$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Tanımlanmış boyutta gözenekli reçine boncukları ile paketlenmiş bir boyut dışlama kromatografisi veya SEC kolonu alın. Üstte bir numune rezervuarı bulunur.
Kolon boncuklarını dengelemek için fosfat tamponlu salin veya PBS ekleyin ve akışı atın.
Hücre dışı veziküller veya EV'ler, salgılanan proteinler ve kirletici maddeler içeren konsantre bir bakteri kültürü filtratı yükleyin.
EV'ler, biyoaktif moleküller taşıyan ve bakteriler tarafından salgılanan lipid bazlı nanoveziküllerdir.
Süzüntü boncuklara girdiğinde, reçine yatağından geçirmek için PBS ekleyin.
Büyük veziküler olmayan kirleticiler içeren ilk elüatı atın.
Çıkışın altına bir toplama tüpü yerleştirin ve sırayla PBS ekleyin.
Büyük boyutlu EV'ler daha küçük reçine gözeneklerinden kaçar, boncuklar arasındaki parçacıklar arası boşluklardan geçer ve önce ayrıştırılır.
Daha küçük proteinler ve kirleticiler gözeneklere girer, daha uzun yollar izler ve daha sonra ayrışır.
EV'leri içeren erken salınımlı fraksiyonları toplayın ve analiz için saklayın.
EV'lerin izolasyonu için, 100 mililitreden daha az başlangıç malzemesi için 10 mililitre yatak hacmine sahip küçük bir kolon ve 100 mililitreden fazla başlangıç malzemesi için 47 mililitre yatak hacmine sahip daha büyük bir kolon kullanarak boyut dışlama kromatografisi veya SEC gerçekleştirin. Deneyden birkaç saat önce, SEC kolonunu ve PBS'yi oda sıcaklığına getirin, ardından standart bir laboratuvar standı ve tutucu kullanarak kolonu dikey konumda stabilize edin. SEC kolonuna bağlamadan önce, beş mililitre PBS'nin fritten bir atık kabına akmasına izin vererek numune rezervuarını nemlendirin.
Ardından, numune haznesine iki mililitre PBS eklemek için kolonun giriş kapağını sökün ve PBS fritten damlarken rezervuarı kolona dikkatlice bağlayın. Kolonun dengelenmesi için, numune rezervuarına 47 mililitre PBS ekleyin ve ardından SEC kolonunun alt kısmını açın. Ardından, yüklenen tüm numune tamponunun kolondan akmasına izin verin ve akışı atın.
İki mililitre numuneyi numune haznesine yükledikten sonra, numunenin kolona tamamen girmesine izin verin ve akışı toplayın. Çözeltinin kolondan akmasına izin vermek için numune rezervuarına 14.25 mililitre eksi numune hacmi hacminde hemen PBS ekleyin ve kolon boşluk hacmine eşit miktarı atın. Daha sonra, iki mililitre PBS'nin kolondan geçmesine izin verdikten sonra ilk akışı veya birinci fraksiyonu toplamak için SEC kolonunun hemen altına iki mililitrelik düşük bağlayıcı bir mikrotüp yerleştirin.
Sonraki her fraksiyonu toplamak için numune rezervuarına iki mililitre PBS eklemeye devam edin. Toplanan fraksiyonları kısa süreli depolama için dört santigrat derecede veya uzun süreli depolama için eksi 80 santigrat derecede saklayın.