Zebra Balığı Embriyoları Kullanılarak İmplantla İlişkili Bakteriyel Enfeksiyonların İn Vivo Analizi

Oluklarla kalıplanmış bir agaroz odası içeren bir tabakla başlayın.

Her oluk, anestezik bir madde ile desteklenmiş bir embriyo ortamına batırılmış anestezi uygulanmış zebra balığı embriyolarını tutar.

Işık mikroskobu altında, kas dokusuna bir mikroenjeksiyon iğnesi sokun.

İmplantla ilişkili bir enfeksiyonu modellemek için S. aureus ve polistiren mikroküreler içeren bir süspansiyon enjekte edin.

Enjekte edilen embriyoları, taze bir ortamla doldurulmuş çok oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın ve inkübe edin.

Mikroküreler, bakteri kolonizasyonunu destekleyen ve enfeksiyonu teşvik eden fiziksel bir yüzey sunar.

İmplantla ilişkili bakteriyel enfeksiyonu değerlendirmek için her embriyoyu ayrı bir tüpe aktarın ve bir tamponla yıkayın. Tampon ve seramik boncuklar ekleyin.

Embriyoları parçalamak ve bakteriler de dahil olmak üzere iç içerikleri serbest bırakmak için homojenize edin.

Seyreltilmiş homojenatları plakalayın, ardından koloni oluşumuna izin vermek için inkübe edin.

Mikroküre-bakteri süspansiyonu enjekte edilen embriyolar, tek başına bakteri süspansiyonu enjekte edilenlerden daha yüksek koloni sayıları gösterir. Bu, mikrokürelerin enfeksiyona yatkınlığı artırdığını gösterir.

Embriyoların uyuşturulması için beş dakika bekledikten sonra, embriyoları enjeksiyonları için oluklar içinde tek bir yönde hizalayın. Mikroenjektörü uygun enjeksiyon ayarlarına getirin ve iğneyi stereo mikroskop altında 45 ila 60 derecelik bir açıyla ilk embriyonun kas dokusuna yerleştirin.

Doku içindeki konumu gerektiği gibi ayarlamak için iğneyi yavaşça ileri geri hareket ettirin ve yüklü süspansiyonu enjekte etmek için mikro enjektör ayak pedalını kullanın. Zebra balığı embriyolarının dokusuna bir bakteri mikroküre süspansiyonu enjekte ederken, iğne nazikçe ancak sabit bir el ile yerleştirilmelidir. Başarılı bir yerleştirmeden sonra, enjeksiyondan önce malzemeler için bir boşluk oluşturulmalıdır.

Ve embriyoları, günlük ortam değişiklikleri ile 48 oyuklu plakaların ayrı kuyucuklarında trikain içermeyen E3 ortamında tutun. Koloni oluşturan birim ölçümü ile enfeksiyonun ilerlemesini izlemek için, enjeksiyondan kısa bir süre sonra beş ila altı canlı enfekte embriyoyu ayrı ayrı iki mililitrelik mikrotüplere rastgele aktarın ve embriyoları steril PBS ile nazikçe yıkayın. Yıkamaları attıktan sonra, her tüpe 100 mikrolitre steril PBS ve ardından iki ila üç steril iki milimetre çapında zirkonya boncuk ekleyin.

Daha sonra embriyoları 3.500 rpm'de 30 saniye boyunca bir homojenizatörde ezin ve homojenatı gösterildiği gibi kültürleyin.