Küçük Düzenleyici RNA'ya Bağlı Bakteriyel Hedef RNA'nın Afinite Saflaştırması Kullanılarak İzolasyonu

Hedef RNA'sına bağlı MS2 etiketli sRNA da dahil olmak üzere hücresel bileşenler içeren bir bakteri hücresi lizatı alın.

MS2 etiketli sRNA, MS2 viral kaplama proteini için yüksek afinite sergileyen, 5' ucunda bir MS2 aptamer kök halkası taşıyan, tasarlanmış küçük bir düzenleyici RNA'dır.

Bakteriyel lizatı, maltoz bağlayıcı protein (MBP) ve MS2 kaplama proteininden oluşan füzyon proteinlerine bağlı amiloz reçinesi içeren önceden dengelenmiş bir afinite kromatografi kolonuna aktarın.

İmmobilize MS2 kaplama proteini, MS2 etiketli sRNA'nın aptamer kök halkasını spesifik olarak yakalar ve bozulmamış hedef RNA'ya bağlı sRNA'yı korur.

Bağlanmamış kalan etiketlenmemiş moleküller akışta toplanır.

Artık bağlanmamış molekülleri çıkarmak için sütunu tamponla yıkayın.

MBP'yi reçineden uzaklaştıran ve hedef RNA'sına bağlı MS2 etiketli sRNA'yı serbest bırakan maltoz içeren bir tamponla elute edin.

Aşağı akış analizi için RNA bütünlüğünü korumak için fraksiyonları buz üzerinde toplayın ve saklayın.

Kolon ucunu çıkarın, ardından bir kolon rafına bir kromatografi kolonunu koyun ve kolonu ultra saf suyla yıkayın. 300 mikrolitre amiloz reçinesi ekleyin ve sütunu 10 mililitre tampon A ile yıkayın. 1.200 pikamol MBP-MS2 proteinini altı mililitre tampon A içinde seyreltin ve sütuna yükleyin.

Sütunu 10 mililitre tampon A ile yıkayın. Ardından, MS2 afinite saflaştırması gerçekleştirin. Hücre lizatını kolona yükleyin ve akış fraksiyonunu temiz bir toplama tüpünde toplayın. Kolonu 10 mililitre tampon A ile üç kez yıkayın ve yıkama fraksiyonunu toplayın, ardından kolonu bir mililitre tampon E ile elüte edin ve elüsyon fraksiyonunu iki mililitrelik bir mikrotüpte toplayın.

Toplanan tüm fraksiyonları RNA ekstraksiyonuna kadar buz üzerinde tutun.