

JoVE Encyclopedia of Experiments

Mikrobiyoloji

0 görüntüleme • 2:30 dk • August 29th, 2025

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hedef RNA'sına bağlı MS2 etiketli sRNA da dahil olmak üzere hücresel bileşenler içeren bir bakteri hücresi lizatı alın.

MS2 etiketli sRNA, MS2 viral kaplama proteini için yüksek afinite sergileyen, 5' ucunda bir MS2 aptamer kök halkası taşıyan, tasarlanmış küçük bir düzenleyici RNA'dır.

Bakteriyel lizatı, maltoz bağlayıcı protein (MBP) ve MS2 kaplama proteininden oluşan füzyon proteinlerine bağlı amiloz reçinesi içeren önceden dengelenmiş bir afinite kromatografi kolonuna aktarın.

İmmobilize MS2 kaplama proteini, MS2 etiketli sRNA'nın aptamer kök halkasını spesifik olarak yakalar ve bozulmamış hedef RNA'ya bağlı sRNA'yı korur.

Bağlanmamış kalan etiketlenmemiş moleküller akışta toplanır.

Artık bağlanmamış molekülleri çıkarmak için sütunu tamponla yıkayın.

MBP'yi reçineden uzaklaştıran ve hedef RNA'sına bağlı MS2 etiketli sRNA'yı serbest bırakan maltoz içeren bir tamponla elute edin.

Aşağı akış analizi için RNA bütünlüğünü korumak için fraksiyonları buz üzerinde toplayın ve saklayın.

Kolon ucunu çıkarın, ardından bir kolon rafına bir kromatografi kolonunu koyun ve kolonu ultra saf suyla yıkayın. 300 mikrolitre amiloz reçinesi ekleyin ve sütunu 10 mililitre tampon A ile yıkayın. 1.200 pikamol MBP-MS2 proteinini altı mililitre tampon A içinde seyreltin ve sütuna yükleyin.

Sütunu 10 mililitre tampon A ile yıkayın. Ardından, MS2 afinite saflaştırması gerçekleştirin. Hücre lizatını kolona yükleyin ve akış fraksiyonunu temiz bir toplama tüpünde toplayın. Kolonu 10 mililitre tampon A ile üç kez yıkayın ve yıkama fraksiyonunu toplayın, ardından kolonu bir mililitre tampon E ile elüte edin ve elüsyon fraksiyonunu iki mililitrelik bir mikrotüpte toplayın.

Toplanan tüm fraksiyonları RNA ekstraksiyonuna kadar buz üzerinde tutun.

08:12

Tek adım arıtma RNA bağlı Biotin ve fotoğraf yarilabilir bir bağlayıcı kullanarak makromoleküllerin kompleksleri

İlgili videolar

0 Görüntüler

06:29

Primer ve Kültürlü Hücrelerden Sitoplazmik ve Nükleer Uzun RNA'ların Hazırlanması

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:19

Hızlı Protein Sıvı Kromatografi Sistemi Kullanılarak 6X His Etiketli Bir Proteinin Afinite Saflaştırılması

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:19

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

05:07

Afinite Ekstraksiyonu Yoluyla RNA Bağlayıcı Proteinleri İzole Etmek için RNA-Protein Pull-Down Testi

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:53

Oligonükleotid yönelik elüsyon kullanılarak Hücreler Aynı Kökenli RNA-protein kompleksleri izolasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:19

Rapid Metodoloji tarafından Roman RNA Bağlayıcı Proteinler İzolasyon

İlgili videolar

0 Görüntüler

11:11

Desthiobiotin-Streptavidin-benzeşme arıtma mezotelyoma hücrelerdeki RNA etkileşim proteinlerin aracılı

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:45

Ökaryotik mRNA-Protein kompleksleri kurtarmak için bir Tandem oligonükleotid tabanlı RNA izolasyon yordamı

İlgili videolar

0 Görüntüler

07:02

Bakterilerde protein RNA bağlayıcı ölçümü için bir tahlil

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 15 Ağustos 2026