Mycobacterium tuberculosis'ten Siderofor İçeren Hücre Dışı Veziküllerin İzolasyonu

JoVE Encyclopedia of Experiments

Mikrobiyoloji

0 görüntüleme • 3:46 dk • September 26th, 2025

Bir demir şelatörü olan sideroforlar içeren hücre dışı veziküllerin salgılanmasını arttırmak için demir sınırlayıcı bir ortamda yetiştirilen bir Mycobacterium tuberculosis kültürü alın.

Bakterileri peletlemek için santrifüj.

Süpernatanı toplayın ve artık bakterileri uzaklaştırmak için filtreleyin.

Süzüntüyü karıştırılmış bir ultrafiltrasyon sistemine aktarın ve fazla ortamı çıkarmak ve EV'leri konsantre etmek için filtreleyin.

Konsantreyi hücresel kalıntıları peletlemek için santrifüjleyin.

EV peletini toplamak için süpernatanı bir ultrasantrifüj tüpüne ve santrifüje aktarın.

Süpernatanı atın, peleti bir tamponda yeniden süspanse edin ve alt tabakayı oluşturmak için konsantre bir yoğunluk gradyan ortamıyla karıştırın.

Süreksiz bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için gradyan ortamının azalan konsantrasyonları ile bindirin.

Üste tampon ekleyin ve santrifüjleyin. EV'ler, kaldırma yoğunluklarına uyan katmana göç eder.

Her kesri ayrı bir tüpte toplayın.

Siderofor içeren EV'lerle saflaştırılmış fraksiyon, sonraki çalışmalar için hazırdır.

Kültürü beş adet 225 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve 20 santigrat derecede yedi dakika boyunca 2.850 kez g'da santrifüjleyin. Kültür süpernatanını 50 mililitrelik bir pipetle toplayın ve 0,22 mikronluk bir filtreden geçirerek filtreleyin.

MEV'leri izole etmek için, kültür filtratını dört santigrat dereceye yerleştirilmiş karıştırılmış bir hücre ultrafiltrasyon sistemine aktarın ve konsantreyi 100 kilodaltonluk bir kesme membranından 50 PSI'den daha düşük bir basınçta filtreleyin. Daha sonra konsantre kültür süzüntüsünü dört santigrat derecede 15 dakika boyunca 15.000 kez g'da santrifüjleyin ve süpernatanı polikarbonat ultrasantrifüj tüplerinde toplayın. Süpernatanı dört santigrat derecede iki saat boyunca 100.000 kez g'da santrifüjleyin.

Bundan sonra, süpernatanı çıkarın ve membranöz peletleri hafif pipetleme ile toplam bir mililitre steril PBS'de yeniden süspanse edin. 0,5 mililitre pelet süspansiyonunu, polipropilen ince duvarlı bir ultrasantrifüj tüpünün dibinde 1,5 mililitre% 60 iyodiksanol çözeltisi ile karıştırın. Bu MEV iyodiksanol %45 süspansiyonunu, bir mililitre %40, %35, %30, %25 ve %20 iyodiksanol çözeltileri ve üstte bir mililitre PBS ile kaplayın.

Dört santigrat derecede 18 saat boyunca 100.000 kez g'da santrifüjleyin. Ardından, üstten başlayarak bir mililitre yoğunluk gradyan fraksiyonlarını toplamak için bir mililitrelik bir Hamilton şırıngası kullanın. Toplanan her fraksiyonu PBS ile 20 mililitreye seyreltin ve dört santigrat derecede iki saat boyunca 100.000 kez g'da santrifüjleyin.

Süpernatanı çıkarın ve 0,5 mililitre PBS'de yeniden süspanse edin.

00:07

Yüksek Verim Ekstrasellüler Vezikül Preparatlarının Virüsten Uzaklaştırılması

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:46

Hücre Dışı Vezikülleri Şartlandırılmış Hücre Kültürü Ortamından Ayırmak için Boyut Dışlama Kromatografisi

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:34

Kemik İliği Kaynaklı Makrofajlardan Küçük Hücre Dışı Veziküllerin Peptitlerinin Tanımlanması

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:06

Mycobacterium tuberculosis'in Demir Sınırlı Koşullar Altında Kültürlenmesi

İlgili videolar

0 Görüntüler

03:37

Isolation of Phagosomes Containing Magnetic Bead-Tagged Bacteria from Infected Macrophages

İlgili videolar

0 Görüntüler

02:49

Bakteri Kültürü Bir Ultrafiltrasyon Cihazı Kullanarak Protein Konsantrasyonunu Süzün.

İlgili videolar

0 Görüntüler

04:38

Mikobakteriyel hücre dışı vezikülleri saflaştırmak için bir boyut dışlama kromatografisi tekniği

İlgili videolar

0 Görüntüler

10:33

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

İlgili videolar

0 Görüntüler

08:27

Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu

İlgili videolar

0 Görüntüler

09:34

Mycobacterium tuberculosis Boyut Dışlama Kromatografisi ile Hücre Dışı Vezikül Zenginleştirme

İlgili videolar

0 Görüntüler

Son güncelleme: 29 Ağustos 2026