Mycobacterium tuberculosis'in Demir Sınırlı Koşullar Altında Kültürlenmesi

Besin açısından zengin bir ortamda yetiştirilen Mycobacterium tuberculosis kolonilerini içeren bir agar plakası ile başlayın.

Tek bir koloniyi besin takviyeli bir et suyuna aşılayın ve düzgün büyüme için çalkalama ile inkübe edin.

Kültürün, hücrelerin metabolik olarak aktif olduğu geç logaritmik faza ulaşmasına izin verin.

Zenginleştirilmiş bir agar plakasına küçük bir hacim pipetleyin, eşit şekilde yayın ve sürekli bir bakteri tabakası oluşana kadar inkübe edin.

Steril bir çubuğu düşük demirli minimal bir ortamla (LIMM) nemlendirin ve bakterileri toplayın.

Demir kontaminasyonunu önlemek için bunları LIMM içeren plastik bir kapta askıya alın.

Topaklanmayı önlemek için bir dispersiyon maddesi ekleyin ve çalkalamadan inkübe edin.

Demir sınırlayıcı koşullar altında, bakteriler stres tepkilerini aktive eder ve sitoplazmada sideroforlar üretir.

Bunlar hücre dışı veziküller halinde paketlenir ve çevreye salınır.

Sideroforlar demiri yakalar ve bakterilerin hayatta kalmasına yardımcı olur.

Bu sistem, mikobakteriyel adaptasyonu ve demirle sınırlı koşullar altında hayatta kalmayı vurgular

ADN zenginleştirmesi ile desteklenmiş iki mililitre mikobakteriyel et suyu ortamında tek bir MTB kolonisini aşılayın. 37 santigrat derecede çalkalayarak inkübe edin. Görünür bir büyüme olduğunda, kültürün iki mililitresini çıkarın ve OD 540'ı bir spektrofotometrede ölçün.

OD 540, geç logaritmik fazı gösteren 0.8'e ulaştığında inkübasyonu durdurun. 200 mikrolitre geç logaritmik kültürü, 0.2 gliserol,% 0.5 Tween 80 ve ADN ile desteklenmiş mikobakteriyel agar plakalarına yayın. En az beş plaka aşılayın.

Plakaları 37 santigrat derecede inkübe edin. Ve bir hafta sonra, bakteri üremesi birleşik bir tabaka olarak görülebilir. Ardından steril bir pamuklu çubuğu düşük demirli minimum ortamda ıslatın.

Agar plakalarından bakteri toplamak için bu çubuğu kullanın. Bakterileri bir tüpte 100 mililitre düşük demir minimal ortama aşılayın. OD 540 ile bir süspansiyon hazırlamak için yeterli bakteri toplayın.

Süspansiyonu düşük demir, minimum orta ile 10 kez bir litreye seyreltin ve iki steril plastik şişeye bölün. Daha sonra, iki mililitre kültürü beş mililitrelik bir kültür tüpüne aktarın. Hacimce hacimce 10 mikrolitre %10 tiloksapol ekleyin.

Kültürleri 14 gün boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.