Gram Pozitif Bakterilerin Antibiyotik Duyarlılık Testi İçin Bir Et Suyu Mikrodilüsyon Yöntemi

Gram pozitif bakteri kolonilerini bir kültür plakasından izole edin ve bunları bir ortamda askıya alın.

Test için en uygun bakteri konsantrasyonunu elde etmek için süspansiyonu seyreltin.

Artan konsantrasyonlarda bir lipoglikopeptit antibiyotik içeren bir mikroplakanın test kuyularını ve sadece ortamı içeren bir büyüme kontrol kuyusunu aşılayın.

Kültür saflığını ve bakteri sayımını doğrulamak için kontrol kuyusundan kültür plakalarına bir alikot yayın.

Hücre duvarının sentezlendiği bakteri üremesine izin vermek için inkübe edin.

Antibiyotik, bir hücre duvarı bileşeni olan peptidoglikana ve öncüllerine bağlanarak polimerizasyonu inhibe eder ve duvarı zayıflatır.

Bozulma, ozmotik basıncın hücre lizizine neden olmasına izin verir.

İnkübasyondan sonra, kültür saflığını ve optimal bakteri sayısını onaylayın.

Kuyuları bakteri üremesi açısından inceleyin.

Kontrol kuyusu gözle görülür büyüme gösterirken, büyümeyi tamamen engelleyen en düşük antibiyotik konsantrasyonuna sahip test kuyusu minimum inhibitör konsantrasyonu (MIC) gösterir.

Bu gösteride, taze hazırlanmış bir tabak aşılanacaktır. Aşılamayı hazırlamak için, 18 ila 24 saatlik bir kanlı agar veya diğer seçici olmayan agar plakasından iyi izole edilmiş birkaç koloni seçin. Burada kalite kontrol S. aureus ve E. faecalis suşları kullanılmaktadır.

Her koloninin üst kısmına steril bir çubukla dokunun ve bir kısmını bir ila beş mililitre CAMHB veya salin içeren bir tüpe aktarın. Bulanıklık, hazırlandıktan sonraki 15 ila 30 dakika içinde 0,5 McFarland standardıyla eşleşene kadar aktarmaya devam edin, mililitre başına beş kez 10 ila beşinci CFU'luk bir nihai konsantrasyona ulaşmak için aşılamayı CAMHB'de bir ila 100 oranında seyreltin. Kabul edilebilir aralık, mililitre başına iki ila sekiz kez 10 ila beşinci CFU'dur.

Hemen steril uçlu çok kanallı bir pipet kullanarak, 50 mikrolitre son aşılamayı MIC panel plakasının her bir uygun kuyucuğuna aktarın. Burada, iki izolatın her biri ile izolat başına toplam dört kopya için dört sıra aşılanır. Daha sonra, bir saflık kontrolü yapmak için, pozitif büyüme kontrolündeki çözeltinin bir ila 10 mikrolitresini% 5 koyun kanı içeren triptikaz soya agar gibi seçici olmayan bir agar'a aktarmak için bir pipet kullanın.

Çözeltiyi plakanın yüzeyine yaymak için steril bir halka kullanın. Plakayı 90 derece çevirin ve aşının eşit şekilde dağıldığından emin olmak için tekrar çizin. Plakayı örtün ve bir kenara koyun.

Bir koloni sayımına hazırlanırken, büyüme kontrol kuyusundaki 10 mikrolitre çözeltiyi 10 mililitre salin karışımına aktarmak için tek kanallı bir pipet kullanın ve ardından 100 mikrolitreyi, steril bir halka kullanarak% 5 koyun kanı içeren triptikaz soya agar gibi seçici olmayan uygun bir agar ortamına aktarın, çözeltiyi tüm agar yüzeyine yayın. Aşının eşit dağılımını sağlamak için bu işlemi farklı yönlerde iki kez tekrarlayın. Ardından, üst panelin bir kapakla sıkıca kapatıldığından emin olarak plastik bir kapta dört adede kadar MIC panelini istifleyin.

Ardından plastik kabın içine nemli bir kağıt havlu yerleştirin ve aşılamadan sonraki 30 dakika içinde kapakla güvenli bir şekilde kapatın. MIC panellerini, koloni sayım plakasını ve saflık kontrol plakasını bir ortam havası inkübatöründe 35 artı veya eksi iki santigrat derecede 16 ila 20 saat inkübe edin. Ertesi gün, çıplak gözle tespit edilen kuyucuklarda bakteri üremesini tamamen engelleyen en düşük konsantrasyon olarak minimum inhibitör konsantrasyonu okuyun.

Koloni sayım plakasındaki koloni sayısını belirleyin. Sayılan sayıyı seyreltme faktörü ile çarpın. Örneğin, 50 koloni çarpı 10.000'lik bir seyreltme faktörü, mililitre başına beş çarpı 10 ila beşinci CFU'ya eşittir.

Kabul edilebilir bir aralık 20 ila 80 kolonidir, bu da ml başına birimler oluşturan iki ila sekiz çarpı 10 ila beşinci koloniye eşittir. İnokulum konsantrasyonu, doğru sonuçlar elde etmek için duyarlılık testini kontrol etmek için önemli bir değişkendir. Son olarak, saflık plakasını kontrol edin.

Tüm koloniler inokulum olarak kullanılan kolonilere benziyorsa, o zaman saf olarak kabul edilebilir. Başka koloniler varsa, MIC panelinde bir kirletici madde bulunma potansiyeli vardır ve test tekrarlanmalıdır.