JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:05 dk. • September 26th, 2025
Ovoalbümin peptidine veya OVAp'ye özgü reseptörleri eksprese eden CD4+ T hücrelerini içeren kuyucuklarla başlayın.
Negatif kontrol kuyusuna gözenekli bir membran eki yerleştirin.
Bir tüpte, bakterilerle enfekte olmuş ve yüzey sunumu için OVAp yüklü dendritik hücreleri alın.
Dendritik hücreleri doğrudan test kuyusuna ve negatif kontrol kuyusundaki ek parçaya ekleyin.
Kuyucuklara ortam ekleyin ve inkübe edin.
Test kuyusunda hücreler, transenfeksiyon olarak bilinen bir süreç olan dendritik hücreden T hücresine bakteri transferini kolaylaştıran immünolojik bir sinaps oluşturmak üzere etkileşime girer.
Negatif kontrol kuyusunda, membran bariyeri hücre-hücre etkileşimini önler, böylece transenfeksiyonu inhibe eder.
Antibiyotik gentamisin'i kuyucuklara ekleyin ve inkübe edin.
Gentamisin ökaryotik hücrelere nüfuz edemez, böylece içselleştirilmiş bakteriler hayatta kalırken sadece içselleştirilmemiş bakterileri öldürür.
Enfekte T hücrelerini içeren test numunesi ve enfekte olmamış T hücrelerine sahip kontrol numunesi artık T hücresi izolasyonu ve transenfeksiyon ölçümü için hazırdır.
24 oyuklu bir kültür plakasına, beş kuyucuğun her birine 0,5 mililitre hacimde iki milyon CD4+ T hücresi ekleyin.
Daha sonra, fiziksel teması kontrol etmek için, üçüncü ve dördüncü kuyucuklara üç mikrometre gözenek boyutuna sahip polikarbonat trans kuyu bariyerleri yerleştirin. İlk kuyuya, enfekte olmuş aşırı yüklenmiş dendritik hücrelerden 0.1 mililitre ekleyin. İkinci kuyucuğa, enfekte olmuş yüksüz dendritik hücrelerin 0.1 mililitresini ekleyin.
Bir kuyucuğa 0.1 mililitre enfekte aşırı yüklenmiş dendritik hücre ve diğer kuyucuğa 0.1 mililitre enfekte yüksüz dendritik hücre ekleyin. Son olarak, negatif bir kontrol olarak, 10'luk bir MOI'de CD4+ T hücrelerinin beşinci kuyucuğuna doğrudan enfekte edin. Ardından, kuyunun toplam hacmini RPMI ile 0,6 mililitreye getirin.
Bağışıklık sinapslarının oluşmasına izin vermek için plakayı 30 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, her bir kuyucuğa mililitre ortam başına 100 mikrogram Gentamisin ekleyin ve bir saat inkübe edin. Gentamisin, ökaryotik hücrelere nüfuz edemeyen bir aminoglikozit antibiyotiktir.
Bu nedenle, bu adımda aminoglikozit hücre dışı bakterileri öldürür, ancak hücre içi bakterileri öldürmez.