JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:30 dk • September 26th, 2025
Metabolik olarak aktif bir Mycobacterium marinum kültürü alın.Bu, yüksek bakteri canlılığı ve optimal fizyolojik durum sağlar.
Bakterileri peletlemek için kültürü santrifüjleyin.
Fazla süpernatanı atın ve peleti bir dispersiyon maddesi içeren taze ortamda yeniden süspanse edin.
Süspansiyonu mikrosantrifüj tüplerine aktarın ve kontrollü koşullar altında sonikasyon yapın.
Sonikasyon, bakteri agregatlarını bozar ve hücreleri dağıtır, bu da canlı bir tek hücreli süspansiyon ile sonuçlanır.
Sonikasyonlu süspansiyonu bir şırıngada toplayın ve kalan kümeleri çıkarmak için bir membran filtreden geçirerek tek tip bir tek hücreli popülasyon sağlayın.
Bir spektrofotometre kullanarak bakteri süspansiyonunun optik yoğunluğunu ölçün.
Hücre canlılığını korurken istenen bakteri konsantrasyonuna ulaşmak için süspansiyonu taze kriyoprotektan içeren ortamla seyreltin.
Son tek hücreli süspansiyonu ayırın ve ultra düşük sıcaklıklarda saklayın. Kriyoprotektan uzun süreli depolama sırasında bakteri canlılığının korunmasına yardımcı olur.
El yazmasına göre aşılamadan sonra, Mycobacterium marinum'u bir pelet olarak toplamak için kültürü 3000 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatantın 300 mikrolitresi hariç hepsini atın ve peleti yeniden süspanse edin.
Peleti daha fazla yeniden süspanse etmek için% 10 gliserol içeren üç mililitre 7H9 ortamı ekleyin ve daha sonra süspansiyonu 100 watt'lık bir su banyosunda, 15 saniye açık ve 15 saniye kapalı, toplam iki dakika boyunca sonikasyona tabi tutun. Bakteri süspansiyonunu 10 mililitrelik bir şırıngaya aktarın ve bakteri kümelerini çıkarmak için beş mikronluk bir filtreden geçirin. Bir spektrofotometre kullanarak, süspansiyonun optik yoğunluğunu ölçün ve %10 gliserol içeren 7H9 ortamıyla OD 600'e bir seferde seyreltin.
Süspansiyonu 10 mikrolitrelik parçalara bölün ve daha sonra kullanmak üzere eksi 80 santigrat derece dondurucuda saklayın.